KR101785491B1

KR101785491B1 - 로케트 추출물을 함유하는 히알루론산 생성 촉진용 및 피부탄력 증진용 조성물

Info

Publication number: KR101785491B1
Application number: KR1020150017720A
Authority: KR
Inventors: 장경택; 민 선 김
Original assignee: 민 선 김
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2015-02-05
Publication date: 2017-10-17
Also published as: KR20150023608A

Abstract

본 발명은, 로케트 추출물을 함유하는 히알루론산 생성 증진용 및 피부탄력 증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 로케트 추출물은 인간 피부 표피 세포주 (HaCaT)에 존재하는 히알루론산 합성 효소 (Hyaluronic acid synthase) 유전자의 발현을 증가시켜 인체에서 히알루론산 생성을 촉진하는 효능이 있고 또한 자외선 흡수 효능이 있으므로, 본 발명에 의한 로케트 추출물을 0.001~10.0 중량% 함유하는 조성물은 히알루론산 생성 증진용 조성물로서, 피부 탄력 증진, 상처 치유, 노화 방지용 피부 외용제 조성물, 또는 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

로케트 추출물을 함유하는 히알루론산 생성 촉진용 및 피부탄력 증진용 조성물 {Rocket extract-containing ingredients stimulating hyaluronic acid synthesis and skin elasticity}

[1] 본 발명은 로케트 (Rocket, Eruca sativa or Rucola) 추출물을 함유하는 히알루론산 생성 촉진용 및 피부탄력 증진용 조성물에 관한 것으로 히알루론산 생성 효소 (Hyaluronic acid synthase) 유전자의 발현을 증가시킴으로서 히알루론산 생성이 촉진되는 효과를 제공하는 피부 외용제 및 약학용 조성물에 관한 것이다.

[2] 히알루론산은 결체조직, 상피조직, 신경조직등에 널리 분포되어 있는 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycan)으로 분자량이 최고 수백만에 달하는 고분자 물질이다. 글리코스아미노글리칸 중에서도 황산기가 없고 골지체가 아닌 원형질막 (plasma membrane)에서 생성된다는 점이 특이하다. 세포외 기질의 주요 성분으로서 세포 성장, 이동, 악성 암의 진행에 관여하는 걸로 알려져 있으며 효소 히알루로니다아제 (hyaluronidase)에 의하여 가수분해된다. 일반 성인은 15g 정도의 히알루론산을 체내에 함유하고 있으며 이 중 1/3 정도가 매일 분해와 재생성 과정을 거친다. 히알루론산은 눈의 초자체, 탯줄 등에 존재하며 점성이 크고 세균의 침입이나 독물의 침투를 막는데 매우 중요하다. 퇴행성 관절염 환자들의 무릎 관절에 주입되어 관절염 치료제로 쓰이기도 하며 소디움 히알루로네이트 형태로 아토피 환자들의 치료 크림에 함유되어 사용된다. 히알루론산은 피부의 주요 구성성분으로서 조직 재생에 관여하기 때문에 상처치유력이 뛰어나 상처치유의 활성 성분으로 사용되는데, 특히 백내장 수술 후 상처 치유나 만성 부상으로 고통받는 당뇨병 환자들에게 있어서 중요하게 사용되고 있다.

[3] 피부노화는 시간의 흐름에 의한 자연노화와 같은 내적요인에 의한 노화와 자외선이나 유해 물질등과 같은 외적 요인에 의한 노화로 야기된다. 노화가 진행이 되어 나이가 들면 피부의 히알루론산이 현격하게 감소하고 이에 따른 피부 탄력이 저하되는 것이 보고되고 있다 (Ghersetich et al., Int J Dermatol 1994, 33:119-122). 또한 자외선에 노출되면 히알루론산 생성을 멈추고 분해하기 시작하는데 분해물이 피부에 축적되고 히알루론산 분해 물질은 면역세포에 염증 신호를 전달하면서 염증을 일으키는 면역반응에 관여하기도 한다. 결과적으로 자외선에 의해 히알루론산이 분해되어 피부탄력이 저하되고 염증반응이 유발되는 것이다. 그러므로 피부의 히알루론산 생성 및 함량을 유지하는 것은 건강하고 탄력있는 피부를 유지하고 피부노화를 최소화하거나 예방하는데 중요하다고 할 수 있다.

[4] 히알루론산 합성은 히알루론산 합성 효소 (Hyaluronic acid synthase; HAS)에 의하여 이루어지는데 1(HAS1), 2(HAS2), 그리고 3(HAS3)의 세가지 형태가 알려져 있다. 표피생성인자 (Epidermal growth factor; EGF)에 의하여 표피세포에서의 HAS2 유전자 발현과 히알루론산 단백질 생성이 증진되는 것이 보고된 바 있다 (Pienimaki et al., J Biol Chem 2001, 276: 20428-20435). 또한 인간 피부 섬유세포에서 시클릭 포스파티딕산(Cyclic phosphatidic acid)과 리소포스파티딕산 (lysophosphatidic acid)이 CREB 전사 인자 조절을 통해 히알루론산 합성을 촉진한다는 것이 최근에 보고되었다 (Maeda-Sano et al., Biochim Biophys Acta 2014, 1841: 1256-1263). 하지만 천연물에 의한 히알루론산 합성 조절이나 촉진에 대해서는 연구, 보고된 바가 별로 없다.

[5] 로케트(Eruca Sativa)는 지중해 연안 지역 기원의 식물로 고대 로마 시대 이래 의학 관련 문헌에 등장하기 시작한다.‘활기를 불어넣어준다 (aphrodisiac)’고 알려진 로케트는 샐러드나 피자 등의 음식으로 섭취하며 비타민과 포타슘이 풍부한 걸로 알려져 있다. 쌉사름한 맛으로 여러 가지 지중해 음식의 재료로 쓰이며 여러 질병에 약효가 있는 약용식물로도 사용된 기록이 존재한다.

[6] 본 발명에서는, 로케트 추출물이 인간 피부 각질 세포에서 히알루론산 생성을 촉진하는 물질로서 히알루론산 합성 효소의 유전자 발현을 증가시키고 세포 배양액으로의 히알루론산 분비를 증가시키는 효능이 있음을 발견하였다. 또한 로케트 추출물이 자외선을 효과적으로 흡수한다는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명의 목적은 로케트 추출물을 유효 성분으로 함유하는 히알루론산 생성 촉진용 조성물을 제공하는데 있으며 자외선을 효과적으로 흡수하여 자외선에 의한 피부노화를 예방하고 피부 탄력 증진을 증진시키며 퇴행성 관절염 치료 또는 예방용 등으로 로케트 추출물을 제공하는 데 있다.

[7] 본 발명에서는 인간 피부를 포함한 신체에, 피부탄력, 노화방지, 관절 건강 등에 중요한 역할을 하는 히알루론산을 효과적으로 공급할 수 있는 방법으로서 로케트 추출물을 피부 외용제, 약학 또는 식품 조성물로서 제공하여 자외선에 의한 피부 노화를 방지하고 히알루론산 생성 효소 발현 및 생성을 효과적으로 증진시키고자 한다.

[9] 본 발명의 목적을 달성하기 위한 피부 외용제, 약학 또는 식품 조성물은 로케트 식물을 건조, 분쇄한 후 유기 용매를 활용한 추출 및 농축과정과 녹색 색소 제거 과정을 거쳐 로케트 식물의 정제된 유효 성분을 함유하는 조성물로 구성된다.

[10] 본 발명에 의한 로케트 추출물로 이루어진 조성물은 자외선을 흡수하고 인간 세포 내에서 히알루론산 생성을 촉진하여 피부 탄력을 증진하고 피부 노화를 억제하며 퇴행성 관절염을 예방할 수 있는 피부 외용제, 약학 및 식품 조성물을 제공할 수 있다.

[11] 도 1은 본 발명의 로케트 추출물에 의한 인간 표피 피부 세포주에 대한 독성 확인 그래프.
도 2는 본 발명의 로케트 추출물에 의한 인간 표피 피부 세포주에서의 히알루론산 생성 효소 (Hyaluronic acid synthase 1,2 & 3) 유전자 발현 효과를 나타내는 결과도.
도 3는 본 발명의 로케트 추출물 처리시 인간 표피 세포 배양액에서 히알루론산 양이 증가되는 효과를 나타내는 결과도.
도 4은 본 발명의 로케트 추출물의 자외선 파장에서의 농도별 흡광도를 나타내는 그래프.

[12] 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 히알루론산 생성 촉진 효과가 우수한 로케트 추출물을 유효 성분으로 하는 피부 외용제, 약학 또는 식품 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 로케트 추출물의 효능을 극대화하고 제품 적용을 최적화하기 위해 식물의 녹색 색소를 제거하는 방법을 적용하여 자외선 흡수 효능을 극대화하고 히알루론산 합성 효소의 유전자 발현을 증가시키며 결과적으로 히알루론산 생성을 촉진함으로써 피부 노화를 저해하고 피부 탄력을 증진하며 관절염 등의 치료에 쓰일 수 있다. 본 발명은 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에탄올 또는 정제수를 사용하거나 혼합 사용하며, 화장료용의 각종 기제 및 첨가제, 유기용제 등에 대한 용해성, 친화성 및 안정성이 좋은 조성물을 제공한다.

[13] 본 발명의 일 실시예에서 상기 로케트 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10.0 중량%, 상세하게는 0.005~5.0 중량%로 함유될 수 있다. 0.001 중량% 미만으로 함유되면 히알루론산 생성 촉진 효과가 거의 없고, 10 중량% 초과로 함유되면, 피부독성 등의문제가 생길 수 있다.

[14] 본 발명의 일 실시예에서 상기 추출물은 원료를 유기용매에 침적하여 추출한 후 여과, 감압 및 농축하여 얻은 농축물을 사용할 수 있다. 또는 상기 농축물을 다시 건조시켜 제조한 침체, 전제, 정기 및 유동 엑기스를 사용할 수 있다. 상기 침적물은 로케트를 유기 용매를 사용하여 냉침, 페르콜레이션(percolation), 온침 등의 임의의 방법에 의해 침적하여 유효성분을 함유한 침적물을 얻을 수 있다.

[15] 상기 로케트는 로케트를 자연건조 또는 강제건조 등 임의의 방법으로건조하여 잘게 자르거나 기계를 사용하여 분쇄할 수 있다. 상기 유기 용매는 C1~C4의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

[16] 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 히알루론산 생성 촉진용일 수 있다. [17] 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 피부 노화 방지용일 수 있다. 유효성분에 따른 피부 노화 방지 효과로는 피부 탄력 증대 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 재생 효과 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

[18] 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 일반적으로 피부 외용에 사용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념이며, 예를 들어 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수있다. 화장료 조성물로는 예를 들어, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료, 바디용 화장료 등이 있을 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.

[19] 예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 로션, 바디로션, 영양 크림, 마사지 크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 젤, 패치, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료, 립스틱, 메이크업베이스 또는 파운데이션 등의 색조 화장 료, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 치약 또는 구강 청정제 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물로 제형화 될 수 있다.

[20] 상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.

[21] 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

[22] 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

[23] 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

[24] 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

[25] 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코 시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

[26] 본 발명의 일 실시태양에서, 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다.

[27] 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시 에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 스테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.

[28] 본 발명의 일 실시태양에서, 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종 의기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.

[29] 방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.

[30] 그리고, 본 발명의 일 실시태양에서 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수 제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

[31] 또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

[32] 본 발명의 일 실시예에서 약학 조성물은 로케트 추출물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[33] 각 제형에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.

[34] 또한, 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우에, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

[35] 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다.

[36] 이하, 본 발명의 실시예,비교예 및 실험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예, 비교예 및 시험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[37] [실시예 1] 로케트 추출물의 제조

[38] 본 발명에 사용되는 로케트 추출물을 제조하기 위해 신선한 로케트를 확보하여 50ºC 내지 100ºC에서 1시간 이상 48시간 이내 건열풍 건조기에서 건조하는데 이는 미생물의 오염도를 낮추면서 유기용매에 의한 추출효율을 높이고 영양성분이 파괴되지 않고 활성화되도록 하기 위함이다.

[39] 건조가 완료된 후 원료는 분쇄된 후 정제수 혹은 저급 알코올 특히 에탄올을 혼합 첨가하여 30ºC 내지 60ºC 온도의 저온 초음파 추출 방법을 사용하여 교반하여 추출액을 0.45uM pore-size bottle-top filter (Corning, U.S.A)로 필터링하여 회수한 후 감압농축하여 농도를 결정한 후 각 실험예에 사용하였다.

[40] [실시예 2] 화장료 조성물 제조예

[41] 실시예 1에서 얻은 로케트 추출물을 함유한 피부 외용제 조성물 제조예를 아래 표 1에 나타내었다.

[42] 표1. 피부 외용제 조성물 제조예

성분(함량 중량%)	비교 제형예	제형예1
정제수	87.37	86.37
부틸렌글라이콜	5	5
에탄올	3	3
피이지-75	2	2
비스-피이지-18메칠에텔디메칠실란	0.5	0.5
아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머	0.4	0.4
소듐폴리아크릴레이트	0.35	0.35
페녹시에탄올	0.3	0.3
암모늄아크릴로일디메칠타우레이트/브이피코폴리머	0.3	0.3
피이지-60하이드로제네이티드캐스터오일	0.2	0.2
소듐폴리아크릴레이트	0.15	0.15
잔탄검	0.1	0.1
포타슘하이드록사이드	0.08	0.08
디소듐이디티에이	0.05	0.05
에칠헥실글리세린	0.05	0.05
멘톡시프로판디올	0.05	0.05
로케트 추출물	0	1
향료	0.1	0.1
총중량	100	100

[43] [실험예 1] 실시예 1에 의한 MTT 세포 독성 테스트

[44] 로케트 추출물에 의한 세포 독성을 측정하기 위하여 불사화된 인간 표피부 상피 세포주 HaCaT을 사용하였다. 상기 세포를 10% 우태아 혈청 (Life Technologies, Inc.)와 항생제 (페니실린 100IU/L 및 스트렙토마이신 100ug, Life Technologies, Inc.)를 함유하는 DMEM 배지 (Dulbecco’s modified Eagle’s media)에서 37ºC, 5% CO₂하에 배양하였다. 세포는 신선한 배지로 3~4일에 한번씩 교체해 주고 밀도가 최상에 도달하면 1:5~1:10의 분할비로 2차 배양하였다. 로케트 추출물이 인간 표피 세포주에 미치는 영향을 테스트하기 위하여 96-웰 플레이트에 각 웰당 1~2X10⁴수의 세포를 분주하고 24시간 후에 로케트 추출물을 각 농도로 처리하고 2~3일동안 배양하였다. 대조군은 비히클 (vehicle) (디메틸설폭시드, DMSO)이 포함된 배지에서 배양하였다. 이렇게 배양된 세포는 제조업자의 지시에 따라 MTT {3,(4,5-dimtthylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma} 테스트를 수행하였고 그 결과를 도1에 나타내었다. 도1에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때 로케트 추출물(실시예)은 100ppm을 비롯한 여러 농도에서 인간 표피 세포주의 성장에 별다른 독성을 야기하지 않았다.

[45] [실험예 2] 히알루론산 합성 효소의 유전자 발현 분석

[46] 2-1. 세포 배양 및 RNA 제조

로케트 추출물이 인간 피부 상피 세포주에서 히알루론산 합성 효소의 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 실험예1과 같이 배양된 HaCaT 세포주를 사용하였다. 유전자 발현 분석을 위한 RNA 제조를 위하여 HaCaT 세포주를 실시예를 농도별로 함유한 무혈청 배지에서 24~48시간 배양하고 Qiagen사의 RNeasy Kit을 활용하여 제조업자의 지시에 따라 RNA를 제조한 후 자외선 흡광도 법으로 농도를 측정하고 질을 체크하였다.

[47] 2-2. PCR 을 통한 히알루론산 합성 효소의 유전자 발현에 미치는 영향 측정

[48] 상기에서 제조된 RNA 1ug을 역전사하고 실시예가 히알루론산 합성 효소의 유전자 발현에 미치는 영향을 정량 PCR (quantitative RCR) 방법으로 분석하였다. 히알루론산 합성 효소 3가지 (HAS1, 2 & 3)의 특이적인 프라이머는 아래 표2와 같다. PCR 반응은 Thermocycler 에서 94ºC에서 5분간 변성 반응을 거친 후 94ºC에서 30초, 60ºC에서 30초, 72ºC에서 30초간의 사이클을 25 또는 35회 반복하였다. PCR 결과를 아가로오즈 젤에 전기영동하고 염색하여 관찰한 결과를 도2에 나타내었다. 유전자 발현 표준화는 GAPDH 유전자의 PCR결과를 기준으로 하였다. 도 2에 나타난 결과와 같이, 로케트 추출물(실시예)은 100ppm에서 HAS 2의 유전자 발현을 현저하게 증가시키는 것으로 관찰되었다. 비히클 대조군(C)는 DMSO, 양성대조군(K)에는 캠페롤 10uM을 처리하였으며 K는 HAS3에 대한 효과가 관찰되었다.

[49] 표2. 프라이머 정보

유전자		프라이머 서열
HAS1	정방향 (Forward)	5'-AGG TCA TGT ACA CAG CCT TC-3'
HAS1	역방향 (Reverse)	5'-CAG CAG AGG GAC GTA GTT AG-3'
HAS2	정방향 (Forward)	5'-GCT ACC AGT TTA TCC AAA CG-3'
HAS2	역방향 (Reverse)	5'-GGA GTT TCT GTA CAT TCC CA-3'
HAS3	정방향 (Forward)	5'-GAG GAC TGG TAC CAT CAG AA-3'
HAS3	역방향 (Reverse)	5'-ACC GTT CTT TGC ATT TTA GA-3'

[50] [실험예 3] 실시예 1에 의한 인간 표피 세포주 HaCaT에서의 히알루론산 생성 증진 효과 분석

[51] 히알루론산은 원형질막에서 생성이 이루어지고 세포 외부로 분비된다. 이에 따라, 로케트 추출물에 의한 히알루론산 합성 효소의 유전자 발현 증가가 히알루론산 생성 증가 및 분비로 이어지는지 확인하기 위하여 인간표피 세포주 HaCaT 배양액(RPMI)에 함유된 히알루론산을 CTAB turbidimetric method 방법으로 정량 분석하였다 (Oueslati et al., Carbohydrate Polymers 2014, 112:102-108; Chen & Wang, Carbohydrate Polymers 2009, 78: 178-181). 음성 대조군 (비히클)은 DMSO로 처리하였으며 양성 대조군은 히알루론산 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 표피 성장 인자 (Epidermal Growth Factor; EGF) 20ng/mL을 처리하였다. 실시예에 설명된 로케트 추출물을 농도별로 처리하고 48시간 이상 배양하여 그 배양액을 시료로 하여 분석하였다. 자세한 설명으로는, 먼저 헥사데실트리메틸암모니움 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium Bromide, CTAB; Sigma) 2.5g을 2% (W/V) NaOH 용액 100mL에 녹인다. 96-웰 플레이트에 50uL의 인산완충용액(PBS, pH 7.0)을 채우고 각 시료 50uL를 잘 섞고 37ºC에서 10분간 반응시킨다. 이 후에, 위에 상기한 CTAB 시약 100uL을 섞어주고 37ºC에서 15분간 더 반응시킨다. 반응이 끝난 후 400nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 대조군(블랭크)는 세포가 배양되지 않은 RPMI 배지로 대신하였다. 인간표피세포주에 로케트 추출물 (실시예)를 처리하였을 때 세포 배양액에 분비된 히알루론산은 20ppm 처리시 음성대조군 대비 60% 증가하였으며 100ppm 처리시 4배 가까이 증가하는 것이 관찰되었다 (도3). 이에 따라, 로케트 추출물은 효과적으로 히알루론산 생성을 촉진하는 것으로 나타났다.

[52] [실험예4] 실시예 1에 의한 자외선 흡광도 분석

[53] 피부 노화를 촉진하는 외인성 요인에 해당하는 자외선을 차단 또는 흡수하는 효능은 피부 노화를 지연하고 피부 탄력 저하를 예방할 수 있다. 로케트 추출물에 대한 자외선 차단 효능을 측정하기 위하여 자외선 영역 (UVA 320-400nm ;UVB 280-320nm)에 대한 흡광도 측정을 실시하였다. 상기 실시예 1에서 준비된 로케트 추출물은 농도별로 정제수(블랭크)와 희석되어 파장 200~999nm에 대한 흡광도를 BioTek multiplate reader기를 활용하여 측정하고 그 결과를 도3에 나타내었다. 로케트 추출물은 자외선 영역에 해당하는 280-400nm에서 자외선을 효과적으로 흡수하는 것으로 관찰되었다 (도4).

Claims

로케트(Rocket, Eruca sativa) 추출물을 함유하며,
상기 로케트 추출물은 히알루론산 생성 촉진을 유도하는, 탄력 증진용 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 로케트 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 로케트(Rocket, Eruca sativa)를 유기 용매에 침적하여 추출한 후 여과, 감압 농축하여 얻은 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 유기 용매는 C₁-C₄의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 녹색 색소가 제거된 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 자외선을 흡수하여 피부 노화를 방지하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 피부 외용제 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 로션, 크림, 에센스, 팩, 패치, 메이컵베이스, 보습 오일, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 립스틱, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 무스, 양모제, 염모제, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형 및 스프레이로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형의 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 피부 외용제 조성물은 점적제, 연고, 로션, 젤, 크림, 패치, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 제형의 조성물인 것을 특징을 하는 피부 외용제 조성물.
로케트(Rocket, Eruca sativa) 추출물을 함유하며,
상기 로케트 추출물은 히알루론산 생성 촉진을 유도하는, 상처 치유(wound healing)용 약학 조성물.
삭제
로케트(Rocket, Eruca sativa) 추출물을 함유하며,
상기 로케트 추출물은 히알루론산 생성 촉진을 유도하는, 피부 탄력 개선용 식품 조성물.