CN109182264A

CN109182264A - 制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用

Info

Publication number: CN109182264A
Application number: CN201811128355.3A
Authority: CN
Inventors: 魏色东
Original assignee: Shenzhen Qiaoshui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Qiaoshui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2019-01-11

Abstract

本发明公开一种制备人脂肪干细胞培养液的方法及其应用，包括以下步骤：使用胰酶和胶原酶联合消化人源脂肪组织，待溶液分为三层，取下层，制得脂肪干细胞沉淀液；加入L‑DMEM完全培养基中终止消化并进行原代培养；对原代脂肪干细胞进行传代培养，该过程中提供O₂分压为1～5％、CO₂分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm²的紫外线照射，并加入1×10^‑7mol/L胰岛素，获得脂肪干细胞培养物；将脂肪干细胞培养物液离心，过滤，除去脂肪干细胞，得到滤液即为所述脂肪干细胞培养液。通过该培养方法可促进脂肪干细胞旁分泌，得到的脂肪干细胞培养液中含有多种旁分泌组分，且含量非常高。该脂肪干细胞培养液可作为活性物质，添加到护肤美容产品中，使得护肤美容品具有美白、祛疤、抗皱等功效。

Description

制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用

技术领域

本发明涉及干细胞技术应用，具体地，涉及制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用。

背景技术

脂肪干细胞是从脂肪组织中获得的间充质干细胞，自2001年首次从脂肪组织中分离、提取出脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)并命名以来，ADSCs因来源广泛、取材方便、组织损伤小、扩增迅速等优点已成为细胞治疗和组织工程应用中的理想工具。众多研究发现，ADSCs在体内损伤修复、抗衰老等方面均可发挥较为显著的作用；其生物学作用的实现一部分通过多向分化能力，ADSCs可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱等多种细胞，补充替代老化、缺损的组织细胞；另一部分通过旁分泌功能，ADSCs可合成及分泌多种细胞因子、多肽类、气体分子等活性成分，提高受损细胞的生命力和抗凋亡能力。

干细胞促进组织再生的机制包括分化和旁分泌两方面的作用。分化机制认为，幼稚的干细胞迁移到损伤部位，分化为与受区细胞相似表型的细胞，通过移植替代修复受损组织；旁分泌机制认为，干细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子影响受区多种细胞的存活、增殖、迁移和基因表达，而且作用效果有组织特异性。目前的研究认为，由于干细胞移植后成活率较低，干细胞通过分化发挥替代修复的作用有限。数天甚至数小时内短暂而明显的抗炎和促进增殖作用，很难用干细胞的分化修复来解释。此外，无细胞条件培养基具有改善受损组织功能的作用，同样也支持干细胞的旁分泌机制。大量研究表明，相比组织构建，干细胞通过复杂的旁分泌功能促进组织再生的作用可能更为关键。

ADSCs分泌的生物活性因子种类繁多。在体外培养脂肪干细胞的过程中，该细胞会将上述具有生物活性因子分泌到培养基中，形成脂肪干细胞条件培养基(Adipose-derivedstem cells conditioned medium，ADSC-CM)。 ADSC-CM中含有VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF和KGF等多种活性成分。在ADSC-CM中还检测到多种抗氧化物质，包括IGF、IL-6、超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2，SOD2)和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，对机体多种组织器官有抗氧化保护作用。例如，IGF 可以保护成纤维细胞和肠上皮细胞免受自由基损伤；HGF保护视网膜色素上皮免受由于谷胱甘肽减少造成的氧化损伤；白介素-6(Interleukin-6，IL-6) 可以减少过氧化氢造成的细胞死亡。因此，目前研究认为，ADSCs主要通过旁分泌的作用方式，分泌大量活性细胞因子，从而产生抗组织老化的作用。

紫外线照射引起的光老化是导致皮肤衰老的最主要外因。研究表明， ADSCs所分泌的胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、白细胞介素1和肿瘤坏死因子α，可改善中波紫外线引起的皮肤成纤维细胞损伤，加强成纤维细胞增殖及合成胶原蛋白的能力，其中转化生长因子β在体外实验中刺激成纤维细胞的作用最强。

皮肤黑色素是由位于表皮基底层的黑素细胞合成的。当黑素细胞受到外界刺激(紫外线、化学刺激、情绪压力等)时会合成黑色素，导致皮肤颜色变深。酪氨酸为黑素细胞制造黑素的主要原料，酪氨酸酶是酪氨酸转变为黑素过程中的主要限速酶。ADSCs分泌的转化生长因子β1可通过下调酪氨酸酶活性减少酪氨酸酶相关蛋白的表达，最终抑制黑色素的合成，起到美白皮肤作用。

研究表明，光老化造成的皮肤损伤与慢性难愈伤口的病理改变相似。真皮细胞外基质的胶原成分是皮肤张力和弹性回缩力的结构基础，其改变会导致光老化和创口难愈。恢复老化皮肤组织自我修复能力的关键是促进成纤维细胞合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原，重塑致密规律排列的胶原组织。研究证实，在损伤区皮肤中，ADSCs可分泌多种细胞因子和生长因子，募集巨噬细胞，促进肉芽组织和血管生成，并向内皮细胞和表皮细胞分化。但最主要的作用还是激活成纤维细胞促进伤口愈合。无论是两种细胞接触培养,还是通过ADSC-CM对成纤维细胞进行培养，都可以促进成纤维细胞的增殖。

ADSCs可以分泌IGF结合前体蛋白、PDGF、KGF、VEGF和纤连蛋白等，这些因子具有促进毛发生长的作用。ADSC-CM培养，可使真皮乳头细胞的增殖能力增强，更多毛囊进入生长期，代表增殖能力的信号蛋白pAkt、 pErk表达增高。适量浓度的ADSC-CM能够加速体外培养的毛发生长。体内动物实验中，皮内注射ADSCs或是皮肤外涂抹ADSC-CM，都有明显促进毛发再生的效果。

目前，脂肪干细胞的体外培养方法还没有同一标准，影响最终获得脂肪干细胞的质量与数量。此外，脂肪干细胞的旁分泌作用受到多种因素影响，直接关系到将脂肪干细胞的旁分泌物质作为活性成分的产品的治疗作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养人脂肪干细胞的方法及其护肤美容上的应用，以解决上述技术问题中的至少一个。

根据本发明的一个方面，提供一种制备人脂肪干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶和0.1vol％胶原酶联合消化人源脂肪组织，消化20分钟后，液面分为三层，上层为脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体，取下层液体，采用换液方式冲走溶液中的红细胞，制得脂肪干细胞沉淀液；步骤b.将脂肪干细胞沉淀液加入L-DMEM完全培养基中终止消化并进行脂肪干细胞原代培养；步骤c.用0.25vol％胰酶和0.04％EDTA对原代脂肪干细胞进行消化传代，传代培养过程过程中提供O₂分压为1～5％、CO₂分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm²的低剂量紫外线照射，并在培养过程中加入1×10^-7mol/L胰岛素，获得脂肪干细胞培养物；步骤d.将脂肪干细胞培养物液离心，过滤，除去脂肪干细胞，得到滤液即为所述脂肪干细胞培养液。

优选地，在所述步骤c中，O₂分压为3％。

优选地，在步骤b和步骤c的培养过程中加入维生素C、维生素D₃、T 肿瘤坏死因子-α或血小板衍生因子中的一种或多种。

优选地，在步骤c中，提供20mJ/cm²的紫外线照射。

本发明还提供采用上述的方法制备得到的人脂肪干细胞培养液。

本发明还提供上述的培养液在护肤美容用品中的应用。

本发明还提供一种护肤美容用品，其特征在于：含上述的人脂肪干细胞培养液。

优选地，护肤美容用品包括清洁类产品、美白除皱类产品以及化妆类产品。

优选地：清洁类产品包括洗手液、沐浴产品、洗发护发产品、洁面产品和卸妆产品；美白除皱类产品包括：润肤霜、爽肤水、收缩水、化妆水、乳液、日霜、晚霜、精华液、眼霜、护手霜、防裂膏、精华液；化妆类产品包括：妆前乳、隔离霜、粉底霜、唇膏、胭脂、花露水、香粉和面膜。

优选地，护肤美容用品为乳液，除了水分，其含有重量百分比为5～10％的所述脂肪干细胞培养液，且还含有如下重量百分比组分：

本发明通过胰酶和胶原酶联合消化人源脂肪组织，可大大缩短消化时间，从而避免了酶对细胞的过度损伤；此外，与传统使用NH₄Cl破坏红细胞而排出红细胞干扰的做法相比，本发明通过换液的方法去除红细胞，2次换液后红细胞基本消失，这样避免了NH₄Cl对细胞的损伤。因此，使用本发明提供的技术方案，每500mg脂肪组织平均可获得5×10⁵个干细胞，比一般的传统方法的细胞获得率高20倍以上。培养得到的ADSCs可以稳定传代，培养的ADSCs传至30代时仍能表达Oct-4、Nanog、Sox-2和 Rex-1mRNA。另外，传至25代之后，将传代间隔调整为每14天传一代，得到的ADSCs的细胞增殖力高于一般每隔5天传代得到的细胞，并且细胞数量是常规传代细胞的20倍。另外，本发明通过在ADSCs的培养过程中，采用低氧气氛和低剂量紫外线照射条件，且添加了胰岛素以及各种细胞因子、维生素，可以极大地促进ADSCs的旁分泌功能，由此培养得到 ADSC-CM中各种生长因子含量高于传统的ADSC-CM。最后，将本发明培养得到的ADSC-CM加入到护肤美容品中，能够取得较佳的美白、祛疤、抗皱等作用效果。

附图说明

图1为实施例1传代培养30代的ADSCs的细胞形态显微镜图。

图2为实施例2有/无提供紫外线照射培养得到的ADSC-CM中的四种生长因子的蛋白质表达率；

图3为实施例2有/无提供紫外线照射培养得到的ADSC-CM中的四种生长因子的mRNA表达率；

图4为实施例3各实验组在治疗后的皮肤组织SOD酶活性统计分析图；

图5为实施例3各实验组在治疗后的皮肤组织MDA酶活性统计分析图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例中的实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。

实施例1

1.1脂肪干细胞培养液(ADSC-CM)的制备

本实施例将在下述内容中对制备ADSC-CM的过程进行详细描述。

步骤a：自皮下获取正常脂肪组织，约500mg，无钙镁Hank’s液冲洗，用眼科剪尽量剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，冲洗血液后剪碎脂肪组织，移入大玻璃管中，加入0.25vol％胰蛋白酶(sigma)和0.1vol％胶原酶(I型，sigma)(体积比1:1)，37℃恒温摇床振荡消化20分钟；此时液面分为3层：上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；

步骤b：吸出下层液体移入含完全培养基(10％胎牛血清(hyclone)+ 高糖DMEM(gibco)的离心管中终止消化；在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2～3次；将收集到的液体1500r/min 离心10分钟，去除悬浮的脂肪细胞和脂滴，去除上清液，将细胞沉淀中加入含10％胎牛血清的L-DMEM完全培养基，移入培养瓶中；将培养瓶移入培养箱孵育，将温度设置为37℃，每2～3天换液。

步骤c：待原代培养的细胞达到90％融合时，用0.25vol％胰酶和0.04％EDTA(体积1:1)消化传代，本步骤中，向培养瓶中加入适量胰岛素，使胰岛素浓度为1×10^-7mol/L；在培养箱内提供20mJ/cm²的波紫外线照射，并提供低氧气氛：N₂分压为92％、O₂分压为3％、CO₂分压为5％；传代培养至25代开始，将传代间隔时间调整为14天，将传代培养30代获得的脂肪干细胞培养液应用到后续实施例中。

步骤d：收集上述脂肪干细胞培养液，在2000～4000rpm条件下离心 10～30分钟，待沉淀与清液充分分层，弃去沉淀了，保留上清液；将所得上清液用22μm的滤膜过滤，滤液再用20nm的滤膜过滤，最终所得滤液即为本发明后续实施例中作为活性成分添加到护肤美容品中的ADSC-CM。

1.2ADSCs及ADSC-CM的鉴定

1.2.1ADSCs的细胞形态

在ADSCs的培养过程中，使用倒置显微镜(IX70-131，OLYMPUS) 观察细胞生长，并对传代贴壁生长在培养瓶中的ADSCs的生长、纯化情况及增殖进行连续观察、摄像。

接种后ADSCs在24小时内开始贴壁，初为短梭形，细胞大小不等，核浆比例较大。2～4天可见细胞伸展，大多数细胞为长梭形，形态类似成纤维细胞，核椭圆形，较大。原代培养的细胞在3～4天即达90％融合，传代后第3代细胞生长出现方向性；体外培养20代以后，细胞的增殖速度无明显减慢，细胞形态无明显改变；30代以后的细胞体积明显增大，图1为传代培养30代的ADSCs的细胞形态显微镜图。

1.2.2ADSCs的表面标志物鉴定

取第30代ADSCs检测其干细胞相关表面标记的表达，操作步骤如下：培养的ADSCs经过消化离心(1000r/min，5分钟)后细胞重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为1×10⁷cells/mL，分别与人抗CD13、CD29、CE34、 CD44、CD45、CD105、CD166和HLA-DR作用20分钟，PBS洗涤2次后用PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD,San Jose,CA,USA)进行检测。

流式细胞仪检测结果(表1)显示，大多数细胞CD13、CD29、CD44、 CD90、CD105和CD166呈阳性表达，与其他研究结果一致，其中CD90 和CD105是ADSCs的表面标志。而CD34和CD45都呈阴性表达，HLA-DR 作为排除成纤维细胞的表面标志也是持续呈阴性表达，这可以为ADSCs 的自体或者同种异体应用提供理论依据。表面标志物持续表达说明贴壁的 ADSCs可以增殖而没有丢失干细胞相关的表面标志物。

表1 ADSCs表面CD标志物的表达

抗体	表达结果	抗体	表达结果
				CD13	91.16％(+)	CD45	(－)
CD29	74.80％(+)	CD105	60.76％(+)
				CD34	(－)	CD166	48.98％(+)
CD44	83.43％(+)	HLA-DR	(－)
				CD90	80.63％(+)

1.2.3ADSCs-CM中旁分泌因子的检测

用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定ADSCs-CM中旁分泌因子的量：选取ADSCs-CM，使用ELISA试剂盒测定上清中HGF、血管内皮生长因子 (VEGF)、神经生长因子(NGF)及角质细胞生长因子含量(KGF)。方法参照试剂盒说明。100μL标准品及样品加入已包被抗人HGF、VEGF、 NGF、KGF单抗的96孔酶标板上，充分混匀置37℃2h，常规洗板，加入生物素化的一抗置37℃1小时，洗板后加入酶标二抗37℃1小时，然后加入酶底物反应10分钟终止，在450nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应HGF，VEGF，NGF，KGF表达量。测试结果所得：HGF为1733.33 ±102.63ng/L，VEGF为2067.26±45.63ng/L，NGF为26.82±3.17ng/L， KGF为31.21±5.19ng/L。

实施例2

本实施例被设置与实施例1进行比较，以展示实施例2的技术方案对于ADSCs旁分泌功能的促进效果。

2.1氧气分压对ADSCs旁分泌功能的影响

本部分内容中，改变培养ADSCs培养过程中的氧分压，除此之外，其他的处理步骤与实施例1保持一致。各组的培养气氛条件具体为：

1％O₂预处理组：体积分数1％O₂+5％CO₂+94％N₂；

3％O₂预处理组：体积分数3％O₂+5％CO₂+92％N₂；

5％O₂预处理组：体积分数5％O₂+5％CO₂+90％N₂；

10％O₂预处理组：体积分数10％O₂+5％CO₂+85％N₂；

对照组(实施例1)：体积分数5％CO₂+95％空气，即正常/常规的细胞培养条件。

采用ELISA测定各组ADSC-CM中旁分泌因子的量，具体结果如表2 所示。结果表明，与在正常空气气氛(对照组)下培养得到的ADSC-CM 相比，在低氧环境(1～5％O₂)下培养得到的ADSC-CM的4种旁分泌因子的分泌量都比较高，说明低氧环境培养ADSCs有利于促进ADSCs的旁分泌功能。

表2 ELISA法检测不同氧分压下ADSC-CM旁分泌因子含量

2.2胰岛素对ADSCs旁分泌功能的影响

在同实施例1中培养ADSCs过程中，在培养基中加入了不同浓度的胰岛素。本部分内容中，除了改变培养ADSCs过程中的培养基中的胰岛素浓度，其他的处理步骤与实施例中1保持一致。各组培养基中的胰岛素浓度具体为：

实验1组：胰岛素浓度为1×10^-6mol/L；

实验2组：胰岛素浓度为1×10^-7mol/L；

实验3组：胰岛素浓度为1×10^-8mol/L；

对照组(实施例1)：无胰岛素组。

结果表明(表3)，与对照组比较，实验2组和实验3组在胰岛素刺激下VEGF、HGF的分泌量明显增多，但实验1组其含量并无明显变化。 NGF、KGF的分泌量虽然增量不特别明显，但也有一定的增量。由此可见， 10^-8～10^-7mol/L胰岛素能明显促进ADSCs的旁分泌功能。

表3 ELISA法检测不同胰岛素浓度影响ADSC-CM旁分泌因子含量

2.3紫外线对ADSCs旁分泌功能的影响

在同实施例1中培养ADSCs过程中提供20mJ/cm²的紫外线低剂量照射。本部分内容中，设置对照组为在培养ADSCs过程中不提供紫外线照射，除此之外，其他的处理步骤与实施例1保持一致。采用ELISA分别测定对照组和实验组得到的ADSC-CM中旁分泌因子的量。与对照组相比，实验组培养得到的ADSC-CM中的41种旁分泌因子的含量均有提高。其中，取含量最显著被提高的几种旁分泌因子：碱性成纤维生长因子(bFGF)、 KGF、HGF、VEGF，测试它们的蛋白质表达率和mRNA表达率，具体结果如图2、3所示，图2和图3中的灰色柱状表示对照组的测试结果，黑色柱状表示实验组的测试结果，经20mJ/cm²的波紫外线照射培养得到的ADSC-CM中的bFGF、KGF、HGF、VEGF的蛋白质表达率和mRNA表达率均有显著提高。

2.4氧气分压、紫外线以及胰岛素对ADSCs旁分泌功能的影响

在培养基中加入了浓度为1×10^-7mol/L的胰岛素，且设置培养ADSCs 过程中的气氛条件为：3％O₂+5％CO₂+92％N₂，同时提供20mJ/cm²的紫外线低剂量照射，其他处理步骤和检测上述同上述实施例保持一致。

结果表明(表4)，与对照组或单个影响因素相比，在多个影响因素刺激下，ADSC-CM的旁分泌因子的分泌量都增加增加。

表4 ELISA法检测多种因素下ADSC-CM旁分泌因子含量

实施例3

研究表明，ADSCs所分泌的胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、白细胞介素1和肿瘤坏死因子α，可改善中波紫外线引起的皮肤成纤维细胞损伤，加强成纤维细胞增殖及合成胶原蛋白的能力，其中转化生长因子β在体外实验中刺激成纤维细胞的作用最强。

3.1美白去皱美容乳液的制备

利用实施例1得到的人源脂肪间充质干细胞培养液制备美白去皱美容乳液，具体步骤如下：

(1)基质组乳液的制备

各组分之间的质量百分比如下：

水相制备：准确称取去离子水，加热至60℃左右，加入羟苯甲酯，待全部溶解，加入乙二胺四乙酸二钠、透明质酸钠，混合均匀，冷却至室温；加入甘油，混合均匀后得到水相料液。

油相制备：取荷荷巴油，选择聚丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯 (SEPIGEL305)作为乳化剂加入，混合均匀后得到油相料液。

将水相料液缓慢加入到油相料液中，缓慢搅拌至乳液均匀光滑

(2)美白去皱美容乳液的制备

按间充质干细胞培养液质量百分比为5％，6％，7％，8％，9％，10％的梯度，将实施例1得到的人源脂肪间充质干细胞培养液和适量的基质膏剂在恒温水浴槽里混合，混合过程中不断搅拌，使其混合均匀。

3.2美白效果的测定

络氨酸酶(Tyrosinase,TYR)处于黑色素细胞中的黑色素小体内，当受到紫外线刺激，可活化并催化血液中的络氨酸(Tyrosine,Tyr)发生氧化反应产生灰色的多吧(DOPA)，继而产生黑灰色的多巴醌(DQ)，多巴醌聚合形成黑色素颗粒，在细胞代谢的过程中，黑色素颗粒被转移至肌肤表层。所以通过抑制络氨酸酶的活性可以降低黑色素合成水平。

本实施例通过测定美白去皱美容乳液对络氨酸酶活性的抑制率来说明产品的美白效果。在美白去皱美容乳液中，加入0.025g络氨酸酶和pH为 6.8的磷酸-柠檬酸缓冲液4mL，在37℃水槽中预热10分钟，在加0.05mg/mL 的络氨酸酶水溶液4mL，在37℃下反应15分钟后，测定475nm处的吸光度D1。另外，在不加入美白去皱美容乳液的前提下，重复进行上述操作，测得吸光度标记为D2。作为对照，加入0.025g络氨酸酶和pH为6.8的磷酸-柠檬酸缓冲液4mL，在37℃水槽中保温25分钟，测定475nm处的吸光度D3。产品对络氨酸酶的抑制率为：

络氨酸酶活性抑制率＝(D2－D1)/(D2－D3)

表5间质干细胞培养液百分比与对络氨酸酶抑制率的关系

表5数据表明，本实施例的美白去皱美容乳液对络氨酸酶有明显的抑制作用，当间质干细胞培养液的质量百分比为7％时，产品对络氨酸酶的抑制效果最好，抑制率为25.3％。

3.3去皱效果的测定

在本实验过程中，采用间质干细胞培养液的百分比为7％配制的美白去皱美容乳液。

3.3.1实验对象的选取与分组

选取鼠龄为6～8周、SPF级健康SD大鼠18只，体重为230±10g。将实验大鼠置于清洁级动物饲养室，按性别及实验分组分笼饲养，每笼6只。在相同条件下定量喂食、自由饮水，无其他不良因素影响。适应性饲养一周，待大鼠适应实验室环境后开始进行实验。

将18只SD大鼠随机分成三组，每组6只，雌雄各3只，分组处理方式如表6所示。实验大鼠在第一次UVB照射前于预备光照部位取皮后仔细缝合，切取组织作为建模前后分析对照。待完全愈合后(一周后)，开始建立模型。

表6实验分组处理

分组编号	数量	处理方式
			1空白组	6	只做脱毛处理
2模型组	6	脱毛处理+照射UVB
			3治疗组	6	脱毛处理+照射UVB+涂抹美白去皱美容乳液

3.3.2脱毛

脱毛处理原则为完全脱去表面毛发，且尽量不可损伤背部皮肤，三组大鼠在整个实验期间均做脱毛处理。首先使用电动理发器粗略将大鼠背部毛发推掉，再用电动剃须刀将细毛剔除干净，要求皮肤完全暴露、无任何毛发覆盖，面积大小为6cm×6cm，尽量避免剃毛过程损伤背部皮肤，以减少对实验结果的影响。因大鼠背部毛发生长迅速，故在建模过程中，每日进行UVB照射前均需进行脱毛处理，目的是为了保证累计UV照射计量的准确性，从而保证实验的可靠性。

3.3.3照射方式

将模型组和治疗组的大鼠固定在固定器中，固定器可使其背部皮肤充分暴露且不能转动身体，将固定器置于UV辐照仪(发射光谱260～250nm，峰值311nm，上海雷拓照明公司)正下方35.0cm处，设置UVB强度为 70～80μw/cm²，每天持续照射1.5小时，且从第三周开始每隔两周日照时间增加10分钟，共照射8周，直到总照射时长累计到100小时，UVB总剂量达7～8J/cm²。照射期间，每日细心剃除新生毛发，并观察大鼠背部皮肤的变化，若出现水疱、结痂等情况，说明照射强度过大或照射时间过长，应视情况立即停止照射，待1～2天症状消失，在继续照射，直至建模成功。

3.3.4涂抹美白去皱美容乳液治疗

照射完成后，将三组大鼠分笼饲养，每天剃除大鼠背部新生毛发，将本实施例的美白去皱美容乳液涂抹于治疗组大鼠背部，每天两次，涂于接受UVB照射皮肤表面，并皮肤表面加速吸收，为期28天，治疗期间实验大鼠未见异常现象。

3.3.5皮肤标本的切取

在治疗时间为0、14、28天时，分别对三组大鼠进行皮肤标本的切取采集。将蘸有乙醚的棉球投入密封的自封袋中，将自封袋罩在大鼠头部并以人手固定，防止漏气。约2分钟后，大鼠即进入全身麻醉状态，但仍有自主呼吸，约3～4分钟后逐渐开始苏醒。在此期间，迅速对欲切取部位皮肤进行消毒、切取、缝合。切取皮肤组织为防止细菌污染，应迅速放入福尔马林溶液中固定。

3.3.6皮肤匀浆的制备

对切取皮肤组织标本进行称重后开始制备组织匀浆。加入1:1剂量PBS (pH＝7.4)，用手工匀浆器将标本充分研磨。研磨至匀浆后以3000r/min 的速度离心20分钟。

3.3.7SOD酶活性的测定

超氧化物歧化酶(SOD)的活性是体现机体对抗光老化能力的重要指标，使用SOD试剂盒(默沙克)测定三组大鼠皮肤匀浆的SOD值。

各实验组分别在治疗后第0、14、28天切取标本后测定皮肤组织SOD 酶活性，使用SPASS软件统计分析得到的各组数据，具体结果如图4所示。读图可知，对比首次切取的标本中SOD酶的活性，空白组的SOD酶活性明显高于模型组和治疗组，进入治疗阶段，通过涂抹本实施例产品，皮肤组织内SOD酶活性逐步升高，治疗28天后，最终接近空白组，表示治疗组疗效成立。且通过横向比较，可见治疗组SOD酶活性逐渐升高，其升高幅度大于模型组皮肤自愈升高的幅度。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种生物活性酶，是目前为止发现的唯一一类以自由基为底物的酶，在机体自由基产生与清除的动态平衡中起着极其重要的作用。紫外线照射可大量增加皮肤内氧自由基，使组织抗氧化防御体系能力减弱，加速皮肤老化。因此SOD酶的活性是反映机体对抗光老化能力的重要指标。实验中治疗组SOD活性显著提高，即证明本实施例产品的治疗提升了组织抗氧自由基的能力。

3.3.8MDA酶活性的测定

丙二醛(MDA)可反映机体内脂质过氧化程度的高低以及机体的抗氧化能力，机体细胞损伤的程度亦可通过MDA间接的反映出来。使用MDA 试剂盒(默沙克)测定三组大鼠皮肤匀浆的MDA值。

各实验组分别在治疗后第0、14、28天切取标本后测定皮肤组织MDA 酶活性，使用SPASS软件统计分析得到的各组数据，具体结果如图5所示。读图可知，建模后首次切取标本之MDA含量，模型组和治疗组皆远高于空白组，可表示模型照射成功。进入治疗阶段，治疗组通过涂抹本实施例产品，皮肤组织内MDA含量逐步下降，最终接近正常，表示治疗组疗效成立。且通过横向比较，可见治疗组MDA含量明显下降，其下降幅度大于模型组皮肤自愈之下降幅度。

脂质过氧化物的主要代谢产物是丙二醛(MDA)，胞内MDA累积可损伤多种细胞成分，从而破坏细胞结构及功能。因此，MDA可以反映机体内脂质过氧化的程度及机体的抗氧化能力，亦可间接地反映出细胞损伤的程度。实验中通过涂抹美白去皱美白乳液，治疗组MDA含量显著下降，证明其一定程度上逆转了慢性损伤的机制。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种制备人脂肪干细胞培养液的方法，包括以下步骤：

步骤a.使用0.25vol％胰酶和0.1vol％胶原酶联合消化人源脂肪组织，消化20分钟后，液面分为三层，上层为脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体，取下层液体，采用换液方式冲走溶液中的红细胞，制得脂肪干细胞沉淀液；

步骤b.将所述脂肪干细胞沉淀液加入L-DMEM完全培养基中终止消化并进行脂肪干细胞原代培养；

步骤c.用0.25vol％胰酶和0.04％EDTA对原代脂肪干细胞进行消化传代，传代培养过程中提供O₂分压为1～5％、CO₂分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm²的低剂量紫外线照射，并在培养过程中加入1×10^-7mol/L胰岛素，获得脂肪干细胞培养物；

步骤d.将所述脂肪干细胞培养物液离心，过滤，除去脂肪干细胞，得到滤液即为所述脂肪干细胞培养液。

2.如权利要求1所述制备人脂肪干细胞培养液的方法，其特征在于：在所述步骤c中，O₂分压为3％。

3.如权利要求1所述制备人脂肪干细胞培养液的方法，其特征在于：在所述步骤b和所述步骤c的培养过程中加入维生素C、维生素D₃、T肿瘤坏死因子-α或血小板衍生因子中的一种或多种。

4.如权利要求1所述制备人脂肪干细胞培养液的方法，其特征在于：在所述步骤c中，提供20mJ/cm²的低剂量紫外线照射。

5.采用如权利要求1～4任一项所述的方法制备得到的人脂肪干细胞培养液。

6.如权利要求5所述的培养液在护肤美容用品中的应用。

7.一种护肤美容用品，其特征在于：含有如权利要求5所述的人脂肪干细胞培养液。

8.如权利要求7所述的护肤美容用品，其特征在于：所述护肤美容用品包括清洁类产品、美白除皱类产品以及化妆类产品。

9.如权利要求8所述的护肤美容用品，其特征在于：

所述清洁类产品包括洗手液、沐浴产品、洗发护发产品、洁面产品和卸妆产品；

所述美白除皱类产品包括：润肤霜、爽肤水、收缩水、化妆水、乳液、日霜、晚霜、精华液、眼霜、护手霜、防裂膏、精华液；

所述化妆类产品包括：妆前乳、隔离霜、粉底霜、唇膏、胭脂、花露水、香粉和面膜。

10.如权利要求8所述的护肤美容用品，其特征在于，所述护肤美容用品为乳液，除了水分，其含有重量百分比为5～10％的所述脂肪干细胞培养液，且还含有如下重量百分比组分：