KR20240028586A - 인간 세포 유래 미세소포체 및 히알루론산 또는 콜라겐을 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
인간 세포 유래 미세소포체 및 히알루론산 또는 콜라겐을 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자연살해세포, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포 배양액으로부터 분리한 미세소포체와 히알루론산 및/또는 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 화장용 또는 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 피부 섬유아세포의 증식을 촉진시킴으로써, 피부 상처, 피부 질환 또는 피부 상태를 개선, 예방 또는 치료하기 위한 화장용 및 약학 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 자연살해세포, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포의 배양물로부터 분리된 미세소포체; 및 히알루론산 및/또는 콜라겐을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
현대인들의 생활수준 향상과 더불어 노령인구가 증가함에 따라 노화방지, 주름개선, 미백, 자외선차단 등과 관련된 기능성 화장품에 대한 관심과 수요가 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 기초 화장품 또는 기능성 화장품은 대부분 화학물질로 제조되기 때문에 인체에 대한 안정성 문제가 꾸준히 제기되었다. 이에 따라, 천연, 유기농 원료를 함유한 제품에 대한 관심이 증가하고 있으며, 관련 제품의 시장 규모 또한 증가하고 있다.
한편, 인간 배아줄기세포 배양액을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물(한국 공개특허 제10-2015-0039343호), 포유동물에서 유래한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부주름개선용 또는 피부노화억제용 화장료 조성물(한국 등록특허 제10-1063299호) 등이 개발된 바 있다. 그러나, 인간 배아줄기세포를 이용한다는 점에서 윤리적인 문제가 있었으며, 그의 효과가 미미하다는 문제점 등이 제기되었다.
특히, 줄기세포 배양액에는 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다. 따라서, 줄기세포 배양액을 이용하기 위해서는 노폐물이나 각종 위험 성분을 제거하기 위한 별도의 공정이 필요하고 이에 따라 생산 비용이 증가하는 문제점도 발생한다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 거동을 제어하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 세포외 소포체는 세포간 정보교환을 위해 세포에서 분비하는 막구조의 소포체의 총칭으로, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 미세소포체(microvesicles), 미세입자(microparticle), 세포자멸체(apoptotic body) 등을 포함한다.
그러나, 일부 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료에 응용할 수 있는 연구는 미비하다. 또한, 엑소좀의 경우 분리/정제가 복잡하고 단백질을 생산할 수 있는 mRNA보다는 유전자 발현을 조절하는 miRNA가 대부분 차지하고 있다. 반면 미세 소포체의 경우 생물학적 기능에 직접 관여할 수 있는 mRNA가 주로 함유되어 있으며, 분리 방법도 엑소좀에 비하여 빠르고 간편하다. 그럼에도 불구하고 대부분의 분비체 연구는 엑소좀을 이용한 연구에 치중되어 있다. 따라서, 미세소포체를 이용한 피부 질환 치료에 응용할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자는 세포 분비물(secretome)을 이용한 피부 상태를 개선 및 피부 질환을 치료하는 물질을 개발하기 위해 연구하던 중, 자연살해세포, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분리된 미세소포체가 피부 세포의 증식능을 효율적으로 촉진시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 인간 유래 세포로부터 분리된 미세소포체(microvesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장용 조성물, 및 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 자연살해세포, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포 배양액으로부터 분리한 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 섬유아세포의 증식을 촉진시켜 피부 상처 회복능을 향상시켰다. 또한 상기 미세소포체를 히알루론산 또는 콜라겐과 함께 병용 처리 시, 히알루론산 또는 콜라겐의 단독 처리에 비하여 상승된 피부 섬유아세포의 증식 촉진 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 의한 조성물은 외부 손상에 의한 피부 상처, 피부 질환 및 피부 상태를 개선, 예방 또는 치료하기 위한 화장용 및 약학 조성물로 유용하게 활용되어 새로운 치료제 및 화장품으로 사용될 수 있으며, 현재 사용되는 피부 연고 및 기능성 화장품의 첨가제로 유용하게 활용될 것이다.
도 1은 자연살해세포, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 미세소포체(microvesicles, MVs)를 분리하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 자연살해세포(상단) 또는 유도만능줄기세포(하단)의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(MVs)의 크기를 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)을 통해 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 자연살해세포, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(MVs) 및 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 또는 콜라겐(collagen)이 혼합된 고분자 복합체를 제조하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 4는 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리에 의한 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 도면이다.
도 5는 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 유도만능줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(iPSC MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리에 의한 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 도면이다.
도 8은 인간 섬유아세포주에서 유도만능줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(iPSC MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 인간 섬유아세포주에서 유도만능줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(iPSC MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리에 의한 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 도면이다.
도 11은 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 섬유아세포주에서 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 48시간 단독 또는 병용 처리한 뒤, 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 인간 섬유아세포주에서 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MV), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 24시간 단독 또는 병용 처리한 뒤, 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 자연살해세포(상단) 또는 유도만능줄기세포(하단)의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(MVs)의 크기를 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)을 통해 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 자연살해세포, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(MVs) 및 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 또는 콜라겐(collagen)이 혼합된 고분자 복합체를 제조하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 4는 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리에 의한 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 도면이다.
도 5는 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 유도만능줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(iPSC MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리에 의한 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 도면이다.
도 8은 인간 섬유아세포주에서 유도만능줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(iPSC MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 인간 섬유아세포주에서 유도만능줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(iPSC MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)의 단독 또는 병용 처리에 의한 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 도면이다.
도 11은 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 인간 섬유아세포주에서 자연살해세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 단독 또는 병용 처리한 뒤, 시간별(24시간, 48시간, 72시간) 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 섬유아세포주에서 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 48시간 단독 또는 병용 처리한 뒤, 세포 증식율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 인간 섬유아세포주에서 중간엽 줄기세포의 배양액으로부터 분리한 미세소포체(NK MV), 히알루론산(HA) 및 콜라겐(collagen)을 24시간 단독 또는 병용 처리한 뒤, 세포수를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
미세소포체 및 고분자를 포함하는 조성물
본 발명의 일 측면은 인간 유래 세포로부터 분리된 미세소포체(microvesicles); 및 콜라겐 및/또는 히알루론산을 포함하는 조성물을 제공한다.
미세소포체를 포함하는 화장용 조성물
본 발명의 일 측면은 인간 유래 세포로부터 분리된 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장용 조성물을 제공한다. 상기 인간 유래 세포는 줄기세포 또는 면역세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있다. 바람직하게는, 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, 자연살해세포, 수지상세포 또는 대식세포일 수 있다. 바람직하게는, 자연살해세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)"는 다능성이 없는 체세포에 역분화를 유도하여 배아줄기세포와 같은 다능성을 갖도록 생성된 세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 역분화 줄기세포라고도 불릴 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 태아, 신생아, 어린이, 또는 성인의 체세포를 이용하여 생성될 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 섬유아세포, 각질세포, 혈구 세포, 또는 신장 표피세포 유래일 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 체세포를 재프로그래밍함으로써 생산된 것일 수 있다. 체세포를 재프로그래밍하여 유도만능줄기세포로 제작하는 방법은 공지된 방법, 예컨대 Takahashi K, Yamanaka S(August 2006), Cell. vol.126, no.4, pp.663-676에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어. "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)"는 다분화능을 가진 기질세포(stroma cell)로 조골세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포를 포함한 다양한 세포로 분화할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "자연살해세포(natural killer cells, NK cells)"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계 세포로, 정상인 혈액 내에 약 10~15%가량 존재하며, 비자기(non-self)와 반응할 때 높은 살해능을 가진다. 각종 바이러스에 감염된 세포나 세균 침투, 혹은 비정상 세포의 생성에 있어, 자연살해세포는 비특이적으로 즉각적으로 반응하여 이물질을 제거할 수 있다. 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식 세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 세포외 수용체를 포함한다. 또한, 자연살해세포 유래의 미세 소포체는 비정상적인 세포를 제거함과 동시에 비정상적인 세포환경을 정상적으로 되돌리는 특징을 갖는다.
본 발명에서 사용된 용어, "미세소포체(microvesicles, MVs)"는 세포외 공간으로 분비된 막구조의 세포외 소포체(extracellualr vesicles)의 한 종류이다. 상기 세포외 소포체는 각종 성장인자(growth factors), 케모카인(chemokines), 사이토카인(cytokines), 전사인자(transcription factors), RNAs(mRNA, miRNA 등), 지질 등의 다양한 생체 분자가 이것이 유래된 세포의 세포막과 동일한 지질 이중층의 세포막으로 봉입된 입자 형태의 구조체이다. 따라서, 상기 세포외 소포체는 단백질, 지질, 유전물질 등의 운송을 매개하여 세포 간의 물질 교환을 가능하게 하며, 생리적/병리적으로 신호를 전달하는 매개체로서 작용한다.
세포외 소포체는 크게 엑소좀(exosomes)과 미세소포체(microvesicles)로 분류된다. 엑소좀은 입경이 40~120 nm로, 다중 소포 엔도좀(multi-vesicular endosomes)이 성숙하는 과정에서 엔도좀 막이 안쪽으로 들어와 생성된 내강 소낭(intraluminal vesicles)으로, 다중 소포 엔도좀이 세포 표면과 결합할 때 분비된다. 상기 엑소좀의 마커 단백질로는 CD63, CD9, TSG101, ESCRT 등이 알려져 있다. 미세소포체는 입경이 100~1000 nm로, 원형질막(plasma membrane)이 바깥으로 솟아나와 분리되어 세포 밖으로 분비되는 소낭이다. 상기 미세소포체의 마커로는 인테그린(integrin)-β, CD40, 셀렉틴(selectins) 등이 알려져 있다.
본 발명에서 상기 인간 세포 유래의 미세소포체는 약 200 nm 내지 약 2,000 nm의 입경을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 미세소포체는 약 200 nm 내지 약 2,000 nm, 약 200 nm 내지 약 1,900 nm, 약 200 nm 내지 약 1,800 nm, 약 200 nm 내지 약 1,700 nm, 약 200 nm 내지 약 1,600 nm, 약 200 nm 내지 약 1,500 nm, 약 200 nm 내지 약 1,400 nm, 약 200 nm 내지 약 1,3000 nm, 약 200 nm 내지 약 1,200 nm, 약 200 nm 내지 약 1,100 nm, 약 200 nm 내지 약 1,000 nm, 약 200 nm 내지 약 900 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 200 nm 내지 약 700 nm, 약 200 nm 내지 약 600 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 400 nm 또는 약 200 nm 내지 약 300 nm의 입경을 갖는 것일 수 있다.
이때, 상기 미세소포체는 엑소좀을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 i) 인간 유래 세포를 배양하는 단계; ii) 배양액을 수득하는 단계; 및 iii) 상기 세포 배양액으로부터 미세소포체를 분리하는 단계;를 통해 수득되는 것일 수 있다.
여기서, 인간 유래 세포는 상술한 바와 동일하다.
본 발명에서 사용된 용어, "배양"은 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미하며, 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 세포에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배지는 세포의 배양 시 사용되는 공지된 배지를 의미하며, 공지의 세포 배양용 배지 또는 이들의 변형된 배지를 모두 포함한다.
상기 인간 유래 세포는 배양 배지에서 약 1시간 내지 약 4주, 약 6시간 내지 약 3주, 약 12시간 내지 약 2주, 약 18시간 내지 약 7일 또는 약 1일 내지 약 3일 동안 배양될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 인간 유래의 유도만능줄기세포(iPSCs)는 배양 배지에서 약 1시간 내지 약 4주, 약 6시간 내지 약 3주, 약 12시간 내지 약 2주, 약 18시간 내지 약 7일 또는 약 1일 내지 약 3일 동안 배양될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 인간 유래의 중간엽 줄기세포(MSCs)는 배양 배지에서 약 1시간 내지 약 4주, 약 6시간 내지 약 3주, 약 12시간 내지 약 2주, 약 18시간 내지 약 7일 또는 약 1일 내지 약 3일 동안 배양될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 인간 유래의 자연살해세포는 배양 배지에서 약 1시간 내지 약 4주, 약 6시간 내지 약 3주, 약 12시간 내지 약 2주, 약 18시간 내지 약 7일 또는 약 1일 내지 약 3일 동안 배양될 수 있다.
본 발명의 미세소포체는 상기 배양액에서 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation) 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 분리방법에 의해 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명의 미세소포체는 상기 인간 유래 세포 배양액을 원심분리하여 수집한 펠렛에서 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 세포를 배양한 배양액을 수거하여 제1차 원심분리하여 세포 및 세포 찌꺼기가 포함된 펠렛을 제거하는 단계, 및 상기 펠렛이 제거된 배양액을 제2차 원심분리하여 펠렛으로 형성된 미세소포체를 수득하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간 및 온도는 제1차 원심분리가 수행되는 시간 및 온도와 동일하게 수행될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제1차 및 제2차 원심분리는 약 0℃내지 약 10℃의 온도, 바람직하게는 약 3℃내지 약 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 약 10분 내지 30분 동안 수행될 수 있으며, 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다. 바람직하게는, 약 4℃에서 20분간 수행될 수 있다.
또한, 상기 제1차 원심분리는 약 100g 내지 약 1000g, 약 200g 내지 약 700g 또는 약 300g 내지 약 450g의 속도로 수행될 수 있다. 상기 제1차 원심분리는 약 300g에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 약 5,000g 내지 약 40,000g, 약 8,000g 내지 약 30,000g 또는 약 10,000g 내지 약 20,000g의 속도로 수행될 수 있다. 바람직하게, 상기 제1차 원심분리는 약 300g의 속도로 수행할 수 있으며, 제2차 원심분리는 약 16,000g의 속도로 수행할 수 있다.
본 발명의 화장용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로 상기 미세소포체를 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.0005 내지 10 중량%의 상기 미세소포체를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 0.001 내지 10%의 상기 미세소포체를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 미세소포체를 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 또는 약 20 ㎍ 내지 약 50 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 조성물은 상기 미세소포체를 약 40 ㎍으로 포함할 수 있다.
본 발명의 화장용 조성물은 상기 조성물은 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 이의 염; 및/또는 콜라겐(collagen)을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "히알루론산(hyaluronic acid, HA)"은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 분자량이 100 kDa 내지 13,000 kDa에 이르는 무색 투명한 고점도의 선형 다당류이며, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등 다양한 생물종과 조직으로부터 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 중성 가용화법, 효소 가용화법 등으로 추출 및 정제하여 사용할 수 있다. 수용액 내 히알루론산의 분자량 및 농도에 따라 점성, 탄성, 보습성이 결정되며, 히알루론산의 농도가 높을수록 그 성질이 증가한다. 히알루론산은 분자량 크기에 따라서 기능이 상이한 것으로 알려져 있다.
본 발명의 상기 조성물을 구성하는 히알루론산은 1.0 KDa 내지 3.0 MDa, 10 KDa 내지 2.5 MDa, 50 KDa 내지 2.0 MDa, 또는 110 KDa 내지 1.81 MDa일 수 있다.
또한, 상기 "히알루론산의 염"은 히알루론산과 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 히알루론산의 화장용으로 허용 가능한 염 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 히알루론산의 염은 예를 들어, 소듐 히알루로네이트, 포타슘 히알루로네이트, 암모늄 히알루로네이트, 칼슘 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 아연 히알루로네이트, 코발트 히알루로네이트일 수 있다.
또한, 상기 히알루론산은 이에 제한되지는 않으나, 가교된 히알루론산 겔일 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 겔은 이에 제한되지는 않으나, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "콜라겐(collagen)"은 인체에서 가장 흔하게 발견되는 단백질로 포유류에서 가장 많은 단백질이며, 전체 단백질의 약 25~35%를 차지한다. 특히, 뼈, 힘줄, 인대를 구성하는 주요한 성분이며, 주로 장기의 구조를 유지하는 역할을 수행한다. 상기 콜라겐은 소나 돼지와 같은 포유동물의 피부로부터 쉽게 추출할 수 있으며, 상기 콜라겐은 순수 콜라겐 이외에, 콜라겐 유도체를 포함할 수도 있다. 콜라겐과 관련하여, 이의 유래는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 콜라겐을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 구성하는 콜라겐으로는 콜라겐 I 내지 콜라겐 IV를 사용할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 콜라겐은 콜라겐 I 및 콜라겐 III을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 콜라겐은 콜라겐 I의 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 사용할 수 있다. 이때, 상기 아텔로콜라겐은 콜라겐에서 피부 과민 반응을 유발할 수 있는 항원성 물질인 텔로 펩타이드가 제거된 콜라겐을 의미한다.
본 발명에서 상기 화장용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 30 중량%로 상기 히알루론산 또는 이의 염을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 히알루론산 또는 이의 염을 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 또는 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 조성물은 상기 히알루론산 또는 이의 염을 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다.
이때, 상기 미세소포체 및 히알루론산 또는 이의 염이 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 미세소포체 및 히알루론산 또는 이의 염은 1:2.5의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명에서 상기 화장용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 30 중량%로 상기 콜라겐을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 콜라겐을 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 또는 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 조성물은 상기 콜라겐을 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다.
이때, 상기 미세소포체 및 콜라겐은 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 미세소포체 및 콜라겐은 1:2.5의 중량비로 혼합될 수 있다.
또한, 상기 화장용 조성물은 상기 미세소포체, 히알루론산 또는 이의 염, 및 콜라겐을 10:1:1 내지 1:1:10의 중량비로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 미세소포체, 히알루론산 또는 이의 염, 및 콜라겐을 2:1:4 또는 2:4:1의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명의 화장용 조성물은 피부 상태를 개선시키는 용도로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "피부 상태 개선"은 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 회복(wound healing), 각막 재생, 피부 자극 완화 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다. 또한, 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선하거나, 또는 피부 질환을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 화장용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장용 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제제화될 수 있다. 또한, 화장료용 필러로 제조될 수도 있다.
화장료용 필러는 피부 표면에 도포하는 방법으로 적용할 수 있고, 예를 들면 향료, 잔탄검, 왁스, 버터, 오일, 계면활성제, 보습제, 알코올 등을 포함할 수 있고, 통상적으로 포함할 수 있는 화장료 조성물의 구성 성분이라면 특별히 제한하지 않고 포함할 수 있다. 또한, 화장료용 필러 조성물이 히알루론산을 포함하는 경우, 상기 히알루론산은 가교되지 않은 구조(non-crosslinked)를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 화장용 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장용 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 용매, 용매화제, 유탁화제 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물 등이 있다.
본 발명에 따른 화장용 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
상기 화장용 조성물은 상기 제형에 따라 담체 이외에 각종 공지의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 첨가제에는 유화제, 보습제, 계면활성제, 킬레이팅제, 산화방지제, 살균제, 안정화제 등이 있다.
상기 유화제로는 유동 파라핀, 세틸올타노에이트, 스테아린산 등을 포함할 수 있다. 상기 보습제로는 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 솔비톨, 및 로 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 폴리올을 포함할 수 있다.
상기 킬레이팅제로는 에틸렌디아민테트라아세트산나트륨(EDTA), α-하이드록시 지방산, 락토페린, α-하이드록시산, 시트르산, 락트산, 말산, 빌리루빈, 빌리버딘(biliverdin) 등을 포함할 수 있다.
상기 산화 방지제로는 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔 또는 프로필 갈레이트 등을 포함할 수 있다. 이외에도, 상기 화장용 조성물 또는 피부 외용제에 배합 가능한 성분으로서 유지 성분, 에몰리언트제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, pH 조절제, 알코올, 색소, 항료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 비타민 등이 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 화장용 조성물을 이용하여, 피부 상태 개선을 통한 미용 방법을 제공한다. 상기 미용 방법은 상기 화장용 조성물을 대상의 피부에 도포하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 화장용 조성물은 상술한 바와 동일하다.
상기 대상은 포유동물일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있다. 피부에 도포하는 단계는 본 발명에 따른 화장용 조성물을 그 형태에 따라 피부에 직접 도포하거나, 분무하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 화장용 조성물의 도포량 및 하루 사용 횟수는, 사용자의 연령, 성별, 용도, 증상의 정도 등에 따라 적절하게 설정될 수 있고, 예를 들면, 상기 화장용 조성물의 적당량을 하루 1 내지 6회의 빈도로 피부에 도포할 수 있다.
미세소포체를 포함하는 약학 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 인간 유래 세포로부터 분리된 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 여기서, 인간 유래 세포 및 미세소포체는 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로 상기 미세소포체를 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.0005 내지 10 중량%의 상기 미세소포체를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 0.001 내지 10%의 상기 미세소포체를 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 약학 조성물은 미세소포체를 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 또는 약 20 ㎍ 내지 약 50 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 약학 조성물은 상기 미세소포체를 약 40 ㎍으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 히알루론산 또는 이의 염; 및/또는 콜라겐(collagen)을 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 히알루론산 및 콜라겐은 상술한 바와 동일하다.
상기 "히알루론산의 염"은 히알루론산과 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다. 이때, "약학적으로 허용 가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 상기 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이러한 염으로는 약학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산 부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 30 중량%로 상기 히알루론산 또는 이의 염을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 히알루론산 또는 이의 염을 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 또는 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 약학 조성물은 상기 히알루론산 또는 이의 염을 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다.
이때, 상기 미세소포체 및 히알루론산 또는 이의 염이 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 미세포소포체 및 히알루론산 또는 이의 염은 1:2.5의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 30 중량%로 상기 콜라겐을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 콜라겐을 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 30 ㎍ 내지 약 200 ㎍ 또는 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 약학 조성물은 상기 콜라겐을 약 100 ㎍으로 포함할 수 있다.
이때, 상기 미세소포체 및 콜라겐은 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 미세포소포체 및 콜라겐은 1:2.5의 중량비로 혼합될 수 있다.
또한, 상기 약학조성물은 상기 미세소포체, 히알루론산 또는 이의 염, 및 콜라겐을 1:1:10 내지 10:1:1의 중량비로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 약학 조성물은 미세소포체, 히알루론산 또는 이의 염, 및 콜라겐을 2:1:4 또는 2:4:1의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명에 의한 약학 조성물은 피부 질환 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
상기 "피부 질환"은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 상기 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 사전에 방지하거나 발생 가능성 또는 발생 빈도를 낮추는 것을 포괄적으로 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 질환이 발생할 가능성이 있는 환자 또는 발병한 적이 있는 환자에게서 발병 확률을 낮추거나, 재발 확률을 낮추는 것일 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 "치료학적 유효량"과 동일한 의미로서, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합, 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 상기 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 개선시키는 것을 포괄적으로 의미할 수 있고, 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 질환의 증상이 완화 또는 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있으며, 질환으로 인한 한가지 증상 또는 대부분의 증상을 개선시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 유효량에 대해서는 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 약학 조성물은 그 자체로 피부 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 상기 "치료"는 "치료 보조"의 의미를 포함한다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 "치료학적으로 유효한 양"으로 투여한다. 상기 치료학적 유효량은 상술한 바와 동일하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 구체적으로는 비경구 방식으로 투여되고, 보다 구체적으로는 피하 또는 경피 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 피부에 직접 도포될 수 있다. 상기 약학 조성물을 피부에 도포하는 경우, 본 발명에 따른 약학 조성물을 그 형태에 따라 피부에 직접 도포하거나, 분무하는 것을 포함할 수 있다.
여기서 약학 조성물이 투여될 수 있는 대상은 포유동물일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 ㎎/kg~100 ㎎/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 "Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed, 1995)"에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조되는 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다. 상기 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 피부외용제로 제조되는 경우, 연고제, 액제, 크림제, 스프레이제, 패취제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 이때, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위 내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 필러용 주사제의 형태로도 제조될 수 있다. 예를 들면 알긴산(alginic acid), 카르복시메틸셀룰로즈(carboxymethyl cellulose), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 펙틴(pectin), 아가(agar), 아밀로즈(amylose), 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 엘라스틴(elastin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 담체를 포함할 수 있다. 필러용 주사제 조성물이 히알루론산을 포함하는 경우, 상기 히알루론산은 가교되어 있는 구조(cross-linked)를 가질 수 있다.
또한, 예를 들면 생분해성 고분자 지지체(scaffold)로 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester) 및 이들의 공중합체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 필러용 주사제는 국소 마취제, 항히스타민제, 비타민 등을 포함할 수 있다.
국소마취제로는 예를 들면, 리도카인(lidocaine), 에티도카인(etidocaine), 부피바카인(bupivacaine), 테트라카인(tetracaine), 메피바카인(mepivacaine), 프로카인(procaine), 프릴로카인(prilocaine), 로피바카인(ropivacaine) 등을 포함할 수 있으나, 주사제용 국소마취제라면 특별히 제한하지 않는다.
항히스타민제로는 예를 들면 클로로페니라민(chlorpheniramine), 디페닐피랄린(diphenylpyraline, piprinhydrinate), 디펜히드라민(diphenhydramine), 세티리진(cetirizine) 등을 포함할 수 있으나, 주사제용 항히스타민제라면 특별히 제한하지 않는다.
본 발명은 상기 약학 조성물을 이용하여 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 피부 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다. 여기서, 상기 약학 조성물, 피부질환, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.
상기 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상의 피부에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 약학 조성물, 피부 질환, 치료 및 예방은 상술한 바와 동일하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 미세소포체 및 고분자 복합체 제작
제조예 1. 미세소포체 분리
자연살해세포(NK cells)는 100 Gy로 조사한 지지세포(feeder cells)를 자연살해세포와 1:2의 비율로 시딩(seeding)하였다. 세포는 인간 AB 혈청, 1% L-글루타민 및 IL-15가 포함된 배지에서 배양하였다. 계대배양 시에는 240 mm 스크랩퍼를 이용하여 세포를 수거하였다.
유도만능줄기세포(iPSc)의 경우 iMatrix 511(ATRIXOME)가 처리된 플라스크에 유도만능줄기세포를 시딩하고 1% Penicillin-Streptomycin 및 10 uM Y-27631가 포함된 배지에서 배양하였다. 이때, 배지는 매일 교체하였다.
중간엽 줄기세포는 Promo cell에서 구입하여 Promo cell 업체의 줄기세포 전용 배지와 전용 혈청을 이용하여 1주일 동안 T-300 플라스크 배양용기에서 배양하였다.
세포 배양액으로부터 미세소포체를 분리하는 방법은 도 1에 나타내었다. 구체적으로, 유도만능줄기세포(iPSc), 자연살해세포(NK cells) 및 중간엽 줄기세포는 각각 배양 7일, 16일 및 23일 후에 각각의 세포 배양 상층액을 수거하여 4℃, 300g, 20분간 원심분리하고 상층액을 취하여 세포 찌꺼기(P1)를 제거하였다. 상기 수득한 상층액을 4℃, 16,000g, 20분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 펠렛을 취하였다(P2). 상기 펠렛(P2)를 재현탁하여 동적광산란법(dynamic light scattering; DLS)을 통해 입자의 크기를 측정한 결과, 자연살해세포의 배양액 유래 미세소포체(NK MVs) 및 유도만능줄기세포(iPSC MVs)의 배양액 유래 미세소포체(iPSC MVs)의 평균 입경은 각각 648 nm 및 1.415 nm로 확인되었다(도 2).
중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 상기 중간엽 줄기세포 배양 상층액을 수거하여 300g로 원심분리한 후, 엑소좀 농축 시약(Invtrogen, 4478359)을 사용하여 배지와 5:1 비율로 4 mL을 첨가하고, 1분 동안 볼텍싱한 다음 밤새 4℃조건 하에서 인큐베이션하였다. 이후, 10,000g로 60분 동안 원심분리하여 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 준비하였다.
제조예 2. 미세소포체/고분자 복합체 제작
제조예 1의 방법으로 분리된 자연살해세포 유래 미세소포체(NK MVs), 유도만능줄기세포 유래 미세소포체(iPSC MVs) 또는 중간엽 줄기세포 유래 미세소포체(MSC MVs)를 히알루론산 또는 콜라겐과 혼합하여 미세소포체/고분자 복합체를 제작하였다(도 3).
구체적으로, 상기 자연살해세포 배양액 유래 미세소포체(NK MVs), 유도만능줄기세포 배양액 유래 미세소포체(iPSC MVs), 중간엽 줄기세포 배양액 유래 미세소포체(MSC MVs) 400 ㎍ 또는 중간엽 줄기세포 배양액 유래 엑소좀(MSC exo) 400 ㎍, 및 히알루론산 파우더(Lifecore, HA1M-5) 1 mg 또는 콜라겐 콜라겐 파우더(다림티센, BA06091) 1 mg을 각각 PBS 또는 D.W.에 넣고 2분간 볼텍스(vortex)하여 혼합하였다. 상기 혼합액을 4℃에서 10분간 반응시킨 뒤, 거품을 제거하고 상기 혼합물을 미세소포체 또는 엑소좀, 및 히알루론산 또는 콜라겐의 병용 처리 시 시료로 사용하였다.
II. 세포 배양액 유래의 미세소포체 및 고분자 복합체의 피부 치유 효과 확인
실시예 1. 자연살해세포 배양액 유래 미세소포체 및 고분자 복합체의 인간 섬유아세포 증식에 미치는 영향 확인
자연살해세포 배양액 유래 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(collagen) 처리에 의한 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인하기 위하여, 인간 섬유아세포주에 도 4의 방법으로 NK MVs, 히알루론산(HA) 및 콜라겐을 단독 또는 병용 처리한 후, 세포 증식능을 평가하였다.
구체적으로, 인간 섬유아세포주인 BJ6 세포(서울대학교, 한국세포주은행)는 48웰에 1×104 세포/웰의 농도로 접종하여 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 24시간 배양하였다. 상기 접종된 세포를 추가적으로 24시간까지 배양한 후, 배지를 제거하고 시험물질 및 1% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 72시간 추가 배양하였다.
이때, 시험물질로 NK MVs(40 ㎍), 히알루론산(HA, 100 ㎍), 콜라겐(collagen, 100 ㎍), [NK MVs(40 ㎍)+히알루론산(HA, 100 ㎍)] 복합체, [NK MVs(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 100 ㎍)] 복합체를 사용하였으며, 미세소포체/고분자 복합체는 제조예 2와 동일한 방법으로 제작하였다. 또한, 대조군(vehicle)으로 PBS에 고분자를 녹여 1% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 MVs와 동일한 농도가 되도록 희석하여 사용하였다.
세포 증식율은 현미경을 통해 세포수를 확인하는 방법(도 5) 및 CCK-8 용액을 이용하여 흡광도를 측정함(도 6)으로써 평가하였다. CCK-8 용액은 1% FBS 포함된 RPMI1640 배지에 1/10 희석하고 이를 각 웰 당 200 ㎕씩 처리하였다. 이후 2시간 동안 5% CO2 세포배양기에서 반응시킨 뒤, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군의 세포 증식율은 대조군(vehicle)과 비교하여 백분율(%)로 계산하여 나타내었다.
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 모든 처리군에서 세포 증식능이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 대조군(vehicle)을 상대적 비교값으로 100%로 고정시켰을 때 72시간 처리시 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(collagen) 단독 처리군은 각각 131% 및 145%의 세포 증식율을 나타내었다. 또한, NK MVs, [NK MVs+히알루론산] 복합체 및 [NK MVs+콜라겐] 복합체 처리군은 각각 164%, 192% 및 174%까지 세포 증식율이 증가되었다.
실시예 2. 유도만능줄기세포 배양액 유래 미세소포체 및 고분자 복합체의 인간 섬유아세포 증식에 미치는 영향 확인
유도만능줄기세포 배양액 유래 미세소포체(iPSC MVs), 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(collagen) 처리에 의한 피부 치유 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 NK MVs, 히알루론산(HA) 및 콜라겐을 단독 또는 병용 처리한 후, 세포 증식능을 평가하였다.
이때, 시험물질로 iPSC MVs(40 ㎍), 히알루론산(HA, 100 ㎍), 콜라겐(collagen, 100 ㎍), [iPSC MVs(40 ㎍)+히알루론산(HA, 100 ㎍)] 복합체, [iPSC MVs(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 100 ㎍)] 복합체를 사용하였다. 이때, 미세소포체/고분자 복합체는 제조예 2와 동일한 방법으로 제작하였다. 또한, 대조군(vehicle)으로 PBS에 고분자를 녹여 1% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 MVs와 동일한 농도가 되도록 희석하여 사용하였다(도 7).
그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 모든 처리군에서 세포 증식능이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 대조군(vehicle)을 상대적 비교값으로 100%로 고정시켰을 때 72시간 처리시 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(collagen) 단독 처리군은 각각 131% 및 145%의 세포 증식율을 나타냈다. 또한, iPSC MVs, [iPSC MVs+히알루론산] 복합체 및 [iPSC MVs+콜라겐] 복합체 처리군은 각각 244%, 192% 및 234%까지 세포 증식율이 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 iPSC MVs 또는 NK MVs 및 콜라겐 또는 히알루론산 고분자의 병용이 iPSC MVs 또는 NK MVs에 의한 섬유아세포 증식 유도 효과를 간섭하지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 자연살해세포 배양액 유래 미세소포체 및 고분자 복합체 비율의 따른 인간 섬유아세포 증식에 미치는 영향 확인
자연살해세포 배양액 유래 미세소포체(NK MVs), 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(collagen) 처리에 의한 피부 치유 효과를 확인하기 위하여, 하기의 농도가 되도록 NK MVs, 히알루론산(HA) 및 콜라겐을 배합하여 복합체를 제조하여 실시예 1과 동일한 방법으로 NK MVs, 히알루론산(HA) 및 콜라겐 단독 또는 병용에 의한 세포 증식능을 평가하였다.
이때, 시험물질로 NK MVs(40 ㎍), 히알루론산(HA, 100 ㎍), 콜라겐(collagen, 100 ㎍), [NK MVs(40 ㎍)+히알루론산(HA, 100 ㎍)] 복합체, [NK MVs(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 100 ㎍)] 복합체, [NK MVs(40 ㎍)+히알루론산(HA, 20 ㎍)+콜라겐(collagen, 80 ㎍)] 복합체, [NK MVs(40 ㎍)+히알루론산(HA, 80 ㎍)+콜라겐(collagen, 20 ㎍)] 복합체, [NK MVs(40 ㎍)+히알루론산(HA, 50 ㎍)+콜라겐(collagen, 50 ㎍)] 복합체를 사용하였다. 또한, 대조군(vehicle)으로 PBS에 고분자를 녹여 1% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 MVs와 동일한 농도가 되도록 희석하여 사용하였다(도 10).
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 모든 처리군에서 세포 증식능이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 대조군(vehicle)을 상대적 비교값으로 100%로 고정시켰을 때 72시간 처리 시, 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(collagen) 단독 처리군은 각각 113% 및 130%의 세포 증식율을 나타냈다. NK MVs, [NK MVs+히알루론산] 복합체 및 [NK MVs+콜라겐] 복합체 처리군은 각각 154%, 170% 및 171%까지세포 증식율이 증가되는 것을 확인하였다.
또한, [NK MVs+히알루론산+콜라겐] 복합체 처리군은 히알루론산 및 콜라겐의 비율의 따라 증식효율에 차이를 나타냈다. 이때, 히알루론산 및 콜라겐의 혼합 비율이 50:50일 경우 세포 증식율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(199%). 상기 결과를 통하여, NK MVs, 콜라겐 및 히알루론산 고분자의 병용이 NK MVs 단독 또는 NK MVs 및 콜라겐 또는 히알루론산 고분자의 병용에 비하여 섬유아세포 증식을 상승적으로 촉진할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 중간엽 줄기세포 배양액 유래 미세소포체 및 고분자 복합체 비율의 따른 인간 섬유아세포 증식에 미치는 영향 확인
중간엽 줄기세포 배양액 유래 미세소포체(MSC MVs), 히알루론산(HA) 또는 콜라겐(collagen) 처리에 의한 피부 치유 효과를 확인하기 위하여, 하기의 농도가 되도록 MSC MVs, 히알루론산(HA) 및 콜라겐을 배합하여 복합체를 제조하여 실시예 1과 동일한 방법으로 MSC MVs, 히알루론산(HA) 및 콜라겐 단독 또는 병용에 의한 세포 증식능을 평가하였다.
이때, 시험물질로 MSC MV(40 ㎍), 히알루론산(HA, 100 ㎍), 콜라겐(collagen, 100 ㎍), MSC exo 40 ㎍, [MSC MV(40 ㎍)+히알루론산(HA, 100 ㎍)] 복합체, [MSC exo(40 ㎍)+히알루론산(HA, 100 ㎍)] 복합체, [MSC MV(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 100 ㎍)] 복합체, [MSC exo(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 100 ㎍)] 복합체, [MSC MV(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 80 ㎍)+히알루론산(HA, 20 ㎍)] 복합체, [MSC exo(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 80 ㎍)+히알루론산(HA, 20 ㎍)] 복합체, [MSC MV(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 20 ㎍)+히알루론산(HA, 80 ㎍)] 복합체, [MSC exo(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 20 ㎍)+히알루론산(HA, 80 ㎍)] 복합체, [MSC MV(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 50 ㎍)+히알루론산(HA, 50 ㎍)] 복합체 및 [MSC exo(40 ㎍)+콜라겐(collagen, 50 ㎍)+히알루론산(HA, 50 ㎍)] 복합체를 사용하였다. 또한, 대조군(vehicle)으로 PBS에 고분자를 녹여 1% FBS가 포함된 DMEM 배지에 MVs와 동일한 농도가 되도록 희석하여 사용하였다.
시료 처리한 24시간 후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 CCK-8 용액을 각 웰 당 200 ㎕씩 처리하였고, 반응 완료 후 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 후, 각 실험군의 세포 증식율은 대조군(vehicle)과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 이때, 대조군을 상대적 비교값으로 100%로 고정하여 비교 계산하였다.
또한, MSC 세포 유래 엑소좀 및 미세소포체 융합 생체적합성 고분자 복합체 처리에 따른 세포 증식률의 차이를 확인하기 위해, 24시간 현미경을 통해 촬영하여 각 그룹별로 인간 섬유아세포 증식 정도를 확인하였다(도 14).
그 결과, 대조군에 비하여 MSC MV, 콜라겐, 히알루론산 단독 및 병용 처리군에서 모두 세포 증식률이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 배양 24시간째 히알루론산 단독(100 ㎍) 처리군의 경우 113%, 콜라겐 단독(100 ㎍) 처리군의 경우 130% 증가한 것과 비교하여 MSC exo 처리군 및 MSC MV 처리군은 각각 176% 및 146%의 세포 증식률이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 콜라겐 및 히알루론산을 병용 처리한 경우, MSC exo 단독 처리군 또는 MSC MV 단독 처리군에 비하여 보다 더 높은 세포 증식률을 나타내었다.
상기 결과를 통하여, MSC exo 및 MSC MV는 우수한 세포 증식 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 MSC exo 및 MSC MV를 궁극적으로 피부의 주름 개선 및 상처 재생 등의 피부 상태 개선 및 아토피 피부염과 같은 피부 질환의 증상 개선 등에 활용할 수 있음을 시사한다.
Claims (26)
- 인간 유래 세포로부터 분리된 미세소포체(microvesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 인간 유래 세포는 줄기세포 또는 면역세포인 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 면역세포는 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, 자연살해세포, 수지상세포 또는 대식세포인 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 면역세포는 자연살해세포인 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 미세소포체는 입경이 200 내지 2,000 nm인 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 미세소포체는 엑소좀을 포함하는 않는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 미세소포체는 i) 인간 유래 세포를 배양하는 단계; ii) 배양액을 수득하는 단계; 및 iii) 상기 세포 배양액으로부터 미세소포체를 분리하는 단계;를 통해 수득되는 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 이의 염; 및/또는 콜라겐(collagen)을 추가로 포함하는 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 조성물은 미세소포체 및 히알루론산이 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합된 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제10항에 있어서,
상기 조성물은 미세소포체 및 콜라겐이 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합된 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 상태 개선은 주름의 발생 억제, 피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 회복(wound healing), 각막 재생, 피부 자극 완화 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 화장품 조성물. - 인간 유래 세포로부터 분리된 미세소포체(microvesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 인간 유래 세포는 줄기세포 또는 면역세포인 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제16항에 있어서,
상기 줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 면역세포는 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, 자연살해세포, 수지상세포 또는 대식세포인 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제18항에 있어서,
상기 면역세포는 자연살해세포인 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제14항에 있어서,
상기 미세소포체는 입경이 200 내지 2,000 nm인 것을 특징으로 하는, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 미세소포체는 엑소좀을 포함하는 않는 것을 특징으로 하는, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 미세소포체는 i) 인간 유래 세포를 배양하는 단계; ii) 배양액을 수득하는 단계; 및 iii) 상기 세포 배양액으로부터 미세소포체를 분리하는 단계;를 통해 수득되는 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 조성물은 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 이의 염; 및/또는 콜라겐(collagen)을 추가로 포함하는 것인, 피부 상태 개선용 화장용 조성물. - 제23항에 있어서,
상기 조성물은 미세소포체 및 히알루론산이 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합된 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제23항에 있어서,
상기 조성물은 미세소포체 및 콜라겐이 1:1 내지 1:10의 중량비로 혼합된 것인, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 피부 질환이 피부 질환은 아토피성 피부염, 상처, 피부 주름, 피부 노화, 피부 탄력 약화, 피부 건조, 민감 피부, 여드름, 탈모 및 피부 착색 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 피부 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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