KR100848056B1

KR100848056B1 - 줄기세포 배양액을 이용한 멜라닌 합성저해 방법

Info

Publication number: KR100848056B1
Application number: KR1020070076221A
Authority: KR
Inventors: 박병순; 김원석; 성종혁; 안세진
Original assignee: (주)프로스테믹스; 박병순
Priority date: 2007-07-30
Filing date: 2007-07-30
Publication date: 2008-07-23
Also published as: US20090035283A1

Abstract

본 발명은 인간의 중간엽 줄기세포 및 줄기세포 배양액의 새로운 용도에 관한 것으로, 구체적으로 인간의 지방, 태반, 제대혈 또는 골수에서 추출된 중간엽 줄기세포 또는 이를 적정한 배지 및 조건에서 배양한 줄기세포 배양액은 멜라닌 합성을 저해하는 활성을 가지므로 이를 미백과 관련된 의약품, 의약부외품, 화장품의 원료로 이용하는 방법에 관한 것이다.

미백, 멜라닌 합성, 티로시나아제, 줄기세포

Description

줄기세포 배양액을 이용한 멜라닌 합성저해 방법{Inhibition of melanin synthesis using adult stem cells culture media}

본 발명은 인간의 중간엽 줄기세포 및 줄기세포 배양액의 새로운 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 인간의 지방, 태반, 제대혈 또는 골수에서 추출된 중간엽 줄기세포 또는 이를 적정한 배지 및 조건에서 배양한 줄기세포 배양액은 멜라닌 합성을 저해하는 활성을 가지므로 이를 미백과 관련된 의약품, 의약부외품, 화장품의 원료로 이용하는 방법에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)라 불리는 피부 세포에서 만들어져 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 여기서 멜라닌은 핵주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 래디컬(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다. 이러한 멜라닌을 분해하는 효소가 생체 내에는 없고 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져나갈 때 같이 피부에서 떨어져나가는 것으로 제거된다. 하지만, 멜라닌이 필요이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근 깨, 점 등과 같이 과색소침착증을 유발하여 미용상으로 좋지않은 결과를 가져오게 된다. 또한, 레져인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자하는 요구가 증가하게 되었다. 이에 과도한 멜라닌 생성을 막는 미백제 개발이 필요하게 되었고 그 동안 많은 노력들이 이루어졌다.

이제까지의 미백제 개발은 주로 멜라닌 생합성에서 없어서는 안될 기본적이면서도 가장 중요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제(Tyrosinase)의 활성을 저해하는 것을 통해 멜라닌 양을 줄이는 물질을 찾는 것으로 이루어져왔다. 이렇게 개발된 미백제로 코지산, 알부틴, 글루타치온, 비타민 A, 비타민 C 등이 있지만 소비자들이 만족할 만한 미백효과를 갖지 못하고 있으며 부작용 때문에 그 사용량에 제한적인 문제점이 있다. 따라서 이제까지의 미백제보다 효능이 뛰어나고 좀 더 안전한 미백제를 개발하는 것이 절실한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 우수한 미백효과를 나타내면서도 부작용이 없는 새로운 미백제를 제공하기 위하여 노력한 결과, 줄기세포 배양액이 부작용없이 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 수득한 배양액 또는 그 배양액으로부터 분리된 단백질을 이용한 안전하고 효과적인 미백관련 의약품 또는 화장품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 줄기세포 배양액 또는 그 배양액에서 분리된 단백질을 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

이 때 상기 줄기세포는 포유동물에서 유래된 성체줄기세포 및 중간엽 줄기세포를 포함한다. 또한 상기 성체줄기세포는 지방조직, 골수조직, 제대혈 또는 태반에서 분리된 줄기세포를 포함한다.

줄기세포란 미분화 세포로서, 오랜기간 동안 분열을 하고 자기 갱신(self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나뉘어 지게 되는데, 잠재 능력은 배아줄기세포보다 한정적인 단점이 있으나 윤리적 문제가 없고 부작용이 없는 성체줄기세포를 대상으로 많은 치료제가 연구되고 있다.

구체적으로, 본 발명에서는 성인의 지방세포로부터 분리한 성체줄기세포를 이용하고 이는 지방조직 내에 존재하는 세포 중 간단한 정제과정을 거쳐서 획득이 가능하다. 지방조직의 획득에 대한 과정은 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입의 과정에서 폐기되었던 지방조직을 이용하는 것으로, 추가적인 침습적 시술이 필요 없기 때문에 그 유용성이 배가된다.

인간의 지방 조직을 국소마취 하에서 지방흡입으로 수득하고 지방조직의 세포외기질(extracellular matrix)을 콜라게나아제로 효소처리한 후 원심 분리하고 단핵세포, 적혈구 및 여러 가지 세포파편을 분리하여 줄기세포를 얻는다.

통상적으로 흔히 병의원에서 시행되는 지방흡입의 과정에서 얻어져 폐기되던 지방조직을 무균 상태로 수집하면 얻을 수 있고, 분리한 지방 흡입물에서 순수한 지방조직만을 분리한다.

분리된 줄기세포는 혈청을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)의 비유도성 배지에 배양하여 비접착성 세포들을 제거한다.

상기 과정으로 단리한 줄기세포를 3계대로 배양하고, 원심분리하여 상등액을 여과함으로써 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액을 수득한다.

지방세포로부터 성체줄기세포를 단리하고 배양하는 과정은 본 발명의 방법에 한정되지 않고 당업계에서 통상적으로 수행되는 방법으로 실시가능하다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액에 존재하는 미백활성 관련 단백질을 확인하기 위하여, LC-MS/MS를 실시하였다.

그 결과 지방유래 줄기세포 배양액에는 티로시나아제, TRP1 및 TRP 2를 억제하고 Mitf(microphthalmia-associated transcription factor)를 downregulation하거나, 멜라노좀을 전이하는데 관여하는 단백질이 다수 함유되어 있음을 확인하였다(표 1 참조).

따라서 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액은 피부의 색소침착을 예방하거나 치료하는 미백용 화장품에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명에서는 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액이 멜라닌 생성을 억제하고 티로시나아제 활성을 저해하는 지 확인하기 위하여, 멜라노마 세포주에 멜라닌 자극 호르몬과 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액을 처리한 다 음 생성된 멜라닌과 티로시나아제 활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액이 멜라닌의 생성을 억제하고 티로시나아제 활성을 억제하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4b 참조).

또한, 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액을 줄기세포와 함께 인체 피부에 투여한 결과 현저한 피부흑화 개선 효과를 보였다.

따라서 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 및 그 배양액은 피부의 색소 침착을 예방하거나 치료하는 미백용 화장품에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면 중간엽 성체줄기세포를 이용하여 인간의 성장인자를 포함한 배양액을 생산하여 멜라닌 합성 저해 및 티로시나아제 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 따라서 지방유래 줄기세포의 배양액 및 그로부터 분리한 단백질을 미백용도의 의약품, 의약부외품, 화장품 등에 적용하여 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같으며, 본 발명의 범위는 다음 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 지방줄기세포의 단리 및 배양

인간의 지방흡입물 10㎖ (리더스피부과, 서울)을 동일 부피의 인산화 완충 용액으로 세척하고 지방조직만을 분리하였다.

지방조직의 세포외기질을 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 45 분간 0.075 % 콜라게나아제로 효소처리하고, 최적의 효소 처리된 지방조직을 1200 g에서 5분간 원심분리하여 고밀도의 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 펠렛을 인산화 완충 용액으로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 기타 조직을 제거하고 Histopaque-1077(SIGMA)로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵세포만을 분리하였다.

분리된 단핵세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10 % fetal bovine serum(FBS), 1 % penicillin streptomycin이 포함된 배양액으로 37 ℃, 5 % CO₂, 배양기에서 24 시간 배양 후 비접착성 세포들을 제거함으로써 줄기세포를 10⁶ 개 단리하였다.

단리한 줄기세포가 10⁴ cells/㎖가 되도록 세포 부유액 10 ㎖를 T25 플라스크(면적 25 ㎠, 용량 50 ㎖)에 옮겨 상기 조건에서 배양하였다.

누적집단배증시간 (doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 80 % 합류(confluence) 때까지 유지하고 80 % 합류시기에 계대배양을 수행하였다.

계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 PBS로 세척하고 0.25 % Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포부유액을 원심분리 후, 세포수 측정과 viability 검사한 뒤 DMEM, 10 % FBS, 1 % penicillin streptomycin이 포함된 배양액에서 다시 3 배로 계대배양 하였다. 상기 과정을 3 번 반복하였다.

<실시예 2> 줄기세포 배양액 생산

<실시예 1>에서 단리, 계대배양된 지방유래 줄기세포 4× 10⁵ 개를 무혈청 배지인 DMEM/F12(Invitrogen-Gibco-BRL, Grand Island, NY)를 이용하여 72 시간 배양한 후, 배양액을 300 g, 5 분간 원심분리 하여 상등액을 0.22 ㎛ 주사식 여과기로 여과하여 지방줄기세포 배양액을 준비하였다.

<실시예 3> 지방줄기세포 배양액의 단백질 분석

3-1. 단백질의 트립신 분해

<실시예 2>에서 준비된 지방줄기세포 배양액을 동결건조기를 이용하여 동결건조 하였다. 건조된 분말을 멸균된 증류수에 용해시킨 후 고체상 추출 카트리지(Waters, USA)를 이용하여 단백질을 회수하였다. 단백질을 C18 역상 크로마토그래피 (Chromolith , Merck)를 이용하여 6 개의 군으로 분획하였다. 각 분획을 환원완충액(50 mM NH4HCO3, 2 mM DTT)을 이용하여 20 분간 56 ℃에서 환원시켰다. 환원된 단백질을 알킬화 완충액(50 mM NH₄HCO₃, 5 mM iodoacetamide)으로 37 ℃에서 15 분간 알킬화 한 후, 트립신으로 37 ℃에서 12 시간 분해하였다.

3-2. Q- TOF 를 이용한 LC - MS / MS 분석

트립신으로 분해한 각 군의 펩티드 분획을 Agilent 1100 LC system(Agilent, USA)을 Q-STAR Excel mass spectrometer(MDS Sciex, Toronto, Canada)와 연결하여 분리 분석 하였다. 결과는 Analyst QS software의 information-dependent acquisition mode를 이용하여 획득하였다.

다가이온은 MS/MS를 이용하여 선별하였다. 각 cycle은 1-s MS와, 3-s MS/MS로 구성하였고, acetonitrile의 12.5 %~40 %의 농도구배로 linear LC를 이용하여 90 분간 처리하였다.

각 전구이온은 tandem MS로 선택한 후 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다.

LC-MS/MS를 3회 분석하여 각 군의 펩티드 분획을 결정하였다.

3-3. Database 검색

LC-MS/MS결과를 MASCOT 검색엔진(Matrix Science, London, United Kingdom) 을 이용하여 human International Protein Index(IPI) 단백질 서열 database에서 검색을 하였다. MS의 정확도는 1200 ppm이고, MS/MS 정확도는 0.3 Da이며, 트립신 분해 오차 및 O-deoxy-carbamidomethylated 시스테인, 산화 메티오닌의 다양한 변형, N-말단 아세틸화 단백질수준에서 검색하였다.

database 검색결과 총 112개의 단백질을 동정하였고, 미백에 관련된 단백질을 선별하여 하기 표 1을 작성하였다.

지방줄기세포 배양액의 미백단백질

Hypopigmenting Mechanism	AC	Gene	MW	Description
티로시나아제, TRP1, TRP2 억제 Mitf downregulation	IPI00007793	IL6	23931	Interleukin-6 precursor
	IPI00302679	LTBP1	160801	Latent transforming growth factor beta binding protein 1 isoform LTBP-1S
	IPI00292150	LTBP2	204059	Latent transforming growth factor beta binding protein 2 precursor
멜라노좀 전이	IPI00302679	LTBP1	160801	Latent transforming growth factor beta binding protein 1 isoform LTBP-1S
멜라노좀 전이	IPI00292150	LTBP2	204059	Latent transforming growth factor beta binding protein 2 precursor

살펴본 바와 같이, 지방세포 유래 줄기세포 배양액에는 티로시나아제, TRP1 및 TRP 2를 억제하고 Mitf(microphthalmia-associated transcription factor)를 downregulation하거나, 멜라노좀을 전이하는데 관여하는 단백질이 다수 함유되어 있음을 알 수 있다.

<실시예 4> B16 세포주의 멜라닌 억제실험

설치류 멜라노마 세포주인 B16 세포주를 DMEM 배지에 10 % 우태혈청과 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ streptomycin을 첨가하여 37 ℃, 5 % CO₂, 조건에서 배양하였다.

배양된 B16 세포를 96-well 플레이트에 well 당 2ⅹ10³ 개의 세포를 접종하고, 멜라닌자극호르몬인 α-MSH 각각 100 nM 과 지방줄기세포 배양액 0 %, 10 %, 50 %, 100 %이 포함된 시료액 200㎕ 를 동시에 처리하였다. 72 시간 후에 CCK-8(Dojindo, Gaithersburg, MD) 용액 10ul을 각 well에 첨가 한 후 3 시간 동안 배양하여, microplate reader(TECAN, Grodig, Austria)로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 값은 표준곡선을 작성하여 보정하였다.

다음으로, 배양된 B16 세포를 plate에 1.5ⅹ10⁴ 개씩 접종한 후 실시예 2에서 수득한 지방줄기세포 배양액 10 ㎖을 각각 0 %, 10 %, 50 %, 100 % 씩 한 시간 동안 전 처리하고, α-MSH 100 nM 을 72시간 처리 후에 인산화완충용액으로 배지를 씻어준 후 멜라닌 추출용액(1N NaOH+50 % DMSO)을 well당 100 ㎕씩 첨가하여 80 ℃에서 세포를 용해시킨 후 마이크로플레이트 리더기로 492㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정하였다(도 3 참조).

그 결과 지방유래 줄기세포 배양액 50 % 또는 100 %를 α-MSH와 함께 처리한 군은 지방유래 줄기세포 배양액을 처리하지 않은 군에 비하여 현저한 멜라닌 생성 억제 효과를 보였다.

<실시예 5> 티로시나아제 억제실험

5-1 티로시나아제 활성실험

시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220㎕와 B16 세포에서 추출한 티로시나아제 20㎕ 그리고 버섯 티로시나아제 20㎕를 순서대로 넣었다. 이 용액에 1.5 mM 티로신 액 40 ㎕를 넣고 37 ℃에서 10～15분 동안 반응시키고, 이를 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실시예 4의 시료액을 각각 200㎕ 으로 티로신 액을 처리하기 전 에 처리하였고, 공시료액으로는 시료액 대신 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5)을 넣었다.

그 결과 도 1에서 나타난 바와 같이, 그 결과 지방유래 줄기세포 배양액 50 % 또는 100 %를 α-MSH와 함께 처리한 군은 지방유래 줄기세포 배양액을 처리하지 않은 군에 비하여 현저한 티로시나아제 활성 저해 효과를 보였다.

5-2 티로시나아제 억제실험

시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 7.0) 850 ㎕와 상기 실시예 4의 시료액 50 ㎕ 그리고 버섯 티로시나아제 50 ㎕를 순서대로 넣고 37 ℃에서 6 분 동안 반응시켰다. 이 용액에 0.06 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)용액 50 ㎕를 넣은 다음 37 ℃에서 1 분 동안 반응시킨다. 공시료액으로는 0.1 M 인산염완충액(pH 7.0)을 넣었다. 실험 종료 후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 475㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 줄기세포 배양액을 첨가한 군에서 용량에 비례하여 티로시나아제의 활성을 저해하는 것을 확인하였다.

<실시예 6> 티로시나아제의 Western blot 분석

배양된 B16 세포를 plate에 1.5ⅹ10⁵ 개씩 접종한 후 지방줄기세포 배양액 10㎖ 을 각각 0 %, 10 %, 50 %, 100 % 씩 두 시간 동안 전 처리 후, 실시예 4의 시료액을 10㎖ 처리하였다.

48 시간 후에 세포를 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 % SDS, 50 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 5 mM dithiothreitol, 1 ㎍/㎖ leupeptin and 20 ㎍/㎖ PMSF, pH 7.4)을 이용하여 분해하여 단백질을 얻었다. 25 ㎎의 단백질을 8 % SDS-polyacryamide gel electrophoresis를 이용하여 분리하였다. 단백질이 분리된 젤을 PVDF막에 전이시켰다. PVDF막을 anti-티로시나아제(1:500배 희석) 항체, α-tubulin 항체(1:10,000배 희석)로 배양한 후, horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG 항체(1:10,000 dilution)로 다시 배양하였다. 획득한 band를 immunobilon western reagent로 X-ray 필름에 노출시켜 결과를 확인하였다.

그 결과 도 4a에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액을 50 % 또는 100 % 처리한 군에서는 티로시나아제가 검출되지 않았으며, 도 4b에서 확인할 수 있는 바와 같이 티로시나아제의 발현이 현저히 저해되었다.

<실시예 7> 지방유래 줄기세포 배양액의 도포를 통한 미백효과

본 효능 테스트는 시험 연구(pilot study)로 강북삼성병원 의학연구윤리심의위원회의 승인 하에 진행되었다. 효능 테스트의 목적은 현재 피부 노화가 진행 중인 환자들에서 지방유래 줄기세포 배양액의 미백 효과를 평가하기 위함이다.

효능 테스트의 방법은 만 20세 이상 75세 이하의 성인 남성 및 여성 중 색소질환에 있어서 미백 개선을 원하는 건강한 자원자를 대상으로 하였다.

구체적으로, 실시예 2에서 분리한 지방줄기세포배양액 6 ㎖을 준비하였고, 환자가 개선을 원하는 부위에 골고루 도포해준 후 마이크로 니들로 문질러 주었다. 이와 같은 방법으로 2주에 1회 시술하였고, 매번 디지탈 사진을 관찰하고 미백 효과를 측정하였다. 3회 이상 치료를 받은 사람을 대상으로 하였다.

유효성을 평가하기 위하여 Clinical Suite Skin Analyzer를 이용한 디지탈 사진 측정 및 표 2의 효능 평가 스코어에 의한 평가를 하여 분석하였다.

효능 평가 스코어

등 급	기 준
매우 좋음 (4)	76% 이상 호전됨
좋 음 (3)	51% ~ 75% 호전됨
보 통 (2)	26% ~ 50% 호전됨
나 쁨 (1)	25% 이하 호전됨
악 화 (0)	변화 없거나 더 심해짐

그 결과 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 지방유래 줄기세포 배양액은 피부흑화를 개선할 수 있었고, 표 3에서와 같이 지방유래 줄기세포 배양액을 투여한 결과 87.9%의 피험자에서 26% 이상 호전되었다.

지방유래 줄기세포 배양액 투여결과

개선정도	악 화	나 쁨	보 통	좋 음	매우 좋음	합 계
피험자수	3	8	25	41	14	91
백분율	3.30%	8.79%	27.47%	45.05%	15.38%	100.00%

도 1은 지방유래 줄기세포 배양액의 티로시나아제 활성 억제 그래프이며, 이 때 AAPE는 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액을 의미하는 것이고,

도 2는 지방유래 줄기세포 배양액의 버섯 티로시나아제 활성 억제 그래프이고,

도 3은 지방유래 줄기세포 배양액의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 그래프이고,

도 4a는 지방유래 줄기세포 배양액을 첨가한 B16 세포의 티로시나아제 Western blot 결과이고,

도 4b는 지방유래 줄기세포 배양액을 첨가한 B16 세포에서 마커단백질 대비 티로시나아제의 생성억제 정도를 나타낸 그래프이고,

도 5는 지방유래 줄기세포 배양액을 인체 피부에 주사한 결과를 나타내는 사진이다.

Claims

줄기세포 배양액 또는 그 배양액에서 분리된 단백질을 포함하는 미백용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 줄기세포는 포유동물에서 유래된 성체줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 화장료 조성물.
제 2 항에 있어서, 성체줄기세포는 지방조직, 골수조직 및 제대혈로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 줄기세포인 화장료 조성물.