KR101063299B1

KR101063299B1 - 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101063299B1
Application number: KR1020080091076A
Authority: KR
Inventors: 이계호; 김봉휘; 송지훈; 정문주; 최은희
Original assignee: 주식회사 에스티씨라이프
Priority date: 2008-09-17
Filing date: 2008-09-17
Publication date: 2011-09-07
Also published as: KR20100032099A

Abstract

본 발명은 포유동물에서 유래한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부주름개선용 또는 피부노화억제용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 상기 줄기세포는 포유동물의 지방, 양막, 제대혈 또는 골수에서 유래한 것으로 특히 자가 유래의 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물은 피부노화방지 및 피부 주름개선에 뛰어난 효과를 갖는다.

줄기세포, 피부, 노화, 주름, 화장료

Description

줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition Comprising Stem cells-Conditioned Media}

본 발명은 포유동물에서 유래한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부주름개선용 또는 피부노화억제용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 크게 두 가지로 나누어서 연구되고 있는데 하나는 내적 노화로 연령의 증가에 따른 노화현상과 다른 하나는 외적 노화로 외부환경 즉 자외선이나 공해 등으로 인한 노화현상을 말한다.

피부노화에 관하여서는 지금까지 여러 이론이 제시되고 있으나 그 중 피부 노화에 가장 과학적으로 접근된 이론은 산화에 의한 피부노화 이론이다. 사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데 그 중 각질층은 표피의 기저세포인 케라티노사이트의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 또한 피부의 내부에 존재하는 진피층은 탄력섬유로 알려진 콜라겐과 엘 라스틴으로 구성되어 있어 피부의 탄력을 주어 피부가 처지지 않도록 지켜주는 역할을 담당하고 있다.

항산화이론은 이와 같은 탄력섬유인 콜라겐과 엘라스틴이 외부의 자외선 등의 인자들에 의해 생성된 프리라디칼에 의해 손상 받게 되고 이에 따라 피부의 탄력이 감소되어 주름이 생성된다는 이론이다. 지금까지는 이와 같은 피부의 노화, 특히 주름을 방지하기 위해 레티놀과 같은 물질이나 식물추출물 등을 사용해 왔었다. 그러나 이 물질들은 그 효과가 낮거나 피부자극, 발적, 염증을 유발시켜 피부에 대한 부작용이 심각한 단점을 갖고 있다.

또한, 최근 들어 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 우리 생체내에 존재하는 소량의 신호물질(성장인자)들을 발견하게 되었으며 이를 기반으로 한 생체의 노화이론이 재정립되고 있는 중이다(Stanley Corhen, Nobel Lecture 1986, Dec,8). 또한 이 신호물질(성장인자)은 나이가 증가함에 따라 생체내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 인간의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다(Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 95/1, 1990 RichardE. Fitzpatrick).

이에 본 연구자는 피부 항노화 물질, 특히 피부 주름의 개선 물질을 찾고자 노력하던 중 지금까지 화장품으로 적용하지 않았던 줄기세포 배양액이 이러한 목적에 부합되어 피부주름 개선효과, 피부노화 완화용 화장품 조성물의 유효 성분으로 효과적으로 사용될 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 목적은 포유동물 유래의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부주름개선용 또는 피부노화억제용 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인간의 지방, 양막, 제대혈 또는 골수에서 추출된 중간엽 줄기세포를 적정한 배지 및 조건에서 배양한 줄기세포 배양액을 화장료 제형으로 제조할 경우, 피부주름 개선효과 및 피부노화 억제 효과를 가짐을 확인하였다.

특히 본 발명의 일 실시예에서는 각 줄기세포 배양액 내 콜라겐량을 측정(표 1 참고)하고, 각 줄기세포 배양액을 인간 섬유아세포를 배양하고 있는 배양배지에 소량 첨가한 후 24~48시간 배양하여 섬유아세포에서 콜라겐 합성이 증가됨(도 2)을 확인함으로써, 피부주름 개선효과 및 피부노화억제 효과를 확인하였다.

따라서, 본 발명은 포유동물에서 유래한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부주름개선 또는 피부노화억제용 화장료 조성물을 제공한다.

바람직하게는 상기 줄기세포는 포유동물의 지방, 양막, 제대혈 또는 골수에서 유래한 것이며, 특히 자가 유래의 줄기세포인 것이 가장 바람직하다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 배양액은 상기 줄기세포에서 분비된 사이토카 인이 포함되며, 바람직하게는 상기 사이토카인은 MCP-2 (Monocyte chemotactic protein-2), MCP-4 (Monocyte chemotactic protein-4), MDC (Macrophage Derived Chemokine), NAP-2 (Neutrophil-activating peptide-2), ICAM-1 (Intercellulat adhesion molecule-1/CD54), MIP-1α (Macrophage inflammatory protein 1 alpha), MIP-1β (Macrophage inflammatory protein 1 beta), sTNF-RII (soluble tumour necrosis factor receptor II), sTNF-RI (soluble tumour necrosis factor receptor I), TIMP-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinase 1), TIMP-2 (Tissue inhibitor of metalloproteinase 2), uPAR (urokinase type plasminogen activator receptor), CD14 (LPS-R lipopolysaccharide receptor), CXCL-16 (Chemokine(C-X-C motif) ligand 16), MMP-9 (Metrix metallopeptidase 9), PDGF-AA (Platelet-derived growth factor AA) 및 TGF β2 (Transforming growth factor-beta2) 로 이루어진 그룹에서 둘 이상 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물로 제조되는 화장품 제형은 특별히 제한되지 않으며, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이에센스, 아이크림, 로션 또는 팩 등을 예시할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 정제수, 보습제, 고급알코올, 고급지방산, 연화제(emollient), 킬레이트제, 점증제, 영영성분, pH조절제, 향료 등을 임의로 추가할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 pH는 5.0 내지 8.0로 유지하는 것이 바람직 하며, pH조절제는 0.001 내지 50 중량부로 포함될 수 있다.

상기 보습제는 수용성 저분자 보습제, 지용성 저분자 보습제, 수용성 고분자 보습제, 지용성 고분자 보습제 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 보습제는 부틸렌 글리콜(Butylene Glycol), 글리세린(Glycerin)으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택할 수 있으며 0.01 내지 10 중량부로 포함될 수 있다.

상기 고급알코올은 탄소수 12 내지 20인 알코올 중에서 선택된 1종 이상 사용할 수 있으며, 0.1 내지 5 중량부로 포함될 수 있다.

상기 고급지방산은 탄소수 12 내지 20인 알코올 중에서 선택된 1종 이상 사용할 수 있으며, 0.1 내지 5 중량부로 포함될 수 있다.

상기 에몰리언트제로는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레트테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아린산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 예시할 수 있다. 또한, 상기 연화제는 식물성, 광물성, 실리콘유, 합성유 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 1.0 내지 25 중량부로 포함될 수 있다.

상기 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세틱 엑시드(Ethylene Diamine Tetraacetic, EDTA)를 사용할 수 있으며, 0.001 내지 0.5 중량부로 포함될 수 있다.

상기 점증제는 유화 또는 가용화 후 점도를 조절하는 기능을 하는 것으로 0.001 내지 5 중량부로 포함될 수 있으며 통상적으로 점증제는 카보머, 산탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스 중에서 선택하여 사용할 수 있다.

상기 영양성분은 화장료에 기능을 부가하기 위한 부분으로 생리활성물질 0.01 내지 30 중량부로 포함될 수 있으며 생리활성물질은 비타민B군, 비타민C군, 수용성 비타민, 레티놀등의 비타민류와 로즈워터, 피톤치드 워터, 마치현추출물등의 천연추출물과 피부의 물질 대사를 자극하여 피루브산 합성을 촉진시키며, 콜라겐 및 엘라스틴 등의 단백질 합성을 유도하는 유기 금속 화합물로 쿠퍼글루코네이트, 징크글루코네이트, 마그네슘글루코네이트, 마그네슘아스파테이트로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.

상기에서 설명한 바와 같이 인간의 지방, 양막, 제대혈 또는 골수에서 분리된 줄기세포를 적정한 배지 조건하에서 배양한 배양액은 피부 주름을 개선하고, 피부 노화를 억제할 수 있다.

이하, 실험예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 줄기세포의 분리 및 배양

1-1 인간 지방유래 줄기세포는 지방 흡입물로부터 분리하였다. 지방 흡입물을 동일 부피의 PBS로 세척하고 지방 조직만을 분리하였다. 지방조직의 세포외기질을 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 60 분간 0.075 % 콜라게나아제로 효소 처리한 후 1200 rpm에서 3분간 원심분리하여 줄기세포를 포함한 세포 분획을 수득하였다. 펠렛을 인산화 완충 용액으로 세척하고 100㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 기타 조직을 제거하고 분리된 단핵세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Invitrogen), 10 % fetal bovine serum(FBS, Invitrogen), 1 % penicillin streptomycin(Invitrogen) 이 포함된 배양액으로 37 ℃, 5 % CO₂, 배양기에서 24 시간 배양 후 비접착성 세포들을 제거함으로써 줄기세포를 분리하였다. 분리한 줄기세포가 10⁴ cells/㎖가 되도록 세포 부유액 10 ㎖를 T25 플라스크에 옮겨 상기 조건에서 배양하였다.

1-2 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 제대혈로부터 분리하였다. 제대혈에서 단핵구를 분리하기 위해, aMEM(alpha-minimum essential medium, Invitrogen)으로 제대혈을 2 배 용량으로 희석한 후 50 ㎖ 코니칼 튜브에 옮겨 실온에서 10 분간 300 x g로 원심분리하였다. 분리된 buffy coat 층을 수확하여 다시 2 배 용량의 aMEM으로 희석한 후 Ficoll-Hypaque에 중첩하고 실온에서 30 분간 300 x g로 원심 분리를 시행하여 비중차를 이용하여 분리하였다. 이와 같은 밀도 구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 aMEM에 넣어 10 분간 200 x g로 원심 분리한 후, 세포 침전물을 제외한 배지를 제거한다. 위의 과정을 일회 반복한 후 항생제와 항진균제 그리고 2 mM의 글루타민 (Glutamine, Sigma)이 포함된 aMEM 배지에 10% 우태혈청(FBS)과 함께 세포성장인자를 첨가하여 일정농도의 세포로 부유시켰다. 2일 간격으로 부착되지 않은 세포들을 다른 용기로 옮겨 부착을 유도한다.

1-3 양막유래상피모세포는 양수를 싸고 있는 양막으로부터 분리하였다. 양막 조직을 동일 부피의 인산화 완충 용액으로 세척하고 0.05 % 콜라게나아제를 함유하고 있는 배지(DMEM)내에서 잘게 세절한 후 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 60 분간 효소 처리한다. 효소 처리한 조직을 지름 100㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 조직만을 분리하여 이를 조직 배양(tissue culture)한다. 이때 사용되는 배지는 성장인자가 포함된 DMEM 배지이며 10 %의 FBS가 포함되어 있다.

도 1에는 본 실험예에 의하여 배양한 줄기세포를 나타내었다.

<실험예 2> 줄기세포 배양액 생산

상기 <실험예 1>에서 분리 배양된 줄기세포 1ㅧ 10⁶ 개를 무혈청 배지인 DMEM를 이용하여 72 시간 배양한 후, 배양액을 1500 rpm, 5 분간 원심분리 하여 상등액을 0.22㎛ 주사식 여과기로 여과하여 줄기세포 배양액을 준비하였다.

<실험예 3> 줄기세포 배양액에 존재하는 콜라겐 정량

본 실험예에서는 주름개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있는 화장품 원료인 콜라겐이 각 줄기세포 배양액내에 얼마나 존재하는지를 확인하기 위하여 콜라겐 정량 분석을 하였다.

구체적으로는, 상업적으로 구입이 가능한 콜라겐 키트(Sircol™ collagen assay kit)를 이용하여 줄기세포 배양액내에 존재하는 콜라겐의 농도를 측정하였다. 즉, 콜라겐에서 특이적으로 발견되는 [Gly-X-Y] n 삼중나선 구조에 특이적으로 결합하는 염색시약의 발색반응을 분광분석기를 사용하여 흡광도(OD 540 : 540 nm에서의 흡광도)를 측정함으로써 합성된 콜라겐량을 계산하였다. 각 줄기세포 배양액에 존재하는 콜라겐의 양은 하기 표 1에 나타내었다.

	Cord blood MSC	Adipose MSC	Epithelial stem cell
Collagen	90 μg/ml	250μg/ml	100 μg/ml

<실험예 4> 줄기세포 배양액의 콜라겐 합성 효과 측정

본 실험예에서는 줄기세포 배양액의 피부 노화 억제제로서의 유효성을 확인하기 위하여 콜라겐 합성율을 인간 유래의 섬유아세포를 이용하여 측정하였다.

구체적으로는, 피부로부터 분리된 10⁴ 개의 정상 인간 섬유아세포(normal human fibroblast)를 6-웰 플레이트에서 24 시간 배양한 후, 시료를 100∼1000 μl로 처리하였다. 48 시간 배양한 후, 섬유아세포가 새롭게 합성 분비한 콜라겐의 양을 상업적으로 입수 가능한 콜라겐 키트(Sircol™ collagen assay kit)를 이용하여 측정하였다.

즉, 콜라겐에서 특이적으로 발견되는 [Gly-X-Y] n 삼중나선 구조에 특이적으로 결합하는 염색시약의 발색반응을 분광분석기를 사용하여 흡광도(OD 540 : 540 nm에서의 흡광도)를 측정함으로써 합성된 콜라겐량을 계산하였다. 그 후, 콜라겐 합성 증가율은 대조군(무첨가)에 대한 상대적인 합성능의 % 값으로 계산한 결과, 합성능이 40% 이상 증가되었다 (도 2).

<실험예 5> 단백질 어레이 방법을 이용한 줄기세포 배양액에 존재하는 성장인자 분석

본 실험예에서는 제대혈, 지방유래줄기세포 및 배양액내에 전체 단백질의 농도가 2 mg/ml 이상인 배양액을 이용하여 상업적으로 입수 가능한 분석 키트(레이바이오, 어레이 키트)를 이용하여 배양액에 존재하는 사이토카인을 분석하였다.

분석 방법은 키트와 같이 제공되는 매뉴얼에 따랐으며 발색 후 관찰은 LAS4000 (후지, 일본)을 이용하였다. 구체적으로는 다양한 종류의 사이토카인 항체가 찍혀 있는 멤브레인을 비특이적 결합을 불가능하게 하기 위하여 블로킹 버퍼를 이용하여 블로킹한 후 줄기세포 배양액이 존재하는 용기에 넣어 4 ℃에서 18시간 이상 결합시켰다. 이후 멤브레인을 깨끗이 세척한 후 비오틴-스트렙타비딘 결합 원리를 이용하여 항체에 결합한 항원을 발색시켰다.

이 실험예에서는 인간 피부로부터 분리한 섬유아세포 배양액을 대조군으로 이용하여 실시하였으며 섬유아세포에 존재하지 않으며 동시에 줄기세포에서 공통적으로 혹은 단일 존재하는 단백질들을 도 4에 정리하였다. 이 실험의 결과 제대혈을 포함하는 줄기세포에서만 특이적으로 발현하는 사이토카인은 약 20여 종류였으며 각 줄기세포에서 공통적으로 존재하는 것은 약 10여 종이었다. 정확도를 기하기 위하여 실험은 동일한 방법을 이용 3회 반복되었다.

실험에 의하여 얻어진 사이토카인, 성장인자 어레이 결과는 도 3에 나타내었으며, 도 4에서는 각 줄기세포에서만 특이적으로 또한 공통적으로 발현하는 10여종의 사이토카인을 나타내었다.

<실험예 6> 샌드위치 ELISA 방법을 이용한 줄기세포 배양액에 존재하는 성장인자 분석

본 실험예에서는 제대혈, 지방유래줄기세포 및 양막 상피 모세포를 배양하여 수거한 배양액내에 전체 단백질의 농도가 2 mg/ml 이상인 배양액을 이용하여 상업적으로 입수 가능한 분석 키트(Quantikine Immunoassay, R&D system)를 이용하여 배양액에 존재하는 PDGF, EGF와 HGF의 양을 정량 분석하였다.

분석 방법은 근본적으로 샌드위치 ELISA 이며 키트와 제품과 같이 제공되는 매뉴얼에 따랐다. 구체적으로는 각 성장인자의 단일클론 항체가 코팅되어 있는 96-웰 플레이트에 줄기세포 배양액을 첨가하여 결합을 유도한 후 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위하여 플레이트를 세척한 후 발색을 위한 효소가 결합되어 있는 특이적인 항체를 결합시킨 후 세척한다.

이렇게 준비된 시료를 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량 분석하였으며 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 정확도를 기하기 위하여 실험은 3회 이상 반복되었다.

	Cord blood MSC	Adipose MSC	Epithelial stem cell
EGF	3 pg/ml	2 pg/ml	4 pg/ml
PDGF	40 pg/ml	40 pg/ml	10 pg/ml
HGF	500 pg/ml	500 pg/ml	500 pg/ml

<실시예 1> 제대혈 중간엽 줄기세포 배양액을 이용한 화장료 제조

하기 표 3에 나타낸 성분들을 혼합하여 각각 로션(실시예 1-1), 크림(실시 예 1-2) 제형의 화장료 조성물을 제조하였다.

성 분	실시예 1-1 (로션)	실시예 1-2(크림)
글리세린	3	5
부틸렌글리콜	3	3
디쇼듐이디티에이	0.05	0.05
트리에탄올아민	0.1	0.1
세탄올	0.5	2
스테아린 산	0.5	1.5
글리세릴 스테아레이트	1	1
피이지(100) 스테아레이트	1	1
스쿠알란	3	5
트리에틸헥사노인	1.5	2
옥틸도데칸올	2	3
디메치콘	0.5	1
사이클로메치콘	2	3
카보머	0.1	0.1
로즈워터	5	5
피톤치드워터	3	3
유기금속화합물	0.5	0.5
줄기세포배양액	10	5
향 료	적 량	적 량
방부제	적 량	적 량
정제수	잔 량	잔 량

<실시예 2> 제대혈 중간엽 줄기세포 배양액을 이용한 화장료 제조

하기 표 4에 나타낸 성분들을 혼합하여 스킨(실시예 2-1), 에센스(실시예 2-2) 제형의 화장료 조성물을 제조하였다.

성 분	실시예 2-1(스킨)	실시예 2-1(에센스)
글리세린	3	3
부틸렌글리콜	2	3
디쇼듐이디티에이	0.05	0.05
카보머	-	0.05
쇼듐 히아루로네이트	0.1	0.1
로즈 워터	5	5
피톤치드 워터	10	10
마치현추출물	5	5
트리에탄올아민	-	0.05
줄기세포배양액	30	20
방부제	적 량	적 량
향 료	적 량	적 량
정제수	잔 량	잔 량

<비교예 1>

하기 표 5에 나타낸 성분들을 혼합하여 스킨 제형의 화장료 조성물을 제조하였다. 이때, 비교에서는 실시예에서 사용하였던 성장인자들을 제외하였다.

성 분	비교예 1
글리세린	3
부틸렌 글리콜	2
디쇼듐 이디티에이	0.05
카보머	-
쇼듐 히아루로네이트	0.1
로즈 워터	5
피톤치드 워터	10
마치현 추출물	5
트리에탄올아민	-
방부제	적 량
향 료	적 량
정제수	잔 량

<실험예 7> 제대혈 중간엽 줄기세포 배양액을 성분으로 하는 화장조성료의 주름 개선 효과 확인을 위한 관능 평가.

<실시예 2-1>과 <비교예 1>의 스킨제형의 화장료에 대하여, 주름 개선 효과를 평가하기 위하여 아래와 같이 관능평가를 실시하였다.

우선, 21~60 세에 속하는 여성 20명을 피실험 대상으로 구성하였다. 피실험대상의 얼굴을 깨끗하게 세안한 후, 우측 얼굴에 실시예 3의 화장료 0.5g 을 눈가, 볼 등에 균일하게 도포하였으며, 좌측 얼굴에 비교예 1의 화장료 0.5g 을 눈가, 볼 등에 균일하게 도포하였다. 이로부터 7일 간격으로 8주 동안 피부 보습 정도, 탄력감, 주름개선효과, 피부 자극 정도 및 사용감을 관능 평가하도록 하였고, 그 결과를 하기 표 6(실시예 2-1) 및 표 7(비교예 1)에 나타내었다.

이때, 느껴지는 효과가 우수할 경우에는 5 점, 전혀 효과가 느껴지지 않을 경우에는 0 점으로 하여 각각 6 단계로 평가하도록 하였다(단, 피부 자극 정도 및 사용감은 자극이 없거나 사용감이 우수한 경우를 0 점, 자극이 심하거나 사용감이 나쁠 경우를 5 점으로 나타내었다.).

평 가 항 목	실시예 2-1
평 가 항 목	4주차	8주차
피부 보습 정도	3.5	4.1
탄력감	2.5	3.4
주름 개선 효과	2.3	3.8
피부 자극 정도	0.0	0.0
사용감	0.5	0.5

평 가 항 목	실시예 2-1
평 가 항 목	4주차	8주차
피부 보습 정도	2.5	2.6
탄력감	1.2	1.4
주름 개선 효과	0.5	0.8
피부 자극 정도	0.0	0.0
사용감	0.5	0.5

상기 표 6 및 7에 나타낸 바와 같이 <실시예 2-1> 은 <비교예 1>과 비교할 때 도포 후 시간이 경과함에 따라 주름 개선 효과가 우수하였으며, 피부 보습력과 탄력이 우수하였다. 그에 비하여 <비교예 1>은 주름 개선 효과, 탄력감이 떨어지는 것으로 나타났다.

<실험예 8> 제대혈 중간엽 줄기세포 배양액을 성분으로 하는 화장조성료의 주름 개선 효과

줄기세포의 <실시예 2-1> 및 <비교예 1> 의 스킨제형의 화장료에 대하여 시간경과에 따른 "피부 주름 개선 정도"를 측정하였다. 이때 "피부 주름 개선 정도"는 눈옆 부위를 사진으로 촬영하여 육안으로 확인하였다.

구체적으로 실험예 1 의 피실험대상자의 얼굴을 깨끗하게 세안한 후, 양쪽 눈가를 촬영하여 실험 전 피부상태를 측정하였다. 한편, 우측 얼굴에 <실시예 2-1>의 화장료 0.5g 을 눈가, 볼 등에 균일하게 도포하였으며, 좌측 얼굴에 <비교예 1>의 화장료 0.5g 을 눈가, 볼 등에 균일하게 도포하였다. 이로부터 7일 간격으로 8주 동안 사진 촬영을 실시하였으며 "피부 주름 개선 정도"를 사진으로 촬영하여 육안으로 확인하였다.

사용된 기기는 비디오 마이크로 스코프 콩(Video Micro Scope KONG, 제조사 : 봄텍전자㈜)이며, 좌측 눈옆(A), 우측 눈옆(B)에 대하여 각각 확대 촬영하여 육안으로 피부 주름 개선 정도를 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 줄기세포배양액을 포함하지 않은 <비교예 1>을 도포한 경우에는 주름개선효과가 거의 나타나지 않았으나, 줄기세포배양액을 포함하는 <실시예 2-1>을 도포한 경우에는 주름개선에 있어 확연한 효과를 확인할 수 있었다.

<실험예 9> 자가 유래 줄기세포 배양액을 성분으로 하는 화장조성료의 주름 개선 효과 확인을 위한 관능 평가

자신의 지방으로부터 줄기세포를 분리 배양하는 것이 가능한 지방유래줄기세포 배양액을 이용하여 맞춤형 화장료를 생산하고, 주름 개선 효과 확인을 위하여 관능 평가를 실시하였다.

관능 평가에 사용된 화장료는 실시예 2-1을 이용하였으며, 맞춤형 화장료의 효과를 평가하기 위하여 제대혈 유래 줄기세포 배양액이 포함된 화장료와 자가 지방유래 줄기세포 배양액이 포함되어 있는 화장료를 생산하였으며 평가는 아래의 과정으로 진행되었다.

21~60 세에 속하는 여성 16명을 피실험 대상으로 구성하였다. 피실험대상자들 중 4명을 선발하여 소량의 지방을 흡입하였으며 흡입한 지방으로부터 지방유래줄기세포를 분리 배양하여 이로부터 화장료를 생산하였다.

피실험대상자들의 얼굴을 깨끗하게 세안한 후, 우측 얼굴에 제대혈 유래 줄기세포 배양액을 포함하는 실시예 2-1의 화장료 0.5g을 눈가, 볼 등에 균일하게 도포하였으며, 좌측 얼굴에는 지방 유래 줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 0.5g을 눈가, 볼 등에 균일하게 도포하였다.

이로부터 7일 간격으로 4주 동안 피부 보습 정도, 탄력감, 주름개선효과, 피부 자극 정도를 관능 평가하도록 하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 아래의 결과에서 지방유래줄기세포 배양액에서 더 효과가 있다고 평가한 5명 중 4명은 모두 자가 지방 줄기세포를 이용한 화장료로 평가를 한 실험군이다.

따라서 자가유래의 맞춤형 줄기세포 화장품 개발이 의미를 가질 것으로 예상된다.

(단, ‘=’는 관능평가결과 어느 한 쪽의 선별이 불가한 경우이다.)

본 발명은 일 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

상기에서 설명한 바와 같이 포유동물의 지방, 제대혈, 양막 또는 골수로부터 유래한 줄기세포 배양액은 피부노화방지 또는 주름개선용 화장품에 적용하여 산업상 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 분리 및 배양된 지방유래 줄기세포, 제대혈유래 중간엽 줄기세포 및 양막유래 상피모세포를 나타낸 것이다.

도 2는 각 줄기세포 배양액에 존재하는 콜라겐의 양을 대조군에 대한 상대적인 합성능 백분율로 나타낸 것이다.

도 3은 줄기세포 배양액 내 사이토카인, 성장인자에 대한 어레이 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 사이토카인(노란색 표시)을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물에 따른 피부주름 개선에 관한 육안관찰결과를 나타낸 것이다.(단, A는 줄기세포배양액을 포함하는 화장료 조성물, B는 줄기세포배양액을 포함하지 않는 화장료 조성물에 따른 결과이다.)

Claims

MCP-2 (Monocyte chemotactic protein-2), MCP-4 (Monocyte chemotactic protein-4), MDC (Macrophage Derived Chemokine), NAP-2 (Neutrophil-activating peptide-2), ICAM-1 (Intercellulat adhesion molecule-1/CD54), MIP-1α (Macrophage inflammatory protein 1 alpha), MIP-1β (Macrophage inflammatory protein 1 beta), sTNF-RII (soluble tumour necrosis factor receptor II), sTNF-RI (soluble tumour necrosis factor receptor I), TIMP-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinase 1), TIMP-2 (Tissue inhibitor of metalloproteinase 2), uPAR (urokinase type plasminogen activator receptor), CD14 (LPS-R lipopolysaccharide receptor), CXCL-16 (Chemokine(C-X-C motif) ligand 16), MMP-9 (Metrix metallopeptidase 9), PDGF-AA (Platelet-derived growth factor AA) 및 TGF β2 (Transforming growth factor-beta2) 의 사이토카인을 포함하는 포유 동물에서 유래한 제대혈 유래 줄기세포 배양액을 유효성분으로 하는 피부주름개선용 또는 피부노화억제용 화장료 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 화장료는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이에센스, 아이크림, 로션 또는 팩 제형을 가짐을 특징으로 하는 조성물.