CN106456529A - 小尺寸干细胞的美白能力及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含小干细胞、具体而言为直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分的美白用组合物、该组合物的制备方法及其用途;本发明还涉及直径为8μm以下的小细胞通过极其显著地减少黑色素的量而用于美白的用途。
Description
技术领域
本发明涉及包含小尺寸干细胞、具体而言为直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分的美白用组合物、该组合物的制备方法及其用途;更具体地,本发明还涉及直径为8μm以下的小尺寸干细胞所持有的极其显著地减少黑色素的美白功能的用途。
背景技术
人的皮肤颜色由黑色素在皮肤内部的浓度和分布决定。除了遗传因素之外,皮肤颜色还受环境或生理因素(如太阳紫外线、疲劳和压力)的影响。黑色素是通过使酪氨酸(一种类型的氨基酸)经酪氨酸酶的作用转化为DOPA和多巴醌、然后通过进行非酶氧化反应而合成的。
当黑色素超过必要地产生时,会出现色素沉着过度(如黄褐斑、雀斑和斑点),导致美学或健康方面的不良结果。另外,由于休闲人口的增加,喜欢户外活动的人数上升,因此对防止由紫外线引起的黑色素沉着的需求有所增长。通过抑制皮肤中的黑色素合成,皮肤色调变浅,从而可以实现皮肤美白;此外,可以减轻由紫外线、激素和遗传因素诱导的皮肤色素沉着过度(如黄褐斑和雀斑)。
迄今为止,美白剂主要是通过发现通过抑制酪氨酸酶的活性来减少黑色素的量的材料而开发的,而酪氨酸酶在黑色素合成中起着最重要和最根本的作用。如此开发的美白材料的实例包括氢醌、硫醇、曲酸、熊果苷和维生素C等;然而,这些材料未显示出令人满意的美白效果,并且长期使用这些材料会诱发副作用(如过敏、吸收至皮肤内、以及由于快速氧化而使颜色发生变化),因此,寻找和开发材料来替代上述材料的尝试是材料研究的关键部分。
作为所作努力的一部分,已经对使用干细胞的化妆品组合物进行了积极研究,韩国专利公布No.10-0848056(2009年7月23日)公开了一种通过使用来源于脂肪的间充质干细胞的培养液来抑制黑色素合成的方法;韩国专利公布No.10-2009-0116659(2009年11月11日)公开了一种美白用化妆品组合物,该组合物包含来源于脐带血的间充质干细胞的培养液,然而,并未实现令人满意的美白效果。
因此,本发明人通过研究出在培养间充质干细胞时通常存在各种尺寸的细胞,并随后考虑到细胞尺寸影响的可能性,通过对来自各种组织的间充质干细胞依据尺寸对黑色素量的减少的影响进行比较,发现直径小于或等于一定尺寸的干细胞显示极其显著的美白效果,从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
1.韩国专利公布No.10-0848056(2009年7月23日)
2.韩国专利公布No.10-2009-0116659(2009年11月11日)
非专利文献
1.Kobayashi T,Urabe K,Winder A,Jimenez-Cervantes C,Imokawa G,Brewington T,Solano F,Garcia-Borron JC,and Hearing VJ.,Tyrosinase relatedprotein 1(TRP1)functions as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis.EMBO J.(1994)13,5818-5825
2.Levy Carmit,Khaled Mehdi,David E Fisher.,MITF:master regulator ofmelanocyte development and melanoma oncogene.,Trends Mol Med.(2006)12(9),406-414
3.Barbara Bellei,Enrica Flori,Enzo Izzo,Vittoria Maresca,MauroPicardo.,GSK3βinhibiton Promotes melanogenesis in B16 melanoma cells andnormal human melanocytes.Cell.Signal.(2008)20,1750-1761
4.Barbara Bellei,Angela Pitisci,Caterina Catricala,Lionel Larue andMauro Picardo.,Wnt/β-catenin signaling is stimulated by α-melanocyte-stimulating hormone in melanoma and melanocyte cells:implication in celldifferentiation.,Pigment Cell Melanoma Res.(2010)24;309-325
5.Eun-Jung Lee,Yun Sang Lee,Soonho Hwang,Sanghee Kim,Jae Sung Hwangand Tae-Yoon Kim.,N-(3,5-Dimethylphenyl)-3-Methoxybenzamide(A3B5)Targets TRP-2 and Inhibits Melanogenesis and Melanoma Growth.,Journal of InvestigativeDermatology(2011)131,1701-1709
在整个说明书中,参照了若干文献和专利文件并示出了对它们的引用。通过引用的方式将所引用的文献及专利文件的公开内容整体并入本文,以更清楚地描述本发明的公开内容以及本发明所属技术领域的水平。
发明内容
技术问题
本发明使用使黑色素的量减少、具有极其显著的美白功能的干细胞尺寸。
本发明的主要目的是提供美白用化妆品组合物,所述化妆品组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗色素沉着过度疾病的药物组合物,所述药物组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。
技术方案
为了解决该问题,本发明提供了具有小直径的干细胞的特定美白功能及其各种用途。
在具体实施方式中,本发明提供了美白用化妆品组合物,所述化妆品组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。
直径为8μm以下的小干细胞或其培养液具有减少黑色素量的效力,这是因为直径为8μm以下的小干细胞不仅抑制黑素细胞(产生黑色素的细胞)中的黑色素合成,从而降低黑色素的表达水平,并且还促进合成的黑色素的降解。在本发明的一个实施方式中,作为产生黑色素的细胞,使用Melan-a细胞或B16F1细胞。
直径为8μm以下的小干细胞可以是选自于由以下细胞所组成的组中的任何一种或多种干细胞:胚胎干细胞以及来源于骨髓、脐带血、脂肪组织(脂肪)、血液、肝脏、皮肤、胃、胎盘、神经、肾上腺、上皮和子宫的人组织成体干细胞;优选地,干细胞来源于骨髓、脐带血或脂肪组织(脂肪),更优选为来源于脐带血的成体干细胞;例如,干细胞最优选为来源于脐带血的间充质干细胞。
对于培养液,可将任何适于动物细胞生长的基础培养基用作基础培养基,基础培养基的非限制性实例可包括最小必需培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)。最优选地,使用α-最小必需培养基(α-MEM)。
在其它具体实施方式中,本发明可提供用于预防或治疗色素沉着过度疾病的药物组合物,所述药物组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。具体组成与上文所述的相同。
术语“色素沉着过度”是指由于黑色素的过度增加,某些部分相对于其它部分变黑或变暗,包括例如黄褐斑、雀斑、老年斑或太阳斑等。
因此,本发明基于“与混合有各种尺寸的干细胞的典型的(异质的)情况的效果相比,直径为8μm以下的小干细胞或其培养液对黑色素量的减少具有最优异的效果”这一发现,提供了由直径为8μm以下的小干细胞在抑制黑色素合成并促进黑色素降解方面的优异能力所诱导的显著美白功能及其各种用途。
附图说明
图1显示了用来源于各种组织的间充质干细胞的培养液对通过α-MSH处理增加了黑色素合成能力的Melan-a细胞进行处理后的黑色素量的测定结果。
图2显示了用来源于各种组织的间充质干细胞的培养液对通过α-MSH处理增加了黑色素合成能力的B16F1细胞进行处理后的黑色素量的测定结果。
图3是显示了来源于各种组织的间充质干细胞的培养液包含各种尺寸的细胞的结果。
图4显示了细胞形态根据来源于各种组织的间充质干细胞的尺寸而发生的变化。
图5是显示了根据尺寸对来源于脐带血的间充质干细胞进行分离培养后的培养液中所含的干细胞的尺寸分布的图。
图6是根据细胞尺寸对来源于各种组织的间充质干细胞的培养液在黑色素量减少方面的效果进行观察而获得的结果。
图7是显示了根据尺寸用来源于各种组织的间充质干细胞的培养液处理Melan-a细胞时的黑色素量的变化程度的图。
图8是显示了根据尺寸用来源于脂肪组织的间充质干细胞的培养液处理Melan-a细胞时的黑色素量的变化程度的图。
图9是显示了根据尺寸用来源于骨髓的间充质干细胞的培养液处理Melan-a细胞时的黑色素量的变化程度的图。
图10是显示了根据尺寸用来源于脐带血的间充质干细胞的培养液处理Melan-a细胞时的黑色素量的变化程度的图。
图11是显示了根据尺寸用来源于脐带血的间充质干细胞的培养液处理后黑色素合成受到抑制和降解得以促进的结果。
图12显示了通过使用Melan-a细胞鉴别的与黑色素量减少相关的分泌蛋白。
图13是显示了使用人造皮肤对由来源于脐带血的间充质干细胞的培养液引起的黑色素减少进行研究的结果的图像。
具体实施方式
本文使用的术语定义如下。
术语“干细胞”是指可以发育成任何组织的细胞。干细胞的基本特征为以下两点:首先,细胞具有重复分裂以产生自身的自我更新能力;以及细胞具有能够根据环境分化为具有特定功能的细胞的多能性。
术语“间充质干细胞”是从人或哺乳动物的组织分离的一类未分化成体干细胞,可来源于各种组织。在成体干细胞中,造血细胞以非贴附状态存在,而间充质干细胞主要是贴附细胞。特别地,所述细胞可以是脐带来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞和胎盘来源的间充质干细胞,优选脐带血来源的间充质干细胞。从每种组织分离干细胞的技术是本领域已知的。
术语“干细胞的培养液”是指含有通过培养干细胞获得的培养基中包含的成分的物质,并且用于制备该培养液的干细胞类型不受限制。例如,用于制备该培养液的干细胞可以是胚胎干细胞或成体干细胞。此外,成体干细胞可以来源于所有类型组织的成体干细胞。在本发明的一个具体实施方式中,通过使用来源于脐带血的成体干细胞来制备培养液。
术语“分化”是指这样的现象:在细胞发生分裂和增殖以生长的期间,细胞的结构或功能被特定,即形态或功能发生变化以发挥赋予有机体中每个细胞和组织等的作用。通常,该术语是指将相对简单的系统划分为在品质上存在差异的两个或更多个分系统的现象。
术语“培养基”是指用于细胞离体生长和增殖的混合物,所述培养基包含用于细胞生长和增殖所必需的因子,例如糖、氨基酸、各种营养物、血清、生长因子和矿物质。特别地,本发明中的培养基是用于干细胞生长和增殖的培养基。
术语“基础培养基(basal medium)”是指包含对于细胞存活而言必需的糖、氨基酸、水等,但不包含血清、营养物和各种生长因子的混合物。对于本发明的基础培养基而言,可以使用人工合成制备的培养基,或者可以使用商业制备的培养基。商业制备的培养基的实例包括但不限于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、内皮分化培养基(EDM)、最小必需培养基(MEM)、基础培养基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最小必需培养基(α-MEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)和Iscove改良Dulbecco培养基。在本发明的一个具体实施方式中,使用α-最小必需培养基(α-MEM)。
术语细胞的“增殖”或“生长”是指细胞产生分裂并且同质的(homogenous)细胞发生扩增,使得多细胞生物体体内的细胞数目总体来说得以增加。当细胞数量增加(扩增)至一定水平时,性状(trait)通常同时发生改变(分化)和调整。
术语“对照”细胞、组织、样品或受试者是与测试细胞、组织、样品或受试者类型相同的细胞、组织、样品或受试者。
术语“美白”是指通过抑制黑素细胞(即决定皮肤颜色的细胞)的黑色素合成能力或降解所合成的黑色素来防止变黑中所涉及的因素。
术语“治疗”是指获得有利或期望的临床结果的方法。为了本发明的目的,有利的或期望的临床结果的非限制性实例包括症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定(即,未恶化)、延迟疾病进展或减慢疾病进展的速度、疾病状态减轻、暂时性缓解和缓和(部分或整体),不论是否检测到疾病。“治疗”是指治疗性处理和预防(preventive/prophylaxis)方法这两者。治疗包括已经发生的病症以及待预防的病症所需的治疗。“缓解”疾病意味着与未进行治疗的情况相比,疾病状态和/或不期望的临床迹象的程度降低和/或进展的时间过程被延迟或延长。
术语“有效量”是指导致有利或期望的临床或生化结果的适当量。有效量可以施用一次或多次。对于本发明的目的,抑制性化合物的有效量是暂时缓解、减轻、稳定或回复疾病状态、或推迟或延迟速率的适当量。在受体动物可以耐受组合物的施用或将组合物施用于动物中是合适的这一情况下,该组合物是“药学上或生理学上可接受的”。当给药剂量在生理学上有意义时,可提及制剂是以“治疗有效量”给予的。在制剂的存在导致受体患者发生可检测的变化的情况下,该制剂是生理学上有意义的。
术语“约”是指在提及量、水平、值、数字、频率、百分比、维度、尺寸、数量、重量或长度时,在30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的程度内变化的量、水平、值、数字、频率、百分比、维度、尺寸、数量、重量或长度。
在整个说明书中,除非在上下文中另有说明,否则术语“包括/包含/含有”(comprise/comprising)应当被理解为包括建议的步骤或要素、或步骤或要素的组,但不排除任何其它步骤或要素、或步骤或要素的组。
在下文中,将更详细地描述本发明。
本发明涉及具有小尺寸直径的干细胞的特定美白功能的用途。
干细胞是具有自我复制能力并能够分化成两个或更多个细胞的细胞;根据来源,可以使用胚胎干细胞或成体干细胞;在本发明中,可以优选使用来源于各种组织来源的成体干细胞,例如来源于脂肪、子宫、骨髓、肌肉、胎盘、脐带血或皮肤(上皮)的组织的干细胞。特别地,优选使用间充质干细胞(MSC)。MSC通常是促进造血作用的支持细胞(基质),并具有分化成各种中胚层细胞(包括骨、软骨、脂肪细胞和肌肉细胞)的能力;此外,MSC可以容易地增殖,同时保持未分化状态。在本发明的一个实施方式中,使用来源于脂肪组织(脂肪)、骨髓和脐带血的MSC。
最优选地,使用来源于脐带血的MSC。
脐带血是指分娩后脐带中的血液,由于脐带血含有产生白细胞、红细胞和血小板的大量造血细胞和血管内皮祖细胞,并且具有产生软骨、骨、肌肉和神经的MSC,所以脐带血具有很高的医疗价值。脐带血的特征在于:造血细胞以高于骨髓或外周血中造血细胞的浓度存在;细胞的成熟度低;并且增殖、自我复制和分化能力优于在骨髓中发现的造血细胞。此外,脐带血可以通过简单的程序从待丢弃的脐带获得、并且就其数量而言包含许多造血细胞和干细胞,因此,本发明的优选方面是使用从来源于人脐带血的血液分离的MSC。
本发明所述的干细胞可以根据本领域已知的方法进行增殖和培养。
可以开发合适的培养基用于培养动物细胞、特别是哺乳动物细胞,或可使用可以在实验室中用动物细胞生长所需的合适成分制备的任何可用的培养基,所述成分例如合成代谢的碳、氮和/或微量营养素。
所述培养基是适合于动物细胞生长的任何合适的基础培养基,作为非限制性实例,通常用于培养的基础培养基包括最小必需培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM);除了上述培养基之外,可以不受限制地使用本领域中使用的任何培养基。优选地,所述培养基可以选自由以下培养基所组成的组:α-MEM培养基(GIBCO)、K-SFM培养基、DMEM培养基(Welgene)、MCDB 131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)、DMEM/F12培养基、PCM培养基、M199/F12(混合物)(GIBCO)和MSC扩增培养基(Chemicon)。可向所述基础培养基中加入微量营养素、氮和碳的合成代谢源(作为非限制性实例,可以添加血清源、生长因子、氨基酸、抗生素、维生素、还原剂和/或糖源)。然而,本领域技术人员显然可以通过选择或组合最适于来源于各种组织的干细胞的培养基,通过已知方法适当地进行培养。在本发明的一个实施方式中,使用α-MEM培养基、K-SFM培养基等。
另外,显而易见的是,可以基于本领域的常识,通过适当调节诸如培养环境、时间和温度等条件来进行培养。
在本发明的一个具体实施方式中,在α-MEM培养基中培养MSC,使得细胞扩增至达到约80-90%的细胞汇合度,优选约90%的汇合度;然后,例如,使用PBS洗涤细胞,并进一步在K-SFM培养基中培养约20-25小时、优选24小时。术语“汇合度(%)”在本领域中通常用于表示“每面积的细胞浓度(饱和度)”,并且是经常由本领域技术人员在实验中使用的单位,来相对地表示在细胞培养中每单位面积的细胞数(细胞浓度)。本发明还包括用于制备8μm以下的小尺寸干细胞及其培养液的方法。
本发明还包括用胰蛋白酶对在本发明所述的培养基中培养的干细胞进行处理。当用胰蛋白酶对培养的干细胞进行处理时,可以获得单细胞形式的干细胞;在这种情况下,进行胰蛋白酶处理抑制了细胞之间的聚集,使得细胞具有单细胞形式,因此,可以使用任何能够抑制细胞之间形成聚集的物质作为替代品。
本发明涉及如上所述的干细胞中直径为10μm以下、最优选8μm以下的小尺寸干细胞所具有的特别优异的美白功能的用途。
特别地,直径为8μm以下的小尺寸干细胞的美白功能来自于抑制黑素细胞(即产生黑色素的细胞)中黑色素的表达水平、并促进所合成的黑色素的降解,从而从总体上减少黑色素量的效果。
决定人类皮肤颜色的黑色素是由人体中激素平衡的不平衡状态、压力或暴露于紫外线(UV)诱导的。
黑色素主要在被称为黑素细胞(存在于位于角质层最低部分的基底层中的产生黑色素的细胞)的皮肤细胞中产生,并被转运到称为角质形成细胞的上皮细胞中。黑素细胞是位于眼睛中间层的葡萄膜中和皮肤表皮的基底层中的细胞,并通过称为黑素生成的过程产生皮肤、眼睛和毛发中观察到的色素中所包括的黑色素。通常,每1mm2皮肤中存在1000至2000个黑素细胞,黑素细胞占表皮底部表面的5%至10%。黑色素在该位置起重要作用,例如通过在核周围形成帽状结构来保护基因免受UV影响以及通过除去自由基来保护细胞中的蛋白质。生物体内没有用于降解黑色素的酶,仅仅当角质形成细胞从表皮剥离时,黑色素通过从皮肤上剥离而被除去。
然而,由于遗传性原因或过继性原因,产生黑色素的细胞有时异常存在于真皮中并导致黑色素过表达,其可诱导诸如太田痣(ota’s nevus)等症状。当产生的黑色素超过必要时,引起色素沉着过度,例如黄褐斑、雀斑和斑点,并且导致美学上不良的效果。因此,使黑色素合成和表达正常化或对其进行调节是非常重要的,并且可以非常有用地加以利用。
本发明的直径为8μm以下的小干细胞或其培养液的特征主要在于,与存在各种尺寸的干细胞的典型情况(异质性)相比,显示出显著的美白效果,这是因为本发明的干细胞或其培养液具有优异的抑制黑色素合成和促进黑色素降解的能力。
本发明的直径为8μm以下的小干细胞通过抑制作为黑色素合成的关键酶的酪氨酸酶的表达和活性(即,通过参与抑制黑色素生成机制)而具有优异的抑制黑色素合成的能力。已经知道干细胞具有抑制酪氨酸酶活性的能力,然而,尚不知道小尺寸干细胞具有如此优异的能力。
此外,本发明的直径为8μm以下的小干细胞的特征在于参与促进已经合成的黑色素的降解。
关于黑色素量的减少,通常已知的由干细胞分泌的蛋白质包括TGF-β2、TNF-α、IFN-γ、ERK-1、ERK-2、酪氨酸酶、IL-1、2、3、4、5、6、10、17、EGF-R、G-CSF、GM-CSF和TRP-1等;然而,本发明人已经发现直径为8μm以下的小干细胞进一步分泌诸如CD32/Fcg受体II、孕酮受体、铁蛋白、抗增殖蛋白(prohibitin)、层粘连蛋白B1、血小板反应蛋白和C-ERB-4/HER-4等蛋白质。已经认为,从小尺寸干细胞分泌的这些蛋白质导致更优异的抑制黑色素合成和促进黑色素降解的能力。
在本发明的一个实施方式中,用α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)对用作产生黑色素的细胞的Melan-a细胞和B16F1细胞进行处理以诱导黑色素表达;此外,将来源于各种组织的MSC按尺寸划分,随后对其减少黑色素量的效果进行观察。然后,将该效果与已知作为减少黑色素量的最具代表性的物质的RSV(白藜芦醇的抗黑素生成活性,抗黑素生成剂)的效果进行比较。
如通常已知的,当培养MSC时,具有各种尺寸的干细胞共存;当提取直径为8μm以下的小细胞并培养所得物时,已经发现,通过抑制酪氨酸酶活性和促进自噬,显示了最显著的减少黑色素量的效果;同时,已经发现20μm以上的大尺寸MSC不影响黑色素量的减少。
也就是说,与典型的混合有各种尺寸干细胞的异质性干细胞培养液以及已知具有优异的黑色素减少作用的RSV相比,本发明的直径为8μm以下的小干细胞或其培养液显示出显著不同的黑色素量减少程度。
关于减少黑色素的效果,干细胞的“尺寸”是最重要的因素,无论干细胞来源的组织类型(例如脂肪组织、骨髓或脐带血)如何,直径为8μm以下的小尺寸干细胞保持优异的黑色素减少效果,特别地,优选使用来源于脐带血的干细胞。也就是说,在包含来源于脐带血的直径为8μm以下的小MSC或其培养液的情况下,抑制黑色素合成和促进黑色素降解的能力最为优异。
因此,一方面,本发明涉及包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分的美白用化妆品组合物以及制备该组合物的方法。
“化妆品组合物”是包含直径为8μm以下的小干细胞的培养液的组合物;作为该组合物的制剂,可使用任何制剂。
可将本发明的化妆品组合物制备为本领域通常使用的任何制剂,例如,可将组合物配制成溶液剂、混悬剂、乳剂、糊剂、凝胶剂、霜剂、洗剂、粉末剂、皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳剂粉底、蜡状粉底和喷雾剂等形式,但不限于此。更具体地,可将组合物制备为软化化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华液、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、面膜(pack)、喷雾剂或粉末剂的制剂。
在本发明的制剂是糊剂、霜剂或凝胶剂的情况下,可将动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷(silicone)、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等用作载体成分。在本发明的制剂是粉末剂或喷雾剂的情况下,可将乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末用作载体成分;特别地,对于喷雾剂,可以另外包含推进剂,例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。在本发明的制剂是溶液剂或乳剂的情况下,将溶剂、增溶剂或乳化剂(例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯)用作载体成分。在本发明的制剂是混悬剂的情况下,可将液相稀释剂(如水、乙醇或丙二醇)、悬浮剂(如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶用作载体成分。在本发明的制剂是含表面活性剂的清洁剂的情况下,可将脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸酯单酯、羟乙基磺酸酯、咪唑鎓盐衍生物(imidazolium derivative)、牛磺酸甲酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等用作载体成分。
对于包含在本发明的化妆品组合物中的成分,除了活性成分之外,还可以包含通常在化妆品组合物中使用的成分,例如,可以包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、染料和芳香剂等常规助剂和载体。
化妆品组合物的制备可以通过任何通常使用的方法进行。
此外,本发明提供了一种化妆方法,其特征在于,将包含本发明的直径为8μm以下的小干细胞或其培养液的化妆品组合物施用于人皮肤。
本发明的化妆方法是指将本发明的化妆品组合物施用于人皮肤的所有化妆方法。换句话说,本领域已知的将化妆品组合物施用到皮肤上的所有方法都包括在本发明的化妆方法中。本发明的化妆品组合物可以单独或叠加施用,或者与除本发明以外的其它化妆品组合物共同施用。此外,根据本发明的具有优异皮肤保护效果的化妆品组合物可以根据常规使用方法使用,并且施用次数可以根据使用者的皮肤状态或喜好而不同。
在本发明的化妆品组合物处于皂、含表面活性剂的清洁剂或不含表面活性剂的清洁剂的制剂形式的情况下,组合物可以在施用至皮肤之后被擦除、剥离或用水洗去。在具体实例中,皂是液体皂、粉末皂、固体皂或油皂;含表面活性剂的清洁制剂是清洁泡沫、清洁水、清洁巾或清洁面膜;并且不含表面活性剂的清洁制剂可以是清洁霜、清洁洗剂、清洁水或清洁凝胶,但不限于此。
在本发明的另一方面,提供了用于治疗或预防色素沉着过度疾病的药物组合物,所述药物组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。
术语“色素沉着过度”是指由于黑色素的过度增加,皮肤或指甲的某一部分相比其它部分变得更黑或更暗。优选地,由色素沉着过度引起的疾病包括但不限于黄褐斑、斑点、老年斑或太阳斑。
包含在本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体是通常在制备过程中使用的载体,包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。除了上述成分之外,本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、芳香剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂等。
本发明的药物组合物可以口服给药或胃肠外给药,对于胃肠外给药,可通过静脉内输注、皮下输注、肌内输注、腹膜内输注和经皮给药进行给药。优选根据待应用的疾病种类来决定本发明的药物组合物的给药途径。例如,由于本发明的药物组合物用于治疗由黑色素沉着过度引起的皮肤疾病,因此该组合物最优选以局部施用方法施用至皮肤中。
在另一个具体实施方式中,本发明提供了制备药物组合物和化妆品组合物的方法,该方法包括对直径为8μm以下的小干细胞进行分离。对于组合物的制备,可以使用任何通常使用的方法;此外,分出(isolating)、培养和分离(separating)直径为8μm以下的小干细胞的过程不限于本发明的方法,而是可以通过使用本领域通常使用的方法来进行。
如上所述,根据本发明的直径为8μm以下的小干细胞或其培养液可以有用地用作开发用于治疗和预防皮肤色素沉着的功能性化妆品和药品(卫生辅助)的原料。
在本说明书中,虽然对美白用功能性化妆品组合物和用于治疗色素沉着过度疾病的药物组合物进行了重点描述,然而,对于本发明所属技术领域的技术人员来说显而易见的是,本发明可以作为具有美白效果的各种形式的组合物及其使用方法而用于各种应用,所述组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。
实施例
在下文中,将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员来说显而易见的是,对这些实施例进行描述仅是用于说明本发明,并且应当理解的是,本发明的范围不限于这些实施例。
材料和方法
在本发明中,使用Medipost.Co.(韩国)提供的来源于人脐带血的间充质干细胞(MSC)。可以通过收集脐带血并从脐带血分离和培养MSC的步骤获得该细胞;下面更详细地对每个步骤进行描述。
在收集脐带血的步骤中,对于正常的阴道分娩,在分娩婴儿后胎盘仍然留在子宫中时从排出的脐静脉收集脐带血;或者对于剖宫产,在分娩婴儿后胎盘也被排出至子宫外部时从被排出至子宫外部的脐静脉收集脐带血。
在本发明中,为了从分娩后排出到子宫外部的脐静脉收集脐带血,在分娩婴儿后通过无菌操作方法从连接胎盘和胎儿的脐静脉收集脐带血。在固定脐静脉后,通过使用收集针将脐带血收集于含有抗凝血剂的脐带血收集袋(小袋)中。
作为从所收集的脐带血中分离并培养MSC的方法,可以使用包括韩国注册专利No.10-0494265中公开的方法在内的所有常用方法(Pittinger MF,Mackay AM等,Science,284:143-7,1999;Lazarus HM,Haynesworth SE等,Bone Marrow Transplant,16:557-64,1995)。该方法的示例如下。
通过对收集的脐带血进行离心以分离单核细胞,然后将所得物洗涤数次以除去杂质。洗涤后,将单核细胞以合适的密度接种在培养容器上并培养,然后,细胞增殖形成单层,其中,MSC是通过相差显微镜观察时具有同质性形状的细胞,并且以具有纺锤形状的长细胞的集落形式增殖。此后,当细胞增殖达到汇合状态时,进行传代培养以使细胞增殖至获得所需数量的细胞。
1.产生黑色素的细胞和干细胞的培养(黑素细胞和MSC的培养)
B16F1小鼠黑素瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA),Melan-a黑素细胞由Dorothy C.Bennett博士提供(St.George's Hospital MedicalSchool,Lodon,UK)。
在37℃下、在5%CO2培养箱中培养B16F1细胞,作为培养基,使用含有10%胎牛血清(FBS,Invitrogen,Calsbd,CA)和青霉素/链霉素(P/S)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM,Hyclone,Thermoscientific,Logan,UT)。在含有10%FBS、1%P/S和200mM佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,Sigma,St.Louis,MO)的RPMI 1640培养基(Hyclone)中培养Melan-a细胞。
此外,在含有10%FBS和1%P/S的α-MEM(GIBCO)中培养在Medipost.Co.(韩国)培养并储存的来源于脐带血的间充质干细胞(hUCB-MSC)、来源于骨髓的MSC(BM-MSC)和来源于脂肪的MSC(Adipo-MSC)。
2.样品组培养液(条件培养液(conditioned media))的制备
由hUCB-MSC、BM-MSC和Adipo-MSC制备样品组培养液(条件培养液)。
将处于储存状态的细胞(储存在LN2槽中)解冻并在37℃下、在5%CO2培养箱中培养,在含有2%FBS的α-MEM(GIBCO)中培养细胞,直至细胞汇合达到约90%。
然后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞三次,并在不含酚红的角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)中培养24小时,此后,采收培养液,该过程重复进行3天。然后,将各采收的培养液过滤(Top Filer System,Nunc),然后在冷藏或冷冻保存后使用所得物。
3.按尺寸制备干细胞的培养液
如下所述按尺寸进行干细胞的培养液的制备。
将处于储存状态的细胞(储存在LN2槽中)解冻并在37℃条件下在5%CO2培养箱中培养。
在37℃条件下在5%CO2培养箱中培养细胞,将处于储存状态的细胞(储存在LN2槽中)解冻和培养后,通过使用8μm和20μm膜过滤器分离并收集小尺寸干细胞。在该过程中,通过连续使用20μm膜过滤器并随后使用8μm膜过滤器获得直径为8-20μm的细胞。
在含有10%FBS的α-MEM(GIBCO)培养基中培养细胞,直至细胞汇合达到约70%,然后,用PBS洗涤3次。然后,将细胞在不含酚红的角质形成细胞培养基(K-SFM)中培养24小时,此后,采收培养液,该过程重复进行3天。过滤采收的培养液(Top Filer System,Nunc),然后在冷藏或冷冻保存后使用所得物。
4.用于黑色素表达的处理试剂
为了激活黑色素表达,用α-黑素细胞刺激激素(α-MSH,St.Louis,MO,USA)以1μM的浓度对B16F1小鼠黑素瘤细胞系和Melan-α黑素细胞进行处理。
此外,为了制备比较对照以对黑色素合成的减少程度进行比较,使用已知作为减少黑色素量最具代表性的物质RSV(白藜芦醇的抗黑素生成活性,抗黑素生成剂,Sigma,St.Louis,MO,USA)以50μM的浓度进行处理。
5.黑色素测定
B16F1黑素瘤细胞、Melan-a细胞均从储存状态解冻并开始培养。24小时后,进行24小时的α-MSH处理;作为减少黑色素合成的效果的标准实验,使用RSV;为了进行比较,将每种培养液处理24小时。
然后,通过胰蛋白酶处理从细胞培养板分离和收集细胞,并通过使用1N NaOH溶解于10%DMSO中的缓冲液在100℃下分离细胞中的黑色素,持续30分钟。
在黑色素分离后,使用ELISA板读数器(Victor X3,Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)在415nm处测量黑色素量。
6.对取决于干细胞的来源或尺寸的抑制黑色素合成并促进降解的能力进行的研究
本发明人试图以8μm、8-20μm和20μm的尺寸对来源于骨髓、脂肪组织(脂肪)和脐带血的MSC进行分离,然后尝试对培养细胞的培养液使得合成的黑色素量减少的机制进行研究。
6-1黑色素合成抑制实验
用根据尺寸划分的来源于脐带血的MSC的培养液对用α-MSH处理的黑素细胞进行处理,然后从黑素细胞中提取蛋白质。
在蛋白质样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl,pH 6.8,25%甘油,2%SDS,5%β-巯基乙醇,0.01%溴酚蓝)(BioRad,Hercules,CA)中制备每种条件的所有蛋白质提取物。然后,用SDS-PAGE对每个样品进行电泳,并将所得物转移至PVDF膜(BioRad);此后,使所得物与抗酪氨酸酶抗体(由V.J.Hearing(NIH,Bethesda,MD)提供)在4℃下反应过夜。
对于蛋白质检测,使PVDF膜与HRP缀合的二抗(Pierce,Rockford,IL)反应,然后通过使用AE-9300Ez-Capture MG Hours Image Saver HR图像捕获工具(ATTO,Tokyo,Japan)来研究酪氨酸酶活性。
6-2黑色素降解促进实验
为了研究来源于脐带血的MSC的培养液是否促进通过α-MSH处理而合成的黑色素的降解,对取决于根据细胞尺寸划分的培养液所进行的处理的黑素细胞的自噬现象进行了研究。
对于该实验,通过lipofectamin 2000用pEGFP-LC3载体转染B16F1细胞,并用G418(1mg/ml)处理7天。将单细胞滴入96孔板后,对显示荧光的存活克隆进行扩增以制备细胞系,然后使用荧光显微镜(IX71,Olympus,Japan)对细胞进行研究。
对于自噬现象,发生了从GFP-LC3I到GFP-LC3II的转变,当发生向GFP-LC3II的转变时,可以通过靶向自噬体的点状GFP-LC3来鉴定GFP-LC3II。为了对自噬现象进行研究,在通过显微镜观察的100个细胞中,计数并测量显示GFP-LC3点状的细胞。作为阳性对照,使用50μM自噬诱导剂RSV(白藜芦醇)(Sigma,St.Louis,MO),即抗黑素生成剂。
7.生长因子测定
对于每种MSC,通过使用1%蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,Mo)、1%磷酸酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,Mo)和裂解珠(Fullmoon biosystems,Sunnyvale,CA)来提取蛋白质;通过使用抗体阵列分析试剂盒(Fullmoon biosystems,Sunnyvale,CA)来纯化出纯蛋白。对于蛋白质测定,使用微阵列载玻片(Fullmoon biosystems,Sunnyvale,CA)来测量表达,并使用GenePix 4000B扫描仪(Axon Instrument,USA)、Genowiz4.0TM(OcimumBiosolutions,India)和UniProt DB对结果进行分析。
8.3D人造皮肤实验方法
在对干细胞培养液在细胞水平上减少黑色素量的能力进行研究后,本发明人通过使用人造皮肤进一步研究了黑色素量的减少。
作为3D人造皮肤,使用MEL-300-B-MelanoDerm组织(MatTek Co.Kr),在37℃、5%CO2培养箱条件下使用EPI-100-LLMM-NMM-NMM-133培养该皮肤。使用作为阴性对照的DW和作为阳性对照的2%曲酸对该皮肤进行处理后,用对按尺寸分离的细胞进行培养而得的每种培养液(条件培养液,CM)对皮肤进行处理,用于对比实验。通过显微镜对黑素细胞的黑色素表达程度进行观察。
实施例1:Melan-a黑素细胞中黑色素量的降低效果
Melan-a细胞在培养期间产生黑色素,并且当黑色素合成被激活时显示黑色。当细胞存储数即细胞传代数高时,通过α-MSH处理增加Melan-a细胞中的黑色素合成。
本发明人建立了一种系统,其中,通过在1μMα-MSH处理下培养Melan-a细胞24小时将黑色素合成能力增加两倍,并通过用50μM已知为黑色素合成抑制剂和黑色素量减少剂的RSV处理细胞使黑素细胞中的黑色素量减少一半。目前为止,在已知抑制黑色素合成和减少黑色素量的物质中,已知RSV是最有效的物质。
此外,本发明人通过用含有hUCB-MSC、BM-MSC和Adipo-MSC的培养液处理Melan-a细胞24小时来测量黑色素量的变化。
结果示于图1中。该结果由3次重复实验获得。
如图1所示,当将通过α-MSH处理诱导黑色素合成的对照中的黑色素表达水平认定为是200%的标准时,用来源于BM-MSC和Adipo-MSC的培养液处理的情况下的黑色素合成水平为180%,因此黑色素量减少不多。
然而,已经发现,基于α-MSH处理的对照中的黑色素合成水平,来源于hUCB-MSC的培养液使黑色素量相比RSV降低了约2倍、相比对照降低了约4倍。
换句话说,已经发现,对于未根据细胞尺寸进行分离而混合有各种尺寸的细胞的典型细胞培养物的情况,在来源于各种组织来源的干细胞中,来源于脐带血的MSC显示出优异的减少黑色素量的能力。
实施例2:B16F1细胞中黑色素量的降低效果
此外,本发明人通过与实施例1相同的方法在B16F1细胞中进行实验,结果示于图2中。
结果,当将通过α-MSH处理B16F1细胞诱导黑色素合成后测量的黑色素量认定为是200%的标准时,黑色素量测量如下:对于RSV处理为120%;对于BM-MSC培养液为180%;对于Adipo-MSC培养液为200%。即,对于来源于骨髓和脂肪组织(脂肪)的MSC的培养液,并无减少黑色素量的效果。
然而,与实施例1所示相同,对于UCB-MSC培养液处理,观察到黑色素量为110%;作为上述观察的结果,还发现相比已知为黑色素合成的优异抑制物质的RSV,UCB-MSC培养液能够更有效地减少黑色素量。
实施例3:细胞尺寸分布和生长模式的研究
对来源于各种组织,即来源于脂肪、骨髓和脐带血的MSC培养,本发明人试图对生长的MSC的尺寸分布进行了研究。
结果,如图3所示,已经发现,各种尺寸的MSC基本上共同存在于各种组织来源的MSC的培养液中。特别地,在来源于脐带血的MSC中,当细胞通过细胞培养扩增时,细胞尺寸比从储存状态解冻后立即分析的细胞更加多样。除了来源于脐带血的MSC之外,这些结果还显示在来源于骨髓和脂肪的MSC中。
此外,本发明人观察到细胞形态的变化取决于各种组织来源的MSC的尺寸,结果示于图4中。
因此,已经发现,与组织来源无关,与异质性细胞相比,小尺寸干细胞在细胞形态学上显示出较小的变化。
实施例4:根据细胞尺寸分离、培养的细胞分布的观察
为了对按直径分离的干细胞在培养后是否变回至各种尺寸的细胞群(即,异质性群)进行观察,对在细胞分离后培养6-7天的MSC的尺寸分布进行再次研究。结果示于图5中。
图5A显示出培养异质性细胞后培养液中包含的干细胞的尺寸分布;图5B显示出在分离和培养直径为8μm以下的细胞后的细胞尺寸分布;图5C显示出在分离和培养直径为8-20μm的细胞后的细胞尺寸分布;图5D显示出在分离和培养直径为20μm以上的细胞后的细胞尺寸分布。
作为按直径分离MSC并培养后对细胞尺寸进行分析的结果,已经发现,细胞没有变回至各种尺寸的细胞群(即,异质性群),并且仍仅存在相似尺寸的细胞。
实施例5:取决于干细胞尺寸的黑色素量减少效果
如上所述,按尺寸分离细胞,然后制备培养液(条件培养液),用该培养液对已用α-MSH处理以刺激黑色素合成的Melan-a细胞进行处理,并观察对减少黑色素量的影响。
结果按各种组织来源示于图6和图7中。
首先,以裸眼对按8μm以下、8-20μm和20μm以上的细胞尺寸划分的来源于脂肪、骨髓和脐带血的MSC的培养液的减少黑色素量的效果进行观察,结果,已经发现,对于8μm以下的小细胞的培养液,黑色素减少效果增加并且颜色变浅(图6)。
更具体地,已经发现,与用(异质性)培养液(其中,干细胞不经尺寸分离培养,即,具有各种尺寸细胞的干细胞的培养液)进行处理的Melan-a细胞相比,用直径为8μm以下的小尺寸细胞的培养液进行处理的黑色素量减少效果增加了约12%(图7)。
然而,当用直径为20μm以上的大尺寸细胞的培养液处理Melan-a细胞时,与对照没有显著差异。这些结果意味着,具有20μm以上的大尺寸的MSC不显著影响黑色素量的减少。
此外,与异质性群对照相比,直径为8-20μm的MSC的培养液不显示显著的黑色素减少效果(参见图8-图10中的p值)。
实施例6:取决于不同组织来源的MSC的黑色素量减少效果
为了对除了MSC的尺寸之外,组织来源的类型是否也影响黑色素减少能力进行研究,本发明人按尺寸对来源于脂肪、骨髓和脐带血的MSC进行了分离,并对各自的黑色素量减少效果进行了测量。
结果示于图7-图10中,来源于脂肪、骨髓和脐带血的MSC的结果显示在图8-图10中的单独的图中。
与其它成体干细胞(例如,脂肪组织、骨髓)的培养液相比,来源于脐带血的MSC的培养液显示出优异的黑色素量减少效果(图10)。特别地,来源于脐带血的MSC的培养液显示出的黑色素量减少效果是50μM RSV(已知其具有优异的黑色素量减少效果)处理的黑色素量减少效果的两倍。
用来源于骨髓和脂肪的MSC的培养液进行相同的实验(图8和图9),结果,尽管不如来源于脐带血的MSC的培养液的黑色素量减少效果(图10),但是与异质性干细胞对照相比,8μm以下的细胞的培养液的处理减少黑色素量的效果相对增加了10%;因此,已经发现,与干细胞的组织来源类型相比,干细胞的“尺寸”是美白效果的更重要的决定因素。
实施例7:抑制黑色素合成和促进降解的能力的研究
通过使用本发明的来源于脐带血的MSC的培养液,通过酪氨酸酶的western印迹分析对黑色素合成抑制能力进行了研究,并通过自噬分析对黑色素降解促进能力进行了研究,结果示于图11中。
如图11A所示,当用来源于脐带血的MSC的培养液、特别是8μm以下的细胞的培养液进行处理时,观察到与阳性对照(即,RSV处理组)的情况相同,黑素细胞的酪氨酸酶活性受到抑制。
此外,如图11B所示,当用来源于脐带血的MSC的培养液进行处理时,黑素细胞的自噬活性显著增加。此外,当用8μm以下的细胞的培养液进行处理时,已经发现,与阳性对照(即,RSV处理组)的情况相似,黑素细胞中的自噬活性比阴性对照增加40%。
因此,已经发现,本发明的8μm以下的来源于脐带血的MSC的培养液的处理通过抑制黑素细胞中的酪氨酸酶活性来抑制黑色素合成,并通过自噬活性促进黑色素降解,从而减少黑色素的量。
实施例8:与黑色素量降低相关的分泌蛋白
当对用实施例1的培养液处理的Melan-a细胞进行培养时,对与黑色素量减少相关的小尺寸干细胞的分泌蛋白进行了研究(图12)。通过Fullmoon测定对分泌至培养液中的650蛋白进行了分析。
结果示于下表中。
[表1]
特别地,除了已知蛋白质之外,发现直径为8μm以下的小干细胞还进一步分泌诸如CD32/Fcg受体II、孕酮受体、铁蛋白、抗增殖蛋白、层粘连蛋白B1、血小板反应蛋白和C-ERB-4/HER-4等蛋白质。
因此,认为从小尺寸干细胞分泌的这些蛋白质对抑制黑色素合成和促进黑色素降解的更优异的能力产生影响。
实施例9:人造皮肤中黑色素量的减少
本发明人进一步用本发明的来源于脐带血的MSC的培养液对人造皮肤进行了处理,然后对结果进行观察。
结果,如图13所示,观察到在用本发明的8μm以下的细胞的培养液处理的组中,培养液处理5天后,显示黑色素的细胞显著减少。
从这些结果已经发现,无论干细胞的组织来源类型为何,直径为8μm以下的小干细胞分泌各种与美白相关的蛋白质,以共同抑制黑色素合成并促进黑色素降解,因此显示出最优异的黑色素量减少效果,这与不按尺寸分离即进行培养的异质性情况相比更为显著优异。此外,已经发现,当细胞培养液具有20μm以上的大直径的细胞时,对黑色素量的减少没有显著影响,因此干细胞的美白功能很大程度上受干细胞尺寸的影响。
工业实用性
由于直径为8μm以下的小干细胞或其培养液抑制产生黑色素的细胞中的黑色素表达并促进合成的黑色素降解,从而通过显著减少黑色素量显示出优异的美白效果,因此该干细胞及其培养液可用作美白用卫生用品和功能性化妆品的原料,因此,本发明在利用美白的领域中非常有用。
Claims (15)
1.一种美白用化妆品组合物,所述化妆品组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。
2.如权利要求1所述的美白用化妆品组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞包含选自于由以下细胞所组成的组中的任何一种或多种干细胞:胚胎干细胞以及来源于骨髓、脐带血、脂肪组织、血液、肝脏、皮肤、胃、胎盘、神经、肾上腺、上皮和子宫的人组织成体干细胞。
3.如权利要求2所述的美白用化妆品组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞来源于骨髓、脐带血或脂肪组织。
4.如权利要求3所述的美白用化妆品组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞来源于脐带血。
5.如权利要求4所述的美白用化妆品组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞是来源于脐带血的间充质干细胞。
6.如权利要求1所述的美白用化妆品组合物,其中,对于所述培养液,使用角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)作为基础培养基。
7.如权利要求1所述的美白用化妆品组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞或其培养液通过抑制黑素细胞中的黑色素合成并降解合成的黑色素来降低黑色素表达水平。
8.如权利要求7所述的美白用化妆品组合物,其中,所述黑素细胞是Melan-a细胞或B16F1细胞。
9.一种用于预防或治疗色素沉着过度疾病的药物组合物,所述药物组合物包含直径为8μm以下的小干细胞或其培养液作为活性成分。
10.如权利要求9所述的用于预防或治疗色素沉着过度疾病的药物组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞来源于骨髓、脐带血或脂肪组织。
11.如权利要求10所述的用于预防或治疗色素沉着过度疾病的药物组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞来源于脐带血。
12.如权利要求11所述的用于预防或治疗色素沉着过度疾病的药物组合物,其中,所述直径为8μm以下的小干细胞是来源于脐带血的间充质干细胞。
13.如权利要求9所述的用于预防或治疗色素沉着过度疾病的药物组合物,其中,对于所述培养液,使用角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)作为基础培养基。
14.一种用于制备权利要求1或9所述的直径为8μm以下的小干细胞的培养液的方法,所述方法包括:将所述直径为8μm以下的小干细胞培养于α-最小必需培养基(α-MEM)中,使细胞增殖至达到80-90%的汇合度并洗涤;然后将所述细胞在角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)中进一步培养20-25小时。
15.如权利要求14所述的用于制备权利要求1或9所述的直径为8μm以下的小干细胞的培养液的方法,其中,所述洗涤通过使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
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Family Applications (1)
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CN201580031270.1A Pending CN106456529A (zh) | 2014-06-10 | 2015-06-09 | 小尺寸干细胞的美白能力及其用途 |
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KR (1) | KR20150141812A (zh) |
CN (1) | CN106456529A (zh) |
WO (1) | WO2015190808A2 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112891293A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-06-04 | 南昌大学 | 人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018021805A1 (ko) * | 2016-07-25 | 2018-02-01 | 고려대학교 산학협력단 | 자궁 유래 성체줄기세포 분리 및 제조 방법 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130244948A1 (en) * | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Scharp Technologies, Inc. | Compositions of cells, media, and methods thereof |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100848056B1 (ko) | 2007-07-30 | 2008-07-23 | (주)프로스테믹스 | 줄기세포 배양액을 이용한 멜라닌 합성저해 방법 |
WO2009136747A2 (ko) | 2008-05-07 | 2009-11-12 | 한 쎌 주식회사 | 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
KR101078419B1 (ko) * | 2009-03-20 | 2011-10-31 | 주식회사 스템메디언스 | 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 피부 상태개선용 조성물 |
KR101548317B1 (ko) * | 2012-03-28 | 2015-09-02 | 고려대학교 산학협력단 | 신경줄기세포 배양액 또는 신경줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
-
2014
- 2014-06-10 KR KR1020140070332A patent/KR20150141812A/ko not_active Application Discontinuation
-
2015
- 2015-06-09 CN CN201580031270.1A patent/CN106456529A/zh active Pending
- 2015-06-09 WO PCT/KR2015/005791 patent/WO2015190808A2/ko active Application Filing
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130244948A1 (en) * | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Scharp Technologies, Inc. | Compositions of cells, media, and methods thereof |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
中华人民共和国卫生部: "《化妆品安全技术规范》", 31 December 2016 * |
具熙宴等: "《化妆品王国的秘密》", 30 April 2011, 商务印书馆国际有限公司 * |
王鸿利等: "《中华检验医学大辞典》", 31 October 2000, 上海科学技术出版社 * |
章苏宁: "《化妆品工艺学》", 1 October 2007, 中国轻工业出版社 * |
罗光乾: "《驻颜革命》", 31 January 2009, 京华出版社 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112891293A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-06-04 | 南昌大学 | 人羊膜干细胞培养物的制备方法及应用 |
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PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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