WO2019107496A1 - 感覚刺激低減剤の評価又は選択方法 - Google Patents

感覚刺激低減剤の評価又は選択方法 Download PDF

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WO2019107496A1
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sulforaphane
ces1
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glycoside
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理恵 二ノ宮
貴史 西島
紀子 佐藤
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花王株式会社
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    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating or selecting a sensory stimulus reducing agent that suppresses sensory stimuli caused by parabens, and to a sensory stimulus reducing agent for alleviating the sensation caused by parabens.
  • Skin external preparations such as skin cosmetics often incorporate a preservative into the preparation to prevent bacterial contamination and reproduction.
  • parabens are most frequently incorporated in external preparations for skin as preservatives having high antibacterial activity and high safety.
  • sensitive skin people parabens may sometimes feel transient discomfort such as pizziness and irritability.
  • Patent Document 1 the stimulation to the hair dye and the stimulation inhibitor consisting of a hydrophobic group-containing polysaccharide derivative which suppresses the stimulation to the surfactant.
  • the hair dye stimulus inhibitor (patent document 2) to suppress is reported.
  • the inhibitor of TRPA1 can be used as a parabens irritation
  • stimulation inhibitor (patent document 3).
  • germinated broccoli which is a germinated broccoli (Brassica oleracea var. Italica) belonging to the family Brassicaceae
  • a plant having a high content of sulforaphane and its extract includes whitening, wrinkles, and tarmi, etc.
  • Patent Document 4 a germinated broccoli (Brassica oleracea var. Italica) belonging to the family Brassicaceae
  • Patent Document 4 a sebum production promoting action
  • sprouted broccoli extract or sulforaphane to prevent or improve sensitive skin.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Publication No. 2001-64185
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Publication No. 2002-363053
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Publication No. 2008-79528
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Publication No. 2003-155221
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application No. 2009-114152
  • the present invention provides the following 1) to 11).
  • 1) A method for evaluating or selecting a sensory irritation reducing agent by parabens comprising the following steps (1) to (3): (1) contacting the test substance with a cell capable of expressing CES1 (2) measuring the expression of CES1 in the cell (3) promoting expression of CES1 based on the result measured in (2) Step 2) evaluating a test substance to be treated as an agent for reducing sensory irritation by parabens 2)
  • An agent for reducing sensory irritation comprising sulforaphane, sulforaphane or a plant containing glucoside thereof or an extract thereof as an active ingredient.
  • a CES1 expression promoter comprising, as an active ingredient, sulforaphane, or a plant containing sulforaphane or a glycoside thereof, or an extract thereof.
  • sulforaphane or a plant containing sulforaphane or a glycoside thereof or an extract thereof for producing a sensory irritation reducing agent.
  • a method for promoting CES1 expression which uses sulforaphane or a plant containing sulforaphane or a glycoside thereof or an extract thereof.
  • IL-1 ⁇ production in three-dimensional cultured epidermis MP: methyl p-hydroxybenzoate added, PHBA: p-hydroxybenzoic acid added. Data are mean ⁇ SD. Skin sensory irritation score in sensitive skin. MP: methyl p-hydroxybenzoate coated, PHBA: p-hydroxybenzoic acid coated.
  • the present invention relates to providing a method of evaluating or selecting a sensory stimulus reducing agent, which reduces sensory stimulation by parabens.
  • the present invention also relates to providing a sensory stimulus reducing agent that reduces sensory stimulation by parabens.
  • the present inventors examined sensory stimulation caused by parabens, and it was found that methyl paraben is metabolized by the metabolic enzyme carboxylesterase 1 (CES1) in vivo to be converted to p-hydroxybenzoic acid (PHBA), We find that there is almost no sensory stimulation in humans, and that people with sensitive skin have a lower expression of CES1 compared to healthy people, and using CES1 as an indicator reduces sensory stimulation by parabens It has been found that agents can be searched or evaluated. The present inventors have also found that extracts of plants containing sulforaphane such as sulforaphane and germinated broccoli have an expression promoting action of CES1 and can be a sensory irritation reducing agent having an effect of reducing sensory irritation by parabens.
  • CES1 carboxylesterase 1
  • PHBA p-hydroxybenzoic acid
  • the present invention it is possible to search for or evaluate a new mechanism of sensory stimulation reducer that rapidly decomposes parabens in the living body and reduces sensory stimulation caused by the parabens. Moreover, according to the present invention, it is possible to provide a novel mechanism of sensory stimulation reducer, which rapidly decomposes parabens in the living body and reduces sensory stimulation caused by the parabens.
  • parabens examples include methyl paraben (methyl p-hydroxybenzoate), ethyl paraben (ethyl p-hydroxybenzoate), propyl paraben (propyl p-hydroxybenzoate), isopropyl paraben (p-hydroxy) P-hydroxybenzoic acid esters such as isopropyl benzoate), butyl paraben (butyl p-hydroxybenzoate), isobutyl paraben (isobutyl p-hydroxybenzoate), benzyl paraben (benzyl p-hydroxybenzoate), and sodium salts thereof .
  • the sensory stimulation reduction by parabens means suppressing or relieving transient unpleasant irritation such as skin's tingling sensation or tingling sensation caused by parabens.
  • CES1 refers to carboxylesterase 1, also known as serine esterase 1 or SES1.
  • SES1 serine esterase 1
  • This enzyme is a member of the family of mammalian liver carboxyesterases (EC 3.1.1.1) and hydrolyzes endogenous substrates with ester, thioester or amide functional groups.
  • expression in lung and skin other than liver has been reported, and it is involved in metabolic activation of drugs and detoxification of foreign substances such as chemical substances.
  • inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ ) in the culture medium are cultured after adding methyl p-hydroxybenzoate (MP) or p-hydroxybenzoic acid (PHBA) to a human three-dimensional cultured epidermal model The amount was measured.
  • MP methyl p-hydroxybenzoate
  • PHBA p-hydroxybenzoic acid
  • the method for evaluating or selecting a sensory irritation reducing agent by parabens includes the following steps (1) to (3). (1) contacting the test substance with a cell capable of expressing CES1 (2) measuring the expression of CES1 in the cell (3) promoting expression of CES1 based on the result measured in (2) Evaluating the test substance to be treated as a sensory irritation reducing agent by parabens
  • cells capable of expressing CES1 include cells having a CES1 gene and capable of expressing the CES1 gene, and cells into which the CES1 gene can be exogenously introduced and capable of being expressed.
  • the cells may be cells collected from a living body or cells contained in a tissue or organ collected from a living body, and may be cultured cells.
  • the cell is a cell derived from a mammal, more preferably a cell derived from human.
  • Cells having the CES1 gene and having the ability to express it naturally include cells derived from any tissue of the living body, preferably from skin taken from a mammal (preferably human) Cells, for example, cells derived from epidermal tissue (epidermal keratinocytes etc.), cells derived from dermal tissue (fibroblasts etc.), cell cultures derived from these cells, organ cultures etc. Cells derived from are preferred, and epidermal keratinocytes are more preferred.
  • Cells in which the CES1 gene can be exogenously expressed can be obtained by introducing an expression vector incorporating the CES1 gene into any mammalian cell and transforming the cell.
  • the transcriptional regulatory region (promoter or the like) in the expression vector is not particularly limited as long as expression control can be carried out in the same manner as in vivo, but it is preferable to use the transcriptional regulatory region (promoter or the like) of the CES1 gene.
  • a cell in which the CES1 gene can be expressed exogenously a cell in which a vector in which a reporter gene is linked to a transcriptional regulatory region (promoter or the like) of the CES1 gene can also be used.
  • a method for producing a vector incorporating a transcriptional regulatory region (promoter etc.) of the CES1 gene or CES1 gene and a method for introducing the vector into mammalian cells are well known to those skilled in the art.
  • CES1 cells other than the above-described cells derived from and capable of expressing the CES1 gene naturally and cells derived from the cells into which the CES1 gene can be expressed exogenously.
  • Cell lines which can be expressed are mentioned, and cultured cells derived from skin collected from mammals (preferably human) are preferable, and normal human cultured epidermal keratinocytes are more preferable.
  • Three-dimensional cultured skin cells are also suitably used. Specifically, EpiDermTM (manufactured by MatTek Corporation), EpiSkin (manufactured by SkinEthic), RHE (manufactured by SkinEthic), Labcyte epi model (manufactured by J-TEC) Etc.
  • test substance to be brought into contact with the cells is not particularly limited as long as it is a substance desired to be used as a parabens-induced sensory irritation reducing agent, and examples thereof include animals and plants, marine organisms, microorganisms and the like and extracts thereof Natural components derived from: synthetic compounds; mixtures and compositions thereof, and the like.
  • any means known in the art may be used.
  • addition of the test substance to the cell culture medium or direct addition to the cells eg, dropping, application , Spraying, spraying, patches, etc.
  • the concentration and contact amount of the test substance may be appropriately set based on the form of the test substance, chemical properties, cytotoxicity, expected strength of skin sensitization and the like.
  • a predetermined amount of the test substance diluted to an appropriate concentration may be exposed to the cells under conditions of 37 ° C., 5% CO 2 for 24 to 48 hours.
  • the expression of CES1 in the above cells can be measured using the expression of CES1 protein, the activity of CES1 protein, the expression of CES1 mRNA encoding the protein, the activation of the promoter of CES1 gene and the like as an index.
  • the measurement may be performed according to a method known in the art as a method of measuring a parameter serving as an index (eg, protein expression, biological activity of protein, mRNA expression, activation of CES1 gene promoter, etc.).
  • methods of measuring mRNA expression include dot blot method, Northern blot method, RT-PCR, real-time RT-PCR, microarray, etc., and combinations thereof.
  • fluorescence / optical measurement of promoter activity or transcription activity using a reporter gene
  • methods for measuring protein expression include SDS-PAGE, chromatography, immunoassay (eg, immunohistochemistry, ELISA, Western blot, immunoprecipitation etc.), colorimetric assay, mass spectrometry etc., and These combinations are mentioned.
  • the activity of the CES1 protein is measured, for example, by exposing CES1-expressing cells to methyl p-hydroxybenzoate which is a substrate of CES1, culturing it for a certain period of time, and then quantifying p-hydroxybenzoic acid in the culture solution by HPLC. be able to.
  • the expression promoting effect of CES1 of the test substance is evaluated, for example, before and after addition of the test substance or without the test substance added group and the test substance added It is performed by comparing with a group or a control substance addition group. Alternatively, the evaluation can be performed by comparing the measurement results between various concentrations of test substances. And the test substance which raises or accelerates
  • the agent for reducing sensory irritation caused by parabens thus obtained can be used by being added to cosmetics, pharmaceuticals, etc. containing parabens in order to reduce sensory irritation caused by parabens.
  • extracts of plants containing sulforaphane and sulforaphane such as sprouted broccoli have an action promoting action of CES1 expression, and these have been found as sensory stimulation reducing agents. That is, the present invention further provides a sensory irritation-reducing agent or a CES1 expression promoter, which comprises, as an active ingredient, sulforaphane, or a plant containing sulforaphane or glycoside thereof, or an extract thereof.
  • sulforaphane refers to 4- (methylsulfinyl) butyl isothiocyanate.
  • Sulforaphane can be obtained from a plant containing sulforaphane or a glycoside thereof by isolation and purification by a known method.
  • the isolated and purified sulforaphane is commercially available from Sigma Aldrich Co., etc. In the present invention, the commercially available product can also be used.
  • the isolated sulforaphane but also the above-mentioned sulforaphane or a plant containing the glucoside thereof or an extract thereof can be an active ingredient of the organoleptic agent or the CES1 expression promoter.
  • the plant containing sulforaphane or a glycoside thereof include plants of the family Brassicaceae, preferably plants of the family Brassica. Specifically, broccoli, cauliflower, cabbage and the like can be mentioned. Among them, broccoli (Brassica oleracea var.
  • Italica is preferable in view of the content of sulforaphane, and germinated broccoli (also referred to as “broccoli sprout”) until it becomes a grown body after germination is more preferable.
  • germinated broccoli also referred to as “broccoli sprout”
  • sulforaphan glucosinolate etc. are mentioned.
  • a crushed material, a lyophilizate, squeezed juice or the like of all or part of the plant For example, in the germinating broccoli, a dried crushed material of a sprout, a cotyledon, a seed, a part of a root or whole grass of a germinating body can be suitably used.
  • the extract of plants include various solvent extracts obtained by extraction by a known extraction method, dilutions thereof, concentrates thereof or dried powder thereof. Examples of known extraction methods include immersion, extraction, leaching, solid-liquid extraction, reflux extraction, supercritical extraction, ultrasonic extraction, microwave extraction and the like.
  • immersion may be performed by immersion and leaching at 0 ° C. to solvent boiling point (preferably 15 to 40 ° C.) for 1 hour to 4 weeks, and solid-liquid extraction may be performed at 0 ° C. to solvent boiling point (preferably 15 to 40) Stirring or shaking at 30 to 1000 rpm for 30 minutes to 2 weeks.
  • solid-liquid extraction may be performed at 0 ° C. to solvent boiling point (preferably 15 to 40) Stirring or shaking at 30 to 1000 rpm for 30 minutes to 2 weeks.
  • means for extracting under a so-called non-oxidative atmosphere while boiling degassing or bubbling an inert gas such as nitrogen gas to remove dissolved oxygen.
  • inert gas such as nitrogen gas to remove dissolved oxygen.
  • reflux extraction it can carry out using extraction instruments, such as a Soxhlet extractor.
  • a solvent for extraction either a polar solvent or a nonpolar solvent can be used.
  • the solvent include, for example, water; monohydric, dihydric or polyhydric alcohols; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; Cyclic ethers; Polyethers such as polyethylene glycol; Saturated or unsaturated hydrocarbons such as hexane; Aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene; Halogenated carbides such as dichloromethane, chloroform, dichloroethane and carbon tetrachloride Hydrogens; Pyridines; Dimethylsulfoxide; Acetonitrile; Carbon Dioxide, Supercritical Carbon Dioxide; Fats and oils, waxes, other oils, and mixtures thereof.
  • water, alcohols and mixtures thereof are mentioned.
  • the alcohol examples include, but are not limited to, monohydric alcohols such as methanol, ethanol, propanol, butanol, amyl alcohol, hexanol, heptanol, octanol, etc .; 1,3-butylene glycol, ethylene glycol, propylene glycol, 1 Examples thereof include dihydric alcohols such as 2,4-butanediol, 1,5-pentanediol and 1,6-hexanediol; and trivalent or higher alcohols such as glycerin. Among these, monohydric alcohols and dihydric alcohols are preferable in terms of pharmacological activity and operability. Also preferably, the alcohol may be an alcohol having 1 to 10 carbon atoms, more preferably an alcohol having 1 to 4 carbon atoms.
  • Preferred examples of the above-mentioned alcohols include methanol, ethanol, 1,3-butylene glycol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, t-butanol and the like.
  • the concentration of the alcohol in the aqueous solution of the alcohol is preferably 20% by mass or more, more preferably 30% by mass or more, more preferably 40% by mass or more, and preferably 80% by mass or less, more preferably 70 It is at most mass%, more preferably at most 60 mass%. Further, the concentration of the alcohol in the aqueous solution of the alcohol is preferably 20 to 80% by mass, more preferably 30 to 70% by mass, and still more preferably 40 to 60% by mass.
  • ethanol is more preferable from the viewpoint of versatility.
  • more suitable solvents for preparing the extract of plants include water, ethanol, aqueous ethanol.
  • the amount of the solvent used in the extraction is preferably 1 to 1000 mL per 1 g of plant (dry mass conversion).
  • the volume as used herein means the volume at 25 ° C.
  • dry mass means the mass of the dry solid which is the residue which dried the sample with a 105 degreeC electric constant temperature dryer for 3 hours, and remove
  • the extraction conditions are not particularly limited as long as sufficient extraction can be performed.
  • the extraction time is preferably 1 hour or more, more preferably 3 days or more, more preferably 1 week or more, while preferably 2 months or less, more preferably 5 weeks or less, more preferably 2 weeks or less .
  • the extraction temperature is preferably 0 ° C. or more, more preferably 5 ° C.
  • extraction is performed for a long time at low temperature and for a short time at high temperature.
  • extraction conditions include, but are not limited to, 3 days to 5 weeks at 15 to 40 ° C., preferably 1 to 2 weeks, 1 to 5 hours at 60 to 90 ° C., etc. It can be selected.
  • a plant extract can be used as it is, but after diluting, concentrating or drying the extract, it can also be used as a powder or paste.
  • the solvent usually used for extraction at the time of use such as water, ethanol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, water / ethanol mixture, water / propylene glycol mixture, water / 1,3-butylene glycol
  • it can also be used after diluting it with a solvent such as a mixed solution.
  • it can be used by being encapsulated in vesicles such as liposomes or microcapsules.
  • the plant extract thus obtained may be subjected to separation / purification steps such as treatment with a synthetic adsorbent, filtration treatment, concentration treatment, etc., as needed, to increase the content of sulforaphane.
  • a germinated broccoli extract having an increased content ratio of sulforaphane "broccoli sprout extract” (Oriza Oilification Co., Ltd.) is commercially available, and in the present invention, the commercially available product can also be used.
  • the sprouted broccoli extract which is a plant containing sulforaphane and sulforaphane, promotes the expression of CES1 and also has the action of reducing sensory stimulation by parabens. Therefore, a plant containing sulforaphane or sulforaphane or a glycoside thereof or an extract thereof can be a sensory irritation reducing agent or a CES1 expression promoting agent, and can be used to promote the expression of CES1 to reduce sensory stimulation, and It can be used to produce a sensory irritation reducing agent or a CES1 expression promoting agent.
  • "use” may be administration or ingestion to human or non-human animals, and may be therapeutic use or non-therapeutic use.
  • non-therapeutic refers to a concept that does not include medical practice, that is, a concept that does not include a method for surgery, treatment or diagnosis of a human being, more specifically, a doctor or a person who has received instructions from a doctor. It is a concept that does not include a method of performing surgery, treatment or diagnosis.
  • “Sensory stimulus reduction” in the “sensory stimulus reducing agent” of the present invention means to suppress or alleviate transient unpleasant stimulus such as skin's tingling sensation or tingling sensation caused by parabens Means
  • “parabens” are as described above.
  • Such sensory stimulation reduction effects can be measured by sensory evaluation as shown in the examples below.
  • “CES1 expression” in “CES1 expression promoter” preferably includes the expression of CES1 protein, the activity of CES1 protein, the expression of CES1 mRNA encoding the protein, and the activity of the promoter of CES1 gene, Is CES1 mRNA expression.
  • the sensory irritation reducing agent and the CES1 expression promoter may be sulforaphane or sulforaphane or a plant containing glucoside thereof or an extract thereof alone, or an oil, pigment, flavor, preservative, chelate.
  • the form thereof is also not particularly limited, and can be prepared in any form such as solution, emulsion, suspension, gel, solid, powder, granules, aerosol and the like.
  • the compounding amount of sulforaphane or sulforaphane or a plant containing glucoside thereof or an extract thereof in the composition is, as sulforaphane, 0.0001% by mass or more, preferably 0.001% by mass or more of the total mass of the preparation, more preferably Is 0.01% by mass or more, more preferably 0.1% by mass or more, and 99% by mass or less, preferably 95% by mass or less, more preferably 90% by mass or less, still more preferably 80% by mass or less is there.
  • 0.001 to 99% by mass preferably 0.01 to 95% by mass, more preferably 0.1 to 90% by mass, and still more preferably 1 to 80% by mass.
  • the content thereof is 0.001% by mass or more of the total mass of the preparation as a dry solid, preferably 0. .01% by mass or more, more preferably 0.1% by mass or more, further preferably 1% by mass or more, and 99% by mass or less, preferably 95% by mass or less, more preferably 90% by mass or less, more preferably Is 80 mass% or less.
  • 0.001 to 99% by mass preferably 0.01 to 95% by mass, more preferably 0.1 to 90% by mass, and still more preferably 1 to 80% by mass.
  • the agent for reducing sensory irritation or the agent for promoting CES1 expression of the present invention is, for example, a composition containing the above-mentioned parabens (skin cleansing agent, hair cleansing agent, makeup agent, bath agent, permanent wave agent, hair dye, Soaps, kitchen detergents, laundry detergents, cosmetics such as toothpastes, quasi-drugs, pharmaceuticals, household goods, etc.) or compositions separate from compositions containing parabens It is possible to reduce the feeling of irritation caused by the parabens by preparing it and using it simultaneously with the composition or before or after using the composition.
  • parabens skin cleansing agent, hair cleansing agent, makeup agent, bath agent, permanent wave agent, hair dye, Soaps, kitchen detergents, laundry detergents, cosmetics such as toothpastes, quasi-drugs, pharmaceuticals, household goods, etc.
  • the target of application of the agent for reducing sensory irritation or the agent for promoting CES1 expression of the present invention is preferably a human who uses a composition containing parabens and who seeks to reduce the sensation of irritation caused by parabens It can be mentioned.
  • the amounts of the agent for reducing sensory irritation and the agent for promoting CES1 expression are not particularly limited as long as they reduce sensory stimulation.
  • a plant containing sulforaphane or sulforaphane of the present invention or a glucoside thereof or an extract thereof is preferably 10 -7 parts by mass or more, more preferably 10 -6 parts by mass per 1 part by mass of parabens. parts or more, more preferably 10 -5 parts by mass or more, and preferably 10 parts by mass or less, more preferably 1 parts by mass or less, more preferably to a ratio of less than 0.1 part by weight.
  • the ratio may be preferably 10 -7 to 10 parts by mass, more preferably 10 -6 to 1 part by mass, and still more preferably 10 -5 to 0.1 parts by mass.
  • a method for evaluating or selecting a sensory irritation reducing agent by parabens comprising the following steps (1) to (3): (1) contacting a test substance with a cell capable of expressing CES1; (2) measuring the expression of CES1 in the cells; (3) A step of evaluating a test substance which promotes the expression of CES1 as a sensory irritation reducing agent by parabens based on the result measured in (2).
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the parabens are one or more selected from methyl paraben, methyl paraben sodium, ethyl paraben, butyl paraben, propyl paraben, isobutyl paraben, isopropyl paraben and benzyl paraben.
  • the method of ⁇ 2> whose ⁇ 3> parabens are methyl parabens.
  • the cell capable of expressing ⁇ 4> CES1 is a cell derived from human epidermal tissue, and preferably a normal human cultured epidermal keratinocyte.
  • CES1 expression is measured using CES1 protein expression, CES1 protein activity, CES1 mRNA expression encoding the protein, CES1 gene promoter activity, or more, preferably CES1 mRNA expression as an indicator ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • the sensory stimulation reducing agent which uses as an active ingredient the plant containing ⁇ 6> sulforaphane or sulforaphane or its glycoside, or its extract.
  • the CES1 expression promoter which uses as an active ingredient the plant containing ⁇ 7> sulforaphane, sulforaphane or its glycoside, or its extract.
  • sulforaphane or a plant containing sulforaphane or a glycoside thereof, or an extract thereof for producing a ⁇ 8> sensory irritation reducing agent.
  • the sensory stimulation is a feeling of stimulation caused by the peravens.
  • a plant containing sulforaphane or a glycoside thereof is a sprouted broccoli.
  • sulforaphane, sulforaphane or a plant containing glucoside thereof or an extract thereof is used by being incorporated into a composition containing parabens, or the composition The composition is prepared as a separate composition and used simultaneously with the composition or before or after use of the composition.
  • a plant containing sulforaphane or sulforaphane or a glycoside thereof or an extract thereof is a plant containing sulforaphane or sulforaphane or a glycoside thereof, relative to 1 part by mass of the parabens
  • the extract is preferably 10 -7 parts by mass or more, more preferably 10 -6 parts by mass or more, still more preferably 10 -5 parts by mass or more, and preferably 10 parts by mass or less, more preferably 1 as sulforaphane.
  • the compounding amount of sulforaphane or sulforaphane or a plant containing glucoside thereof in the composition or its extract is 0.0001% by mass of the total mass of the preparation as sulforaphane Or more, preferably 0.001% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, further preferably 0.1% by mass or more, and 99% by mass or less, preferably 95% by mass or less, more preferably 90% by mass or less, more preferably 80% by mass or less, or 0.001 to 99% by mass, preferably 0.01 to 95% by mass, more preferably 0.1 to 90% by mass, still more preferably 1 It is up to 80% by mass.
  • the blending amount of the sulforaphane or the glycoside-containing plant in the composition or the extract thereof is 0.001% by mass of the total mass of the preparation as a dry solid content Or more, preferably 0.01% by mass or more, more preferably 0.1% by mass or more, further preferably 1% by mass or more, and 99% by mass or less, preferably 95% by mass or less, more preferably 90% by mass % Or less, more preferably 80% by mass or less, or 0.001 to 99% by mass, preferably 0.01 to 95% by mass, more preferably 0.1 to 90% by mass, still more preferably 1 to 80 It is mass%.
  • Reference Example 1 Comparison of sensory stimulation induced by parabens (evaluation in three-dimensional cultured epidermis) LabCyte EPI-MODEL 24 (Japan Tissue Engineering Co., Ltd.) was used as a human three-dimensional cultured epidermal model.
  • the culture cups were precultured overnight (5% CO 2 , 37 ° C.) in 500 ⁇ L of dedicated assay medium, and then transferred to a 24-well plate containing fresh assay medium.
  • the culture cup After adding 50 ⁇ l of a 16.4 mM aqueous solution of methyl p-hydroxybenzoate (MP) or p-hydroxybenzoic acid (PHBA) to the epidermal tissue in the culture cup and culturing for 6 hours, the culture cup is After 10 washes, the cups were transferred to a 24-well plate containing fresh assay medium and further incubated for 18 hours. After the additional culture, the amount of IL-1 ⁇ in the medium was quantified using Human IL-1 alpha / IL-1F1 Quantikine ELISA Kit (R & D Systems) according to the attached protocol. The results are shown in FIG. From FIG. 1, it is considered that the amount of IL-1 ⁇ known to be enhanced by sensory stimulants is much less in PHBA than in MP, and that the sensory stimulation property of PHBA is extremely weak.
  • MP methyl p-hydroxybenzoate
  • PHBA p-hydroxybenzoic acid
  • Reference Example 2 Comparison of sensory irritation caused by parabens (human evaluation) Subjects who met all of the following criteria were selected as subjects with sensitive skin. 1. Age: 20-55. Sex: Female 3. Those who are aware of sensitive skin 4. Person who corresponds to one or more of the following a or b: a. Choose products that appear to be sensitive skin care products b. Within the past year, I have felt the sensation of using a facial cleanser, skin care product or makeup base to say that it's pimple
  • Stinging test A was performed on the selected subjects by the following method. After face wash with makeup remover and face wash, a 2 cm x 5 cm non-woven fabric impregnated with 600 ⁇ L of a 16.4 mM aqueous solution of methyl p-hydroxybenzoate or p-hydroxybenzoic acid, acclimated for 5 minutes or more under a temperature of 23 ° C and 50% humidity environment.
  • a 2 cm ⁇ 2.5 cm non-woven fabric impregnated with 300 ⁇ L of a 16.4 mM aqueous solution of methyl p-hydroxybenzoate (MP) is brought into contact with the wiping site to initiate contact 30 seconds later, 1 minute later, 2 minutes later, 3 minutes later the score that the subject perceived about the perceived sensory stimuli (0: feel nothing, 0.5 feel slightly, 1.0 feel a little, 2.0: feel clear, 3.0: feel very strong, want to remove the non-woven fabric with strong stimulation)
  • MP methyl p-hydroxybenzoate
  • the mixture was sonicated at 4 ° C. for 2 minutes and centrifuged at 10,000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes to obtain the supernatant as a skin extract.
  • Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) the amount of protein in the skin extract was quantified using bovine serum albumin as a standard protein.
  • the skin extract was used as a sample for polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting as follows.
  • the skin extract was separated by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane (BIO RAD).
  • the transferred PVDF membrane is immersed and blocked in 5% skimmed milk solution, and then primary antibody reaction is performed using an anti-carboxylesterase 1 antibody (R & D Systems, Cat # MAB4920) diluted 1: 200, and diluted to 1: 2000.
  • Secondary antibody reaction was carried out using the horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG antibody (R & D Systems, Cat # HAF 007).
  • HRP horseradish peroxidase
  • Luminescence was generated with Clarity Western ECL Substrate (BIO RAD), and the antibody reaction was detected using LAS-4000 (Fuji Film Co., Ltd.).
  • the bands of CES1 and actin were separately selected from the photographed image of the western blot with an image analysis software CS Analyzer (Ato Corporation), and the band intensities were measured to calculate the strength of CES1 per actin.
  • whether the loading amount of the sample to the polyacrylamide gel is uniform or not was verified by the same experiment using an anti- ⁇ -actin antibody as a primary antibody.
  • each skin extract was adjusted to 50 ⁇ g / mL, methyl p-hydroxybenzoate as a substrate for carboxylesterase 1 was added to 200 ⁇ M, and the reaction was allowed to proceed at 37 ° C. for 5 hours. Thereafter, cold acetonitrile as the same amount as the reaction solution is added to stop the reaction, the metabolite p-hydroxybenzoic acid is quantified by HPLC, and the unit protein, the amount of p-hydroxybenzoic acid produced per unit time is CES 1 It was metabolic activity.
  • the equipment, columns, and measurement conditions used for HPLC are shown below.
  • Example 1 Evaluation of Germinated Broccoli Extract Based on CES1 Expression Normal human epidermal keratinocytes (Life Technologies Japan) are seeded on a 6-well plate so as to be 1 ⁇ 10 5 each well, and HuMedia-KG 2 (Kurabo) is used to After overnight culture, germinated broccoli extract (broccoli sprout extract; Oryza Oil Co., Ltd., for cosmetics) is added to the culture medium to a solid concentration of 0.0001 w / v% or 0.001 w / v% for 48 hours Cultured. The cultured cells were washed with D-PBS (-), and RNA was extracted using RNeasy Mini Kits (Qiagen) according to the attached manual.
  • RNeasy Mini Kits Qiagen
  • RNA concentration was calculated using NanoDrop 1000 (Thermo Fisher scientific). After reverse transcription of total RNA extracted using High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Life Technologies Japan), real-time PCR was performed using 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies Japan) . Real-time PCR is carried out using the above-described reverse transcribed cDNA and CES1 or Taqman primer of RPLP0 as an endogenous control (Life Technologies Japan, CES1: Hs00275627-m1, RPLP0: HS00420895_gH), Taqman Gene Expression Master Mix (Life Technologies Japan) The CES1 mRNA expression levels were compared by the ⁇ CT method. The results are shown in FIG.
  • Example 2 Human Efficacy Test of Germinated Broccoli Extract
  • a male subject who is sensitive to sensitive skin and feels a sensory stimulus to methyl p-hydroxybenzoate (MP) is selected as a subject, and the solid concentration is 0.01%.
  • the sensory stimulus score by the sting test C before and after application was compared.
  • Stinging test C was performed in the following manner. After face wash with makeup remover and face wash, acclimate for 5 minutes or more under a temperature 23 ° C.
  • Example 3 The CES 1 expression promoting effect of sulforaphane Normal human epidermal keratinocytes (Life Technologies Japan) are seeded on a 6-well plate so as to be 1 ⁇ 10 5 each well and cultured overnight in HuMedia-KG 2 (Kurabo) Sulforaphane (Sigma Aldrich) was exposed to cells to a final concentration of 0.1, 10 ⁇ M, and cultured for 48 hours. The cultured cells were washed with phosphate buffer (D-PBS (-)), and RNA was extracted using RNeasy Mini Kits (Qiagen) according to the attached manual. RNA concentration was calculated using NanoDrop 1000 (Thermo Fisher scientific).
  • RNA-to-cDNA Kit High-Capacity RNA-to-cDNA Kit
  • real-time PCR using the 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies Japan) Carried out.
  • Real-time PCR is carried out by using cDNA reverse transcribed as described above and carboxylesterase 1 or Taqman primer of RPLP0 as an endogenous control (Life Technologies Japan, CES1: Hs00275627-m1, RPLP0: HS00420895_gH), Taqman Gene Expression Master Mix (Life Technologies Japan)
  • the gene expression levels were compared by ⁇ CT method using The results are shown in Table 1.

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Abstract

パラベン類による感覚刺激を低減する感覚刺激低減剤を評価又は選択する方法、及びパラベン類による感覚刺激を低減する感覚刺激低減剤を提供する。　以下の（１）～（３）の工程を含む、パラベン類による感覚刺激低減剤の評価又は選択方法。 （１）ＣＥＳ１を発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程、 （２）当該細胞におけるＣＥＳ１の発現を測定する工程、 （３）（２）で測定された結果に基づいて、ＣＥＳ１の発現を促進させる被験物質をパラベン類による感覚刺激低減剤として評価する工程。

Description

感覚刺激低減剤の評価又は選択方法
　本発明は、パラベン類により惹起される感覚刺激を抑制する感覚刺激低減剤の評価又は選択方法、及びパラベン類により惹起される刺激感を緩和する感覚刺激低減剤に関する。
　皮膚化粧品等の皮膚外用剤は、細菌の混入、繁殖を防ぐために防腐剤を製剤に配合する場合が多い。中でも、パラベン類は抗菌力及び安全性が共に高い防腐剤として、最も多く皮膚外用剤に配合されている。しかし、紫外線、乾燥、化学物質等に過敏な人、いわゆる敏感肌の人においては、パラベン類によってピリピリ感やヒリヒリ感等の一過性の不快な刺激感を感じる場合がある。
　これに対し、従来、皮膚に対する刺激感を抑制するものとして、例えば、界面活性剤に対する刺激を抑制する疎水性基含有多糖類誘導体からなる刺激抑制剤（特許文献１）、染毛剤に対する刺激を抑制する染毛剤用刺激抑制剤（特許文献２）が報告されている。また、パラベン類の刺激抑制剤として、ＴＲＰＡ１の抑制物質が使用できることが報告されている（特許文献３）。
　一方、アブラナ科アブラナ属に属するブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ｉｔａｌｉｃａ）の発芽体である発芽ブロッコリーは、スルフォラファンの含有量が高い植物として知られ、その抽出物には、美白、シワ、タルミ等の予防改善作用（特許文献４）や、皮脂産生促進作用（特許文献５）等があることが報告されている。
　しかしながら、発芽ブロッコリーの抽出物やスルフォラファンに敏感肌を予防・改善するというような報告は存在しない。
　　〔特許文献１〕特開２００１－６４１８５号公報
　　〔特許文献２〕特開２００２－３６３０５３号公報
　　〔特許文献３〕特開２００８－７９５２８号公報
　　〔特許文献４〕特開２００３－１５５２２１号公報
　　〔特許文献５〕特願２００９－１１４１５２号公報
　本発明は、以下の１）～１１）を提供する。
　１）以下の（１）～（３）の工程を含む、パラベン類による感覚刺激低減剤の評価又は選択方法。
　（１）ＣＥＳ１を発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程
　（２）当該細胞におけるＣＥＳ１の発現を測定する工程
　（３）（２）で測定された結果に基づいて、ＣＥＳ１の発現を促進させる被験物質をパラベン類による感覚刺激低減剤として評価する工程
　２）スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を有効成分とする感覚刺激低減剤。
　３）スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を有効成分とするＣＥＳ１発現促進剤。
　４）感覚刺激低減剤を製造するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の使用。
　５）ＣＥＳ１発現促進剤を製造するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の使用。
　６）感覚刺激の低減に使用するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物。
　７）ＣＥＳ１の発現促進に使用するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物。
　８）感覚刺激を低減するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の非治療的使用。
　９）ＣＥＳ１発現を促進するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の非治療的使用。
　１０）スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を用いる、感覚刺激低減方法。
　１１）スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を用いる、ＣＥＳ１発現促進方法。
３次元培養表皮におけるＩＬ－１α産生量。ＭＰ：ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル添加、ＰＨＢＡ：ｐ－ヒドロキシ安息香酸添加。データは平均値±ＳＤ。 敏感肌者における皮膚感覚刺激スコア。ＭＰ：ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル塗布、ＰＨＢＡ：ｐ－ヒドロキシ安息香酸塗布。 健常者及び敏感肌者のＣＥＳ１発現量。データは平均値±ＳＤ。 健常者及び敏感肌者のｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルの代謝活性。データは平均値±ＳＤ。 発芽ブロッコリー抽出物のＣＥＳ１発現促進作用。 発芽ブロッコリー抽出物のｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルによる感覚刺激低減作用。
発明の詳細な説明
　本発明は、パラベン類による感覚刺激を低減する、感覚刺激低減剤を評価又は選択する方法を提供することに関する。また、本発明は、パラベン類による感覚刺激を低減する、感覚刺激低減剤を提供することに関する。
　本発明者らは、パラベン類により惹起される感覚刺激について検討したところ、メチルパラベンが生体内において代謝酵素カルボキシルエステラーゼ１（ＣＥＳ１）によって代謝されてｐ－ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢＡ）に変換され、当該ＰＨＢＡには感覚刺激が殆どないこと、更に、敏感肌の人では、健常者に比べてＣＥＳ１の発現が低下していることを見出し、ＣＥＳ１の発現を指標とすることにより、パラベン類による感覚刺激低減剤を探索又は評価できることを見出した。そして、スルフォラファンや発芽ブロッコリーのようなスルフォラファンを含有する植物の抽出物にＣＥＳ１の発現促進作用があり、パラベン類による感覚刺激低減効果を有する感覚刺激低減剤となり得ることを見出した。
　本発明によれば、生体内においてパラベン類を速やかに分解し、パラベン類により惹起される感覚刺激を低減する、新しい機序の感覚刺激低減剤を探索又は評価できる。
　また、本発明によれば、生体内においてパラベン類を速やかに分解し、パラベン類により惹起される感覚刺激を低減する、新しい機序の感覚刺激低減剤を提供できる。
　本発明において、「パラベン類」としては、例えばメチルパラベン（ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル）、エチルパラベン（ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチル）、プロピルパラベン（ｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピル）、イソプロピルパラベン（ｐ－ヒドロキシ安息香酸イソプロピル）、ブチルパラベン（ｐ－ヒドロキシ安息香酸ブチル）、イソブチルパラベン（ｐ－ヒドロキシ安息香酸イソブチル）、ベンジルパラベン（ｐ－ヒドロキシ安息香酸ベンジル）等のパラオキシ安息香酸エステル及びそのナトリウム塩が挙げられる。
　また、「パラベン類による感覚刺激低減」とは、パラベン類により惹起される、皮膚のピリピリ感やヒリヒリ感等の一過性の不快な刺激感を、抑制又は緩和することを意味する。
　本発明において、「ＣＥＳ１」とは、カルボキシルエステラーゼ１を指し、セリンエステラーゼ１又はＳＥＳ１としても知られている。この酵素は、哺乳動物肝臓カルボキシエステラーゼ(EC 3.1.1.1)のファミリーのメンバーであり、エステル、チオエステル又はアミド官能基を有する内因性基質を加水分解する。ヒトでは肝臓以外にも肺、皮膚での発現が報告されており、医薬品の代謝活性化や化学物質等の生体外異物の解毒に関与している。
　後記実施例に示すとおり、ヒト三次元培養表皮モデルにｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル（ＭＰ）又はｐ－ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢＡ）を添加して培養した後、培地中の炎症性サイトカイン（ＩＬ－１α）量を測定したところ、ＭＰを添加した場合にはＩＬ－１α の産生が増加したが、ＰＨＢＡの添加ではＩＬ－１αの産生は殆ど見られなかった（図１）。また、敏感肌を意識する人の皮膚にＭＰ又はＰＨＢＡを塗布し、その刺激感を試験したところ、ＭＰ塗布では何らかの刺激感が感じられたのに対して、ＰＨＢＡの塗布では刺激感は殆ど感じられなかった（図２）。
　更に、健常者および敏感肌者より皮膚を採取し、皮膚中のＭＰの代謝活性とＣＥＳ１の発現量を測定したところ、敏感肌者の皮膚では健常者の皮膚に比べて、ＭＰの代謝活性が低く、ＣＥＳ１発現量が遥かに低いことが認められた（図３、４）
　これらの結果は、ＣＥＳ１の発現を促進する物質は、パラベン類による感覚刺激低減剤として有用であり、また、ＣＥＳ１の発現を指標としてパラベン類による感覚刺激低減剤を評価又は選択できることを示唆している。
　パラベン類による感覚刺激低減剤の評価又は選択方法は、以下の（１）～（３）の工程を含むものである。
　（１）ＣＥＳ１を発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程
　（２）当該細胞におけるＣＥＳ１の発現を測定する工程
　（３）（２）で測定された結果に基づいて、ＣＥＳ１の発現を促進させる被験物質をパラベン類による感覚刺激低減剤として評価する工程
　ここで、「ＣＥＳ１を発現可能な細胞」としては、生来的にＣＥＳ１遺伝子を有し、これを発現する能力のある細胞、及び外来的にＣＥＳ１遺伝子を発現可能に導入された細胞が挙げられる。当該細胞は、生体から採取された細胞、または生体から採取された組織や器官に含まれる細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。好ましくは、当該細胞は、哺乳動物に由来する細胞であり、より好ましくはヒト由来の細胞である。
　生来的にＣＥＳ１遺伝子を有し、これを発現する能力のある細胞としては、生体のあらゆる組織に由来する細胞が挙げられるが、好ましくは、哺乳動物（好ましくはヒト）から採取された皮膚由来の細胞、例えば、表皮組織由来の細胞（表皮角化細胞等）、真皮組織由来の細胞（線維芽細胞等）他、これらの細胞に由来する細胞培養物、器官培養物等が挙げられ、表皮組織由来の細胞が好ましく、表皮角化細胞がより好ましい。
　外来的にＣＥＳ１遺伝子を発現可能にした細胞は、ＣＥＳ１遺伝子を組み込んだ発現ベクターを任意の哺乳動物細胞に導入し、当該細胞を形質転換させることによって得ることができる。発現ベクターにおける転写調節領域（プロモーター等）は、生体内と同様な発現制御が可能であれば特に限定されないが、ＣＥＳ１遺伝子の転写調節領域（プロモーター等）を用いるのが好ましい。また、外来的にＣＥＳ１遺伝子を発現可能にした細胞として、ＣＥＳ１遺伝子の転写調節領域（プロモーター等）にレポータージーンを結合したベクターを導入した細胞を用いることもできる。ＣＥＳ１遺伝子又はＣＥＳ１遺伝子の転写調節領域（プロモーター等）を組み込んだベクターの作製方法及びベクターの哺乳動物細胞への導入方法は、当業者に周知である。
　また、培養細胞としては、上記、生来的にＣＥＳ１遺伝子を有し、これを発現する能力のある細胞、及び外来的にＣＥＳ１遺伝子を発現可能に導入された細胞由来の培養細胞の他、ＣＥＳ１を発現可能な株細胞が挙げられ、哺乳動物（好ましくはヒト）から採取された皮膚由来の培養細胞が好ましく、正常ヒト培養表皮角化細胞がより好ましい。また、３次元培養皮膚細胞も好適に用いられ、具体的には、ＥｐｉＤｅｒｍ　ＴＭ（ＭａｔＴｅｋ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）、ＥｐｉＳｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）、ＲＨＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）、Ｌａｂｃｙｔｅエピモデル（Ｊ－ＴＥＣ社製）等が挙げられる。
　上記細胞に接触される被験物質としては、パラベン類による感覚刺激低減剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されず、例えば、動植物、海洋生物、微生物等及びその抽出物；それらに由来する天然成分；合成化合物；ならびにそれらの混合物及び組成物等が挙げられる。
　上記細胞に被験物質を接触させる手段としては、当該分野で公知の手段であればよく、例えば、当該被験物質の細胞培養培地への添加、または細胞への直接的な添加（例えば、滴下、塗布、散布、噴霧、パッチ等）が挙げられる。被験物質の濃度及び接触量は、被験物質の形態、化学的性質、細胞毒性、予想される皮膚感作性の強度等に基づいて適宜設定すればよい。例えば、適当な濃度に希釈した被験物質の所定量を、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４～４８時間、該細胞に曝露することが挙げられる。
　上記細胞におけるＣＥＳ１の発現は、ＣＥＳ１タンパク質の発現、ＣＥＳ１タンパク質の活性、当該タンパク質をコードするＣＥＳ１ｍＲＮＡの発現、ＣＥＳ１遺伝子のプロモーターの活性化等を指標として測定することができる。測定は、指標とするパラメータ（例えば、タンパク質発現、タンパク質の生物活性、ｍＲＮＡ発現、ＣＥＳ１遺伝子プロモーターの活性化等）の測定方法として当該分野で公知の方法に従って行えばよい。
　測定方法としては、例えば、ｍＲＮＡ発現の測定方法としては、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
　ＣＥＳ１遺伝子のプロモーターの活性測定方法としては、レポーター遺伝子を用いたプロモーター活性や転写活性の蛍光・光学的測定（レポーターアッセイ）が挙げられる。
　タンパク質発現の測定方法の例としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、クロマトグラフィー法、免疫学的測定法（例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降等）、比色定量法、質量分析等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
　ＣＥＳ１タンパク質の活性は、例えばＣＥＳ1発現細胞にＣＥＳ１の基質であるｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルを暴露し、一定時間培養した後、培養液中のｐ－ヒドロキシ安息香酸をＨＰＬＣで定量することにより測定することができる。
　次いで、上記のとおり測定された発現に基づいて、被験物質のＣＥＳ１の発現促進効果が評価されるが、斯かる評価は、例えば、被験物質添加前後で、又は被験物質添加群と被験物質非添加群若しくは対照物質添加群とを比較することによって行われる。あるいは、評価は、種々の濃度の被験物質間で測定結果を比較することによって行われ得る。
　そして、ＣＥＳ１の発現を上昇若しくは促進させる被験物質は、パラベン類による感覚刺激低減剤として選択される。
　斯くして得られたパラベン類による感覚刺激低減剤は、パラベン類により惹起される感覚刺激を低減するために、パラベン類が配合された化粧品、医薬品等に配合することにより使用できる。
　上述した本発明の方法により、スルフォラファン、及び発芽ブロッコリーのようなスルフォラファンを含有する植物の抽出物にＣＥＳ１の発現促進作用があり、これらが感覚刺激低減剤として見出された。
　すなわち、本発明は、更に、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を有効成分とする感覚刺激低減剤、又はＣＥＳ１発現促進剤を提供する。
　ここで、スルフォラファン（Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ）は、４－（メチルスルフィニル）ブチルイソチオシアナートを指す。
　スルフォラファンは、スルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物から公知の方法で単離精製すること等により取得することができる。また、単離精製されたスルフォラファンはシグマアルドリッチ社等から市販されており、本発明においては、当該市販品を使用することもできる。
　本発明においては、単離されたスルフォラファンのみならず、上記のスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物又はその抽出物も、感覚刺激低減剤又はＣＥＳ１発現促進剤の有効成分となり得る。
　スルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物としては、例えばアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物、好ましくはアブラナ科アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物が挙げられる。具体的には、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ等が挙げられる。このうち、スルフォラファンの含有量の点で、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ｉｔａｌｉｃａ）が好ましく、発芽した後成長体となるまでの発芽ブロッコリー（「ブロッコリースプラウト」とも云われる）がより好ましい。
　尚、スルフォラファンの配糖体としては、スルフォラファングルコシノレート等が挙げられる。
　スルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物は、当該植物の全部又は一部の粉砕物、凍結乾燥物、搾汁等を用いることができる。例えば、発芽ブロッコリーでは、発芽体の芽、子葉、種子、根の一部又は全草の乾燥粉砕物が好適に使用できる。
　上記植物の抽出物としては、公知の抽出方法により抽出して得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられる。公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、 出、浸出、固液抽出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。例えば、浸漬は、０℃～溶媒沸点（好ましくは１５～４０℃）で１時間～４週間、浸漬・浸出することが挙げられ、固液抽出は、０℃～溶媒沸点（好ましくは１５～４０℃）下、３０～１０００ｒｐｍで３０分～２週間の攪拌もしくは振盪することが挙げられる。また、抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。また、還流抽出の場合には、ソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて行うことができる。
　抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン等の飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、薬理活性および汎用性の点で、水、アルコール類およびそれらの混液が挙げられる。
　上記アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の１価アルコール類；１，３－ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４－ブタンジオール、１，５－ペンタンジオール、１，６－ヘキサンジオール等の２価アルコール類；グリセリン等の３価以上のアルコール類等が挙げられる。このうち、薬理活性および操作性の点で、１価アルコール類および２価アルコール類が好ましい。また好ましくは、上記アルコール類は、炭素数１～１０のアルコール、より好ましくは炭素数１～４のアルコールであり得る。
　上記アルコール類の好ましい例としては、メタノール、エタノール、１，３－ブチレングリコール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール等が挙げられる。
　上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上であり、より好ましくは４０質量％以上であり、且つ好ましくは８０質量％以下、より好ましくは７０質量％以下、さらに好ましくは６０質量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは２０～８０質量％、より好ましくは３０～７０質量％、さらに好ましくは４０～６０質量％である。
　上記アルコール類のうち、汎用性の観点から、エタノールがより好ましい。したがって、上記植物の抽出物を調製するためのより好適な溶媒としては、水、エタノール、エタノール水溶液が挙げられる。
　抽出における溶媒の使用量としては、植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１～１０００ｍＬが好ましい。ここで、本明細書において体積は２５℃での体積を意味する。また乾燥質量は試料を１０５℃の電気恒温乾燥機で３時間乾燥して揮発物質を除いた残分である乾燥固形分の質量を意味する。抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されない。例えば、抽出時間は好ましくは１時間以上、より好ましくは３日以上、より好ましくは１週間以上であり、他方、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは５週間以下、より好ましくは２週間以下である。抽出温度は０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、他方、溶媒沸点以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。通常、低温なら長時間、高温なら短時間の抽出を行う。抽出条件の例としては、１５～４０℃で３日～５週間、好ましくは１～２週間、６０～９０℃で１～５時間等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
　本発明において、植物抽出物はそのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・１，３－ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
　斯くして得られた植物抽出物は、必要に応じて、合成吸着剤による処理、ろ過処理、濃縮処理等の分離・精製工程に供することにより、スルフォラファンの含有割合を高めてもよい。スルフォラファンの含有割合を高めた発芽ブロッコリー抽出物として、「ブロッコリースプラウトエキス」（オリザ油化株式会社）が市販されており、本発明においては、当該市販品を使用することもできる。
　後記実施例に示すとおり、スルフォラファン、及びスルフォラファンを含有する植物である発芽ブロッコリー抽出物は、ＣＥＳ１の発現を促進させ、またパラベン類による感覚刺激を低減する作用を有する。
　したがって、スルフォラファン又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物は、感覚刺激低減剤又はＣＥＳ１発現促進剤となり得、感覚刺激低減するため、ＣＥＳ１の発現を促進するために使用でき、また、感覚刺激低減剤又はＣＥＳ１発現促進剤を製造するために使用することができる。
　ここで、「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
　本発明の「感覚刺激低減剤」における、「感覚刺激低減」とは、パラベン類により惹起される、皮膚のピリピリ感やヒリヒリ感等の一過性の不快な刺激感を、抑制又は緩和することを意味する。ここで、「パラベン類」としては、前述したとおりである。
　斯かる感覚刺激低減効果は、後記実施例に示すような官能評価により測定することができる。
　また、「ＣＥＳ１発現促進剤」における「ＣＥＳ１発現」には、前述したとおりＣＥＳ１タンパク質の発現、ＣＥＳ１タンパク質の活性、当該タンパク質をコードするＣＥＳ１ｍＲＮＡの発現、及びＣＥＳ１遺伝子のプロモーターの活性が含まれ、好ましくはＣＥＳ１ｍＲＮＡ発現である。
　感覚刺激低減剤及びＣＥＳ１発現促進剤は、スルフォラファン又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を単独で用いたものであってもよく、あるいは油分、色素、香料、防腐剤、キレート剤、顔料、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、甘味料、調味料、保存料、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、被膜剤、担体、希釈剤等の、医薬品、化粧品、医薬部外品、生活用品等の各種製剤に用いられる添加剤や賦形剤等と組み合わせた組成物であってもよい。またそれらの形態も特に限定されず、例えば溶液、エマルジョン、サスペンジョン、ゲル、固形、粉体、粒体、エアゾールなど、任意の形態に調製できる。
　当該組成物におけるスルフォラファン又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の配合量は、スルフォラファンとして、製剤全質量の０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上であり、そして、９９質量％以下、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、さらに好ましくは８０質量％以下である。また、０．００１～９９質量％、好ましくは０．０１～９５質量％、より好ましくは０．１～９０質量％、さらに好ましくは１～８０質量％が挙げられる。また、当該組成物中にスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を含有する場合、その含有量は、乾燥固形分として、製剤全質量の０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは１質量％以上であり、そして、９９質量％以下、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、さらに好ましくは８０質量％以下である。また、０．００１～９９質量％、好ましくは０．０１～９５質量％、より好ましくは０．１～９０質量％、さらに好ましくは１～８０質量％が挙げられる。
　本発明の感覚刺激低減剤又はＣＥＳ１発現促進剤は、例えば、上述したパラベン類を含有する組成物（皮膚洗浄剤、頭髪洗浄剤、メイクアップ剤、入浴剤、パーマネントウェーブ用剤、染毛剤、石鹸類、台所用洗剤、洗濯用洗剤、歯磨類等の化粧品、医薬部外品、医薬品、生活用品等）に配合して使用すること、或いはパラベン類を含有する組成物とは別個の組成物として調製し、前記組成物と同時或いは前記組成物の使用前後に使用することにより、当該パラベン類により引き起こされる刺激感を低減できる。すなわち、本発明の感覚刺激低減剤又はＣＥＳ１発現促進剤の適用対象は、好ましくは、パラベン類を含有する組成物を使用するヒトであって、パラベン類により引き起こされる刺激感の低減を求めるヒトが挙げられる。
　本発明の感覚刺激低減剤及びＣＥＳ１発現促進剤を、パラベン類を含有する組成物と共に用いる場合、感覚刺激低減剤及びＣＥＳ１発現促進剤の使用量は、感覚刺激を低減する限り特に限定されないが、例えば、パラベン類１質量部に対し、本発明のスルフォラファン又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を、スルフォラファンとして、好ましくは１０－７質量部以上、より好ましくは１０－６質量部以上、さらに好ましくは１０－５質量部以上であり、そして好ましくは１０質量部以下、より好ましくは１質量部以下、さらに好ましくは０．１質量部以下の割合とすることができる。また、好ましくは１０－７～１０質量部、より好ましくは１０－６～１質量部、さらに好ましくは１０－５～０．１質量部の割合とすることができる。
　上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
　＜１＞以下の（１）～（３）の工程を含む、パラベン類による感覚刺激低減剤の評価又は選択方法。
　（１）ＣＥＳ１を発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程、
　（２）当該細胞におけるＣＥＳ１の発現を測定する工程、
　（３）（２）で測定された結果に基づいて、ＣＥＳ１の発現を促進させる被験物質をパラベン類による感覚刺激低減剤として評価する工程。
　＜２＞パラベン類が、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、エチルパラベン、ブチルパラベン、プロピルパラベン、イソブチルパラベン、イソプロピルパラベン及びベンジルパラベンから選ばれる１種以上である＜１＞の方法。
　＜３＞パラベン類が、メチルパラベンである＜２＞の方法。
　＜４＞ＣＥＳ１を発現可能な細胞が、ヒト表皮組織由来の細胞であり、好ましくは正常ヒト培養表皮角化細胞である＜１＞～＜３＞のいずれか１の方法。
　＜５＞ＣＥＳ１の発現がＣＥＳ１タンパク質の発現、ＣＥＳ１タンパク質の活性、当該タンパク質をコードするＣＥＳ１ｍＲＮＡの発現、及びＣＥＳ１遺伝子のプロモーターの活性から選ばれる１種以上、好ましくはＣＥＳ１ｍＲＮＡの発現を指標として測定される＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を有効成分とする感覚刺激低減剤。
＜７＞スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を有効成分とするＣＥＳ１発現促進剤。
＜８＞感覚刺激低減剤を製造するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の使用。
＜９＞ＣＥＳ１発現促進剤を製造するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の使用。
＜１０＞感覚刺激の低減に使用するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物。
＜１１＞ＣＥＳ１の発現促進に使用するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物。
＜１２＞感覚刺激を低減するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の非治療的使用。
＜１３＞ＣＥＳ１発現を促進するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の非治療的使用。
＜１４＞スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を用いる、感覚刺激低減方法。
＜１５＞スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を用いる、ＣＥＳ１発現促進方法。
＜１６＞パラベン類を含有する組成物を使用するヒトに対して用いる、＜１４＞又は＜１５＞記載の方法。
＜１７＞上記＜６＞、＜８＞、＜１０＞、＜１２＞又は＜１４＞において、感覚刺激は、ペラベン類により惹起される刺激感である。
＜１８＞上記＜６＞～＜１７＞において、スルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物が発芽ブロッコリーである。
＜１９＞上記＜６＞～＜１８＞において、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物は、パラベン類を含有する組成物に配合して使用するか、或いは当該組成物とは別個の組成物として調製し、前記組成物と同時又は前記組成物の使用前後に使用するものである。
＜２０＞上記＜１９＞において、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物は、パラベン類１質量部に対し、スルフォラファン又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を、スルフォラファンとして、好ましくは１０－７質量部以上、より好ましくは１０－６質量部以上、さらに好ましくは１０－５質量部以上であり、そして好ましくは１０質量部以下、より好ましくは１質量部以下、さらに好ましくは０．１質量部以下の割合か、又は好ましくは１０－７～１０質量部、より好ましくは１０－６～１質量部、さらに好ましくは１０－５～０．１質量部の割合で使用するものである。
＜２１＞上記＜６＞～＜９＞において、組成物中のスルフォラファン又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の配合量は、スルフォラファンとして、製剤全質量の０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上であり、そして、９９質量％以下、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、さらに好ましくは８０質量％以下であるか、又は０．００１～９９質量％、好ましくは０．０１～９５質量％、より好ましくは０．１～９０質量％、さらに好ましくは１～８０質量％である。
＜２２＞上記＜６＞～＜９＞において、組成物中のスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の配合量は、乾燥固形分として、製剤全質量の０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは１質量％以上であり、そして、９９質量％以下、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、さらに好ましくは８０質量％以下であるか、又は０．００１～９９質量％、好ましくは０．０１～９５質量％、より好ましくは０．１～９０質量％、さらに好ましくは１～８０質量％である。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
参考例１　パラベン類により惹起される感覚刺激性の比較（三次元培養表皮での評価）
　ヒト三次元培養表皮モデルとしてＬａｂＣｙｔｅ　ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ２４（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）を用いた。専用アッセイ培地５００μＬで培養カップを一晩前培養（５％ＣＯ２、３７℃）した後、培養カップを新しいアッセイ培地の入った２４ウェルプレートに移した。培養カップ内の表皮組織にｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル（ＭＰ）あるいはｐ－ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢＡ）の１６．４ｍＭ水溶液５０μＬ　を添加し、６時間培養した後、リン酸緩衝液で培養カップ内を１０回洗浄し、カップを新しいアッセイ培地の入った２４ウェルプレートに移して、さらに１８時間追培養した。追培養後、培地中のＩＬ－１α量をＨｕｍａｎ　ＩＬ－１　ａｌｐｈａ／ＩＬ－１Ｆ１　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い添付プロトコールに従って定量した。結果を図１に示す。
　図１より、感覚刺激物質により産生が亢進することが知られているＩＬ－１α量がＰＨＢＡではＭＰと比べて非常に少なく、ＰＨＢＡの感覚刺激性は極めて弱と考えられた。
参考例２　パラベン類により惹起される感覚刺激性の比較（ヒト評価）
　次の基準のすべてに該当する者を敏感肌の被験者として選抜した。
１．　年齢：２０～５５歳
２．　性別：女性
３．　敏感肌と自覚している者
４．　以下のａまたはｂの１つ以上に該当する者
　ａ．　敏感肌対応化粧品と思われる製品を選んで使用している
　ｂ．　過去１年以内に、洗顔料、スキンケア製品や化粧下地を使用してぴりぴり、チクチクと言った刺激を感じたことがある
　選抜した被験者に対して次の方法でスティンギング試験Ａを実施した。
　メイク落としと洗顔料によって洗顔後、温度２３℃湿度５０％環境下で５分以上馴化させ、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルあるいはｐ－ヒドロキシ安息香酸の１６．４ｍＭ水溶液６００μＬを含浸した２ｃｍ×５ｃｍの不織布を頬部に接触させ、接触開始３０秒後、１分後、２分後、３分後、５分後の被験者が認知した感覚刺激（痛い、ぴりぴりする、ちくちくする、じんじんする、温かい、ほてる）について申告したスコア（０：なにも感じない、０．５：わずかに感じられる或いはほんの少しの違和感、１．０：少しの違和感、１．５：少し～多少の違和感、２．０：多少の違和感、２．５：多少～かなりの違和感、３．０：我慢できない或いはかなりの違和感）の３０秒後～５分後までのすべてのスコアの中の最大値から蒸留水で同様の試験を実施した時のスコアの最大値を引いた値を感覚刺激スコアとしてＷｉｌｃｏｘｏｎの符号付順位和検定によって統計解析した。結果を図２に示す。
　図２より、ＰＨＢＡの感覚刺激は極めて弱く、感覚刺激への寄与は殆どないと考えられた。
参考例３　健常肌と敏感肌のＣＥＳ１発現量および代謝活性の比較
（１）スティンギング試験Ｂ
　メイク落としと洗顔料によって洗顔後、温度２３℃湿度５０％環境下で５分以上馴化させ、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルの１６．４ｍＭ水溶液６００μＬを含浸した１０ｃｍ２の不織布を右頬部に接触させ、接触開始３０秒後、１分後、２分後、３分後の被験者が認知した感覚刺激について申告したスコア（０：なにも感じない、０．５：わずかに感じる、１．０：少し感じる、２．０：はっきり感じる、３．０：非常に強く感じる、強い刺激に不織布を外したい）の３０秒後～３分後までのすべてのスコアの中の最大値を頬部の感覚刺激スコアとした。次いで、７０％イソプロピルアルコールで右頸部を清拭後、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル（ＭＰ）の１６．４ｍＭ水溶液３００μＬを含浸した２ｃｍ× ２．５ｃｍの不織布を清拭部位に接触させ、接触開始３０秒後、１分後、２分後、３分後の被験者が認知した感覚刺激について申告したスコア（０：なにも感じない、０．５：わずかに感じる、１．０：少し感じる、２．０：はっきり感じる、３．０：非常に強く感じる、強い刺激に不織布を外したい）の３０秒後～３分後までのすべてのスコアの中の最大値を頸部の感覚刺激スコアとした。
（２）被験者の選抜
　次の基準のすべてに該当する者の中から３名を健常肌者として選抜した。
　・年齢：２０～５５歳
　・性別：女性
　・敏感肌ではないと自覚している者
　・スティンギング試験Ｂで頬部・頸部の感覚刺激スコアがいずれも０（なにも感じない）の者
　次の基準のすべてに該当する者の中から３名を敏感肌者として選抜した。
　・年齢：２０～５５歳
　・性別：女性
　・敏感肌と自覚している者
　・スティンギング試験Ｂで頬部の感覚刺激スコアが２（はっきり感じる）以上かつ頸部の感覚刺激スコアが０．５（わずかに感じる）以上の者
（３）皮膚生検
　健常肌者および敏感肌者より各３名ずつを選抜し、右頸部（スティンギング試験を実施した部位）より４ｍｍφの生検トレパンによって皮膚を採取し、採取皮膚を液体窒素によってただちに凍結させ、解析まで－８０℃で保存した。
（４）生検皮膚中カルボキシルエステラーゼ１の発現量および活性
　４ｍｍφの生検皮膚をメスで半分にし、一片をカルボキシルエステラーゼ１の発現量解析用、残りの一片をカルボキシルエステラーゼ１の活性解析用に用いた。
　発現量解析用生検皮膚組織をハサミで細切し、プロテアーゼ阻害剤ミックス（和光純薬工業）を添加したＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬工業）を生検皮膚組織の入ったマイクロチューブ内に（組織重量（ｍｇ）×２０）μＬ添加して、ホモジナイザー（ヒスコトロン、株式会社マイクロテック・ニチオン）でホモジナイズした後、３０分間氷上で静置した。３０分後、４℃で２分間超音波処理し、１０，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心して、その上清を皮膚抽出液として得た。Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎを標準タンパク質として皮膚抽出液のタンパク質量を定量した。
　皮膚抽出液を試料として以下の通りポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロッティングを行った。
　皮膚抽出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離後、ＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ　ＲＡＤ）に転写した。転写したＰＶＤＦ膜は５％スキムミルク液に浸漬してブロッキングした後、１：２００に希釈した抗カルボキシルエステラーゼ１抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＭＡＢ４９２０）を用いて一次抗体反応を行い、１：２０００に希釈したｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＨＡＦ００７）を用いて二次抗体反応を行った。Ｃｌａｒｉｔｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ＥＣＬ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＩＯ　ＲＡＤ）にて発光させ、ＬＡＳ－４０００（富士フィルム株式会社）を用いて抗体反応を検出した。撮影したウェスタンブロットの画像からＣＥＳ１とアクチンのバンドを画像解析ソフトＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アトー株式会社）により別々に選択しバンド強度を測定して、アクチン当たりのＣＥＳ１の強度を算出した。なお、ポリアクリルアミドゲルへの試料のロード量が均一であるかどうかは、一次抗体に抗β―アクチン抗体を用いた同様の実験により検証した。
　活性解析用生検皮膚組織をハサミで細切後、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ　ＫＣｌ（ｐＨ　７．４）溶液を（組織重量（ｍｇ）×２０）μＬ添加し、ホモジナイザー（ヒスコトロン、株式会社マイクロテック・ニチオン）でホモジナイズした後、１０，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心して、その上清を皮膚抽出液として得た。皮膚抽出液のタンパク質量をＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。各皮膚抽出液の最終タンパク濃度が５０ μｇ／ｍＬとなるように調製し、カルボキシルエステラーゼ１の基質であるｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルを２００μＭとなるよう添加し、３７℃で５時間反応させた。その後、反応溶液と同量の冷アセトニトリルを添加し、反応を停止させ、代謝物であるｐ－ヒドロキシ安息香酸をＨＰＬＣで定量し、単位タンパク質、単位時間当たりのｐ－ヒドロキシ安息香酸生成量をＣＥＳ１代謝活性とした。以下にＨＰＬＣに用いた機器、カラム、測定条件を示す。
　機器：Ａｌｌｉａｎｃｅ　２６９５　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ、２９９６　Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ　Ａｒｒａｙ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）
　カラム：Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ、化学物質評価研究機構）
　カラム温度：４０℃
　移動相：４５％メタノール／０．１％ギ酸
　流 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　試料注入量：５０μＬ
　検出波長：２５４ｎｍ　
　結果を図３及び図４に示す。
　図３及び図４より、敏感肌者の皮膚は健常者の皮膚に比べてＣＥＳ１発現量、ＣＥＳ１代謝活性が低いことが認められた。
実施例１　ＣＥＳ１発現に基づく発芽ブロッコリー抽出物の評価
　正常ヒト表皮角化細胞（ライフテクノロジーズジャパン）を各ウェル１×１０５となるよう６－ｗｅｌｌプレートに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）で一晩培養後、発芽ブロッコリー抽出物（ブロッコリースプラウトエキス；オリザ油化株式会社、化粧品用）を固形分濃度０．０００１ｗ／ｖ％あるいは０．００１ｗ／ｖ％となるように培地に添加し、４８時間培養した。培養後の細胞をＤ－ＰＢＳ（－）で洗浄し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔｓ（キアゲン）を用い、添付のマニュアルに従ってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて算出した。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン）を用いて抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡの逆転写反応を行った後、７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲは、前記で逆転写したｃＤＮＡとＣＥＳ１もしくは内在性コントロールとしてＲＰＬＰ０のＴａｑｍａｎプライマー（ライフテクノロジーズジャパン、ＣＥＳ１：Ｈｓ００２７５６２７－ｍ１、ＲＰＬＰ０：ＨＳ００４２０８９５＿ｇＨ）、Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズジャパン）を用いて、ΔΔＣＴ法によりＣＥＳ１ｍＲＮＡ発現量を比較した。結果を図５に示す。
　図５より、発芽ブロッコリー抽出物によってＣＥＳ１ｍＲＮＡ発現量の増加が認められた。
実施例２　発芽ブロッコリー抽出物のヒト有効性試験
　敏感肌を自覚しており、かつｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル（ＭＰ）に感覚刺激を感じる男性を被験者として選抜して、固形分濃度０．０１％の発芽ブロッコリー抽出物（ブロッコリースプラウトエキス；オリザ油化株式会社、化粧品用）含有する１０％エタノール溶液を１日２回、１回５００円玉大の量を１週間にわたって被験者の全顔に塗布し、塗布前後のスティンギング試験Ｃによる感覚刺激スコアを比較した。スティンギング試験Ｃは次の方法で実施した。
　メイク落としと洗顔料によって洗顔後、温度２３℃湿度５０％環境下で５分以上馴化させ、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルの１６．４ｍＭ水溶液６００μＬを含浸した１０ｃｍ２の不織布を頬部に接触させ、接触開始３０秒～３分後の被験者が認知した感覚刺激について申告したスコア（０：なにも感じない、０．５：わずかに感じる、１．０：少し感じる、２．０：はっきり感じる、３．０：非常に強く感じる、強い刺激に不織布を外したい）の最大値から蒸留水で同様の試験を実施した時のスコアの最大値を引いた値を感覚刺激スコアとしてＷｉｌｃｏｘｏｎの符号付順位和検定によって統計解析した。結果を図７に示す。
　図６より、発芽ブロッコリー抽出物によってｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルの感覚刺激が低減されることが確認された。
実施例３　スルフォラファンのＣＥＳ１発現促進作用
　正常ヒト表皮角化細胞（ライフテクノロジーズジャパン）を各ウェル１×１０５となるよう６－ｗｅｌｌプレートに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）で一晩培養後、スルフォラファン（シグマアルドリッチ社）を最終濃度０．１、１、１０μＭとなるように細胞へ暴露し、４８時間培養した。培養後の細胞をリン酸緩衝液（Ｄ－ＰＢＳ（－））で洗浄し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔｓ（キアゲン社）を用い、添付のマニュアルに従ってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて算出した。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン社）を用いて抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡの逆転写反応を行った後、７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン社）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲは、前記で逆転写したｃＤＮＡとカルボキシルエステラーゼ１もしくは内在性コントロールとしてＲＰＬＰ０のＴａｑｍａｎプライマー（ライフテクノロジーズジャパン社、ＣＥＳ１：Ｈｓ００２７５６２７－ｍ１、ＲＰＬＰ０：ＨＳ００４２０８９５＿ｇＨ）、Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズジャパン社）を用いて、ΔΔＣＴ法により遺伝子発現量を比較した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より、スルフォラファンによってＣＥＳ１ｍＲＮＡ発現量の増加が認められた。
 

Claims (16)

  1. 　以下の（１）～（３）の工程を含む、パラベン類による感覚刺激低減剤の評価又は選択方法。
    （１）ＣＥＳ１を発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程、
    （２）当該細胞におけるＣＥＳ１の発現を測定する工程、
    （３）（２）で測定された結果に基づいて、ＣＥＳ１の発現を促進させる被験物質をパラベン類による感覚刺激低減剤として評価する工程。
  2. 　パラベン類が、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、エチルパラベン、ブチルパラベン、プロピルパラベン、イソブチルパラベン、イソプロピルパラベン及びベンジルパラベンから選ばれる１種以上である請求項１記載の方法。
  3. 　ＣＥＳ１を発現可能な細胞が、ヒト表皮組織由来の細胞である請求項１又は２記載の方法。
  4. 　スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を有効成分とする感覚刺激低減剤。
  5. 　感覚刺激が、ペラベン類により惹起される刺激感である請求項４記載の感覚刺激低減剤。
  6. 　スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を有効成分とするＣＥＳ１発現促進剤。
  7. 　スルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物が発芽ブロッコリーである、請求項４～６のいずれか１項記載の剤。
  8. 　感覚刺激低減剤を製造するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の使用。
  9. 　ＣＥＳ１発現促進剤を製造するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の使用。
  10. 　感覚刺激の低減に使用するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物。
  11. 　ＣＥＳ１の発現促進に使用するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物。
  12. 　感覚刺激を低減するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の非治療的使用。
  13. 　ＣＥＳ１発現を促進するための、スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物の非治療的使用。
  14. 　スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を用いる、感覚刺激低減方法。
  15. 　スルフォラファン、又はスルフォラファン若しくはその配糖体を含有する植物若しくはその抽出物を用いる、ＣＥＳ１発現促進方法。
  16. 　パラベン類を含有する組成物を使用するヒトに対して用いる、請求項１５又は請求項１６記載の方法。
     
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