KR101929657B1

KR101929657B1 - 밀배아 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 외용제 조성물

Info

Publication number: KR101929657B1
Application number: KR1020170056487A
Authority: KR
Inventors: 양태주; 오한나; 이지훈; 박승원; 이상범; 조성준
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2016-05-11
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2018-12-18
Also published as: AR108437A1; TW201740918A; KR20170128097A; TWI649093B

Abstract

본원은 본원의 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방, 개선 또는 치료용 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

밀배아 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 외용제 조성물{Skin external agent for improving skin wrinkle comprising an extract of fermented wheat germ}

본원은 밀배아 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 외용제 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 피부 주름은 피부의 수분 함유량, 콜라겐의 함유량, 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 요소들에 의해 생성되는 것으로 알려져 있으며, 상기 중 피부 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐으로 알려져 있다.

콜라겐은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조중량의 약 70~80%를 차지하고 있어 세포외 기질의 대부분을 차지하면서 피부를 지지한다. 그러나, 자연 노화에 따른 세포 활성의 감소와 같은 내적 요인에 의해 콜라겐의 생합성이 감소되고, 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선과 같은 외적 요인에 의해 콜라겐의 분해가 가속화되어, 피부기질이 파괴되면서 주름이 생성된다. 따라서, 이러한 현상을 방지하고 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행해지고 있다.

인체의 중성구 과립구 내에 존재하는 엘라스타아제는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하며, 콜라겐 분해활성도 가지는 효소이다. 엘라스타아제가 적절하게 발현되고 활성화되면 상처회복 등에 관여하지만, 과다하게 발현되거나 활성화된 경우 피부 내의 엘라스틴을 분해하여 피부의 탄력을 잃게 된다. 따라서 엘라스타아제 저해제는 피부주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우르솔산 등이 엘라스타아제 저해제로 이용되고 있다.

한편, 전호 추출물 또는 파슬리 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 외용제 조성물(대한민국 등록특허 제0507292호), 대황, 백렴, 백단향 등의 천연 추출물을 함유하는 주름 개선용 외용제 조성물(대한민국 등록특허 제1220903호) 또는 스클레로글루칸을 함유하는 피부 외용제 조성물(대한민국 특허공개공보 제2010-0043923호) 등의 천연물에 대한 연구뿐만 아니라, 폴리우레탄 및 아크릴계폴리머로 이루어진 피막형성성 폴리머가 물에 분산된 수분산물을 함유하는 피부 외용제 조성물(대한민국 등록특허 제1101363호) 등의 합성고분자에 대한 연구도 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지 안정성 및 피부주름 개선 효과에서 소비자가 만족할만한 천연물 유래 주름 개선용 피부 외용제 조성물은 개발되어 있지 않다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 천연 소재를 발효하여 우수한 주름 개선용 피부 외용제 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 밀배아 발효물의 추출물 및 2,6-디메톡시벤조퀴논(2,6-DMBQ: 2,6-Dimethoxybenzoquinone)가 안전성이 우수하면서도 콜라겐 생합성을 증가시키면서 콜라겐 및 엘라스틴 분해를 억제하고, 이를 피부에 도포하는 경우 피부주름(예컨대, 눈가주름) 개선 효과가 탁월함을 확인하여 본원을 완성하였다.

본원의 목적은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본원의 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 또 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 또 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물, 또는 본원의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 주름을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본원은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본원의 화장료 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있는 화합물은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

본원의 화학식 1로 표시되는 화합물은 2,6-디메톡시벤조퀴논(2,6-DMBQ: 2,6-Dimethoxybenzoquinone)로 명명되는 화합물로, 화학적 또는 생물학적으로 합성하거나, 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 또는, 본원의 화합물이 포함되어 있다고 공지된 천연물(예컨대, 식물 등)으로부터 분리하여 수득할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물에 포함되는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 피부 주름 예방 또는 개선 효능을 가지는 것을 확인하였다.

본원에서 사용된 용어, "밀배아(wheat germ)"는 밀의 씨눈을 의미한다. 이는 통밀을 밀가루로 처리하는 공정에서 제거되어 나오는 밀알(wheat kernel)의 영양분이 풍부한 배아로서, 전체 밀알의 약 2~3%를 차지한다. 밀배아는 현재까지 항산화 비타민으로 알려진 비타민 E(토코페롤)가 풍부한 것으로 알려져 있고, 최근 연구에 따르면 밀배아를 발효하여 추출한 천연물질이 인체의 손상된 면역 기능을 복원하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 밀배아의 피부 주름 개선 효과는 알려진바 없다.

본원의 밀배아는 밀배아의 건조물, 분쇄물, 농축물 및 이의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 용어, "발효"는 미생물을 이용한 유기물질의 효소적 또는 대사적 분해를 포함하는 모든 활성 또는 과정을 의미한다.

본원에서 사용된 용어, "밀배아 발효물"는 미생물을 이용한 밀배아의 효소적 또는 대사적 분해의 결과물을 의미한다.

본원의 밀배아 발효물은 본원의 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있다.

또한, 본원의 밀배아 발효물은 밀배아 또는 이를 포함한 배지에 미생물을 접종한 후 배양하여 수득한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 효모, 유산균, 세균, 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상일 수 있다.

상기 효모는 예를 들어 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 엘립소이데우스(S. ellipsoideus), 사카로마이세스 코레아누스(S. coreanus), 사카로마이세스 칼스버젠시스(S. carlsbergensis), 사카로마이세스 파스토리아누스(S. pastorianus), 사카로마이세스 락티스(S. lactis), 사카로마이세스 룩시(S. rouxii), 시죠사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 지고사카로마이세스 메이저(Zygosaccharomyces major), 한세눌라 아노말라 (Hansenula anomala), 브레타노마이세스 블룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 브레타노마이세스 커스터시아누스(B. custersianus), 데케라 아노말라(Dekkera anomala), 스트렙토마이세스 올리보크로모제네스(Streptomyces olivochromogenes), 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(S. griseus)일 수 있으나, 본원의 목적인 피부 주름 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있는 이상 이에 제한되지 않는다. 일 예로 상기 효모는 사카로마이시스 세레비시애일 수 있다.

상기 유산균은 예를 들어 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 락토코커스 락티스 속(Lactococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus. sp), 또는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.)의 미생물일 수 있으나, 본원의 목적인 피부 주름 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있는 이상 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 상기 유산균은 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 애니말리스(B. animalis), 비피도박테리움 락티스(B. lactis), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 델브루에키 종(L. delbrueckii spp.), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei), 락토바실러스 플랜타룸(L. plantarum), 락토바실러스 류테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토코커스 락티스(L. lactis), 페디오코커스 세레비지애(P. cerevisiae), 페디오코커스 애시디락티시(P. acidilactici), 스트렙토코커스 락티스(S. lactis), 스트렙토코커스 서모필리스(S. thermophiles), 스트렙토코커스 크레모리스(S. cremoris), 또는 류코노스톡 메센터로이데스(L. mesenteroides)일 수 있다. 본원에서 유산균은 젖산균과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

또한, 상기 발효에 사용되는 곰팡이는 이에 제한되지는 않지만, 버섯을 포함할 수 있는데, 상기 버섯은 예를 들어 표고버섯, 느타리버섯, 팽이버섯, 송이버섯, 양송이버섯, 목이버섯, 노루궁뎅이 버섯, 영지버섯, 또는 상황버섯일 수 있으나, 본원의 목적인 피부 주름 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있는 이상 이에 제한되지 않는다.

본원의 밀배아 발효물을 제조하는데 사용되는 미생물의 접종량, 배양 온도, 배양 습도, 및 배양 시간은 발효에 이용되는 미생물의 종류 등을 고려하여 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 비제한적인 예로, 본원의 배양은 20℃내지 40℃의 온도에서 12 시간 내지 60 시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 본원의 배양은 25℃ 내지 35℃, 28℃ 내지 32℃ 또는 30℃ 온도 및/또는 12시간 내지 50시간, 20시간 내지 50시간, 30 시간 내지 50 시간, 35 시간 내지 45 시간, 38 시간 내지 42 시간 또는 40 시간 동안 실시할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "밀배아 발효물의 추출물"은 밀배아 발효물에서 미생물을 제거한 물질을 말한다.

본원의 제거는 당업계에서 알려진 미생물 발효물에 포함된 미생물(예컨대, 효모 균체)을 제거하는 방법이라면 어떠한 방법이라도 포함할 수 있다. 구체적으로, 본원의 밀배아 발효물의 추출물은 본원의 밀배아 발효물에 원심분리를 실시하여 수득한 상등액일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 원심분리는 6,000 rpm 내지 10,000 rpm, 7000 rpm 내지 9000 rpm, 7500 rpm 내지 8500 rpm, 7800 rpm 내지 8200 rpm 또는 8000 rpm의 분당 회전 수(revolution per minute) 및/또는 5 분 내지 120분, 5분 내지 90분, 5분 내지 60분, 5분 내지 40분, 5분 내지 30분, 10 분 내지 120분, 10분 내지 90분, 10분 내지 60분, 10분 내지 40분, 10분 내지 30분, 15 분 내지 120분, 15분 내지 90분, 15분 내지 60분, 15분 내지 40분, 15분 내지 30분, 15분 내지 25분 또는 20분 동안 실시할 수 있다.

특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 본원의 밀배아 발효물의 추출물은 본원의 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있다.

본원의 밀배아 발효물의 추출물은 본원의 밀배아 발효물의 추출물 자체 및 이의 희석액, 농축액, 건조물, 조정제물, 정제물 또는 이들의 혼합물 등 추출액을 이용하여 형성가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 구체적으로, 본원의 밀배아 발효물의 추출물은 건조물일 수 있으며, 보다 구체적으로 동결 건조물일 수 있다.

또한, 본원의 밀배아 발효물의 추출물은 주름 예방, 개선 또는 치료효과를 갖는 한 어떠한 방법에 의하여서도 밀배아 발효물로부터 수득할 수 있으며, 비제한적인 예로 밀배아 발효물을 용매에 침지하고, 10 내지 25℃의 상온에서 추출하는 냉침추출법, 40 내지 100℃로 가열하여 추출하는 가열추출법, 초음파를 가하여 추출하는 초음파추출법, 환류냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 사용할 수 있다. 이들 방법은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본원의 추출에 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 본원의 추출용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane) 및 이들의 혼합 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매를 들 수 있으며, 구체적으로, 본원의 추출용매는 열수일 수 있다.

본원의 추출물은 그의 분획물을 포함하는 것일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본원의 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이의 조합 등이 될 수 있다.

본원의 분획물을 수득하는데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 본원의 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.

본원의 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 본원의 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 10 중량%로 사용될 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 7 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 3 중량%, 0.01 중량% 내지 2 중량%, 0.01 중량% 내지 1 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 7 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 3 중량%, 0.05 중량% 내지 2 중량%, 0.05 중량% 내지 1 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 7 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 3 중량%, 0.1 중량% 내지 2 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 0.5 중량% 내지 10 중량%, 0.5 중량% 내지 7 중량%, 0.5 중량% 내지 5 중량%, 0.5 중량% 내지 3 중량%, 0.5 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 1 중량%, 0.8 중량% 내지 10 중량%, 0.8 중량% 내지 7 중량%, 0.8 중량% 내지 5 중량%, 0.8 중량% 내지 3 중량%, 0.8 중량% 내지 2 중량%, 0.8 중량% 내지 1 중량% 또는 1 중량%로 포함될 수 있다.

본원의 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 본원의 조성물에 0.1 μg/ml 내지 200 μg/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로 본원의 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 본원의 조성물에 0.1 μg/ml 내지 150 μg/ml, 0.1 μg/ml 내지 100 μg/ml, 0.1 μg/ml 내지 70 μg/ml, 0.1 μg/ml 내지 50 μg/ml, 0.5 μg/ml 내지 200 μg/ml, 0.5 μg/ml 내지 150 μg/ml, 0.5 μg/ml 내지 100 μg/ml, 0.5 μg/ml 내지 70 μg/ml, 0.5 μg/ml 내지 50 μg/ml, 0.8 μg/ml 내지 200 μg/ml, 0.8 μg/ml 내지 150 μg/ml, 0.8 μg/ml 내지 100 μg/ml, 0.8 μg/ml 내지 70 μg/ml, 0.8 μg/ml 내지 50 μg/ml, 1 μg/ml 내지 200 μg/ml, 1 μg/ml 내지 150 μg/ml, 1 μg/ml 내지 100 μg/ml, 1 μg/ml 내지 70 μg/ml, 1 μg/ml 내지 50 μg/ml, 5 μg/ml 내지 200 μg/ml, 5 μg/ml 내지 150 μg/ml, 5 μg/ml 내지 100 μg/ml, 5 μg/ml 내지 70 μg/ml, 5 μg/ml 내지 50 μg/ml, 8 μg/ml 내지 200 μg/ml, 8 μg/ml 내지 150 μg/ml, 8 μg/ml 내지 100 μg/ml, 8 μg/ml 내지 70 μg/ml, 8 μg/ml 내지 50 μg/ml, 10 μg/ml 내지 200 μg/ml, 10 μg/ml 내지 150 μg/ml, 10 μg/ml 내지 100 μg/ml, 10 μg/ml 내지 70 μg/ml 또는 10 μg/ml 내지 50 μg/ml으로 포함될 수 있다.

또한, 본원의 화학식 1로 표시되는 화합물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 중량% 내지 0.1 중량%로 사용될 수 있으며, 구체적으로 0.0001 중량% 내지 0.07 중량%, 0.0001 중량% 내지 0.05 중량%, 0.0001 중량% 내지 0.3 중량%, 0.0001 중량% 내지 0.02 중량%, 0.0001 중량% 내지 0.01 중량%, 0.0005 중량% 내지 0.1 중량%, 0.0005 중량% 내지 0.07 중량%, 0.0005 중량% 내지 0.05 중량%, 0.0005 중량% 내지 0.03 중량%, 0.0005 중량% 내지 0.02 중량%, 0.0005 중량% 내지 0.01 중량%, 0.001 중량% 내지 0.1 중량%, 0.001 중량% 내지 0.07 중량%, 0.001 중량% 내지 0.05 중량%, 0.001 중량% 내지 0.03 중량%, 0.001 중량% 내지 0.02 중량%, 0.001 중량% 내지 0.01 중량%, 0.005 중량% 내지 0.1 중량%, 0.005 중량% 내지 0.07 중량%, 0.005 중량% 내지 0.05 중량%, 0.005 중량% 내지 0.03 중량%, 0.005 중량% 내지 0.02 중량%, 0.005 중량% 내지 0.01 중량% 또는 0.007 중량%로 포함될 수 있다.

더불어, 본원의 화학식 1로 표시되는 화합물은 본원의 조성물에 0.1 ng/ml 내지 1250 ng/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로 본원의 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 본원의 조성물에 0.1 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 0.1 ng/ml 내지 500 ng/ml, 0.1 ng/ml 내지 200 ng/ml, 0.1 ng/ml 내지 120 ng/ml, 0.1 ng/ml 내지 90 ng/ml, 0.1 ng/ml 내지 60 ng/ml, 0.1 ng/ml 내지 30 ng/ml, 1 ng/ml 내지 1250 ng/ml, 1 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 1 ng/ml 내지 500 ng/ml, 1 ng/ml 내지 200 ng/ml, 1 ng/ml 내지 120 ng/ml, 1 ng/ml 내지 90 ng/ml, 1 ng/ml 내지 60 ng/ml, 1 ng/ml 내지 30 ng/ml, 1 ng/ml 내지 1250 ng/ml, 1 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 1 ng/ml 내지 500 ng/ml, 1 ng/ml 내지 200 ng/ml, 1 ng/ml 내지 120 ng/ml, 1 ng/ml 내지 90 ng/ml, 1 ng/ml 내지 60 ng/ml, 1 ng/ml 내지 30 ng/ml, 5 ng/ml 내지 1250 ng/ml, 5 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 5 ng/ml 내지 500 ng/ml, 5 ng/ml 내지 200 ng/ml, 5 ng/ml 내지 120 ng/ml, 5 ng/ml 내지 90 ng/ml, 5 ng/ml 내지 60 ng/ml, 5 ng/ml 내지 30 ng/ml, 10 ng/ml 내지 1250 ng/ml, 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 10 ng/ml 내지 500 ng/ml, 10 ng/ml 내지 200 ng/ml, 10 ng/ml 내지 120 ng/ml, 10 ng/ml 내지 90 ng/ml, 10 ng/ml 내지 60 ng/ml, 10 ng/ml 내지 30 ng/ml, 15 ng/ml 내지 1250 ng/ml, 15 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 15 ng/ml 내지 500 ng/ml, 15 ng/ml 내지 200 ng/ml, 15 ng/ml 내지 120 ng/ml, 15 ng/ml 내지 90 ng/ml, 15 ng/ml 내지 60 ng/ml, 15 ng/ml 내지 30 ng/ml , 30 ng/ml 내지 1250 ng/ml, 30 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 30 ng/ml 내지 500 ng/ml, 30 ng/ml 내지 200 ng/ml, 30 ng/ml 내지 120 ng/ml, 30 ng/ml 내지 90 ng/ml, 30 ng/ml 내지 60 ng/ml, 60 ng/ml 내지 1250 ng/ml, 60 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 60 ng/ml 내지 500 ng/ml, 60 ng/ml 내지 200 ng/ml, 60 ng/ml 내지 120 ng/ml 또는 60 ng/ml 내지 90 ng/ml으로 포함될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는 것으로, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 상기 주름은 피부 노화 또는 피부 탄력 감소를 포함하는 의미일 수 있다. 상기 피부 노화는 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로서, 특별한 환경적 요인 없이 누구에게나 세월과 함께 일어나는 내인성 노화(자연 노화)뿐만 아니라, 스트레스, 자외선, 흡연, 약물복용 등의 원인으로 일어나는 외인성 노화를 모두 포함할 수 있다. 상기 외인성 노화에 포함되는 광노화는 태양광선의 자외선에 반복적이거나 장기간 노출시 피부의 탄력 및 수분이 감소되고 주름이 형성되는 등 피부손상이 일어나는 현상을 의미한다. 구체적으로, 상기 광노화는 탄성섬유의 변성이나 침착, 콜라겐 섬유의 단열 등을 야기하는 광선성 엘라스토시스(actinic elastosis) 증상을 의미할 수 있다.

본원의 주름은 눈가, 미간, 이마 등의 안면, 목 등에 발생하는 주름일 수 있으며, 구체적으로 눈가 주름일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 조성물은 프로콜라겐 생합성을 촉진, 자외선에 의한 콜라게나아제(MMP-1) 발현을 억제, 엘라스타아제 활성을 억제 및/또는 피부 진피 치밀도를 증가시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본원에 따른 조성물이 주름의 발생을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어, "개선"은 주름 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 주름의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 구체적으로, 본원의 개선은 주름의 깊이 감소, 진피치밀도 증가 및/또는 일정 면적 내 주름 수 감소일 수 있다.

본원의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 팩으로 이루어지는 군에서 선택되는 형태으로 제형화되어 제공될 수 있다.

본원의 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본원의 화장품학적으로 허용 가능한 담체의 종류는 본원 화장료 조성물의 활성 및 특성을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 화장품학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 화장품학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 본원의 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

본원의 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본원의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 화장료 조성물의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 화장료 조성물의 제형이 팩인 경우에는, 폴리비닐알코올 등을 함유하는 필오프 팩, 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연, 또는 이산화티탄 등의 안료가 함유된 워시오프(wash off) 팩, 또는 마스크 시트 팩의 형태를 모두 포함하며, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 화장료 조성물은 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 킬레이트제, 살균제, 산화방지제, 방부제, 색소 및 향료 등의 통상적인 피부 외용제 성분에 포함되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본원의 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본원은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본원의 약학 조성물에서, 상기 화학식 1의 화합물, 밀배아, 밀배아의 발효물, 밀배아 발효물의 추출물, 피부 주름 및 예방에 대해서는 앞서 기술한 바가 모두 적용된다.

본원에서 용어, "치료"는 상기 조성물이 피부 주름의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다. 구체적으로, 주름의 깊이 감소, 진피치밀도 증가, 일정 면적 내 주름 수 감소 및/또는 주름 제거일 수 있다.

본원에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 본원 약학 조성물의 주름 예방 또는 치료 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균, 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한, 본원의 약학적으로 허용가능한 담체는 비자연적 담체를 포함할 수 있다.

본원의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본원에서 용어, "약학적으로 유효가능한 양"은 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본원 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본원의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본원에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본원의 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본원의 조성물의 투여 경로는 특별히 제한되지 않으나, 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 구체적으로는 비경구 투여할 수 있으며, 보다 구체적으로 피부에 도포하는 방식(즉, 경피투여)으로 적용될 수 있다. 구체적으로, 본원의 투여는 1일 1회 내지 4회, 2회 내지 3회 또는 2회 실시할 수 있다. 또한, 본원의 투여는 4주 이상, 8주 이상, 4주 내지 12주 또는 8주 내지 12주의 기간 동안 실시할 수 있다.

본원의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본원은 본원의 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본원의 의약외품 조성물에서 본원의 화학식 1의 화합물, 밀배아, 밀배아 발효물, 밀배아 발효물의 추출물, 피부 주름, 예방 및 개선에 대해서는 앞서 기술한 바가 모두 적용된다.

본원에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본원의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 화학식 1의 화합물, 밀배아 발효물 또는 밀배아 발효물의 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 본원의 화학식 1의 화합물, 밀배아 발효물 또는 밀배아 발효물의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.

본원의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본원의 화학식 1의 화합물, 밀배아 발효물 또는 이의 추출물, 또는 본원의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 주름을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본원의 피부 주름 예방, 개선 또는 치료하는 방법에 있어, 본원의 화학식 1의 화합물, 밀배아, 밀배아의 발효물, 밀배아 발효물의 추출물, 피부 주름, 예방, 개선, 치료 및 투여에 대해서는 앞서 기술한 바가 모두 적용된다.

본원의 조성물은 독성이 없고, 프로콜라겐 생합성을 촉진하며, 자외선에 의한 콜라게나아제 및 엘라스타아제 발현을 억제하고, 진피 치밀도 및 피부 주름 깊이를 감소시키는 효과를 나타냄으로써 피부 주름 예방, 개선 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.

도 1은 본원의 화학식 1의 화합물인 2,6-DMBQ를 이용하여 검량선을 그린 다음, 피크의 면적을 검량선을 이용하여 환산하여 본원의 일 실시예에 따른 밀배아 발효물의 추출물 내 2,6-DMBQ 함량을 환산한 결과이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 밀배아 발효물의 추출물(CJ)의 세포독성 시험을 NHDF 세포에 대해 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 2,6-DMBQ의 인간 피부 섬유아세포에 대한 세포독성을 측정한 결과이다.
도 4a 및 4b는 본원의 일 실시예에 따른 밀배아 발효물의 추출물(도 4a) 및 2,6-DMBQ(도 4b)의 제1형 프로콜라겐 생합성 양상을 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 5b는 본원의 일 실시예에 따른 밀배아 발효물의 추출물(도 5a) 및 2,6-DMBQ(도 5b)의 자외선 조사에 따른 MMP-1 생성 억제 활성을 비교한 그래프이다.
도 6는 본원의 일 실시예에 따른 밀배아 발효물의 추출물의 엘라스타아제 활성 억제를 비교한 그래프이다.
도 7는 눈가 주름을 측정하는 경우에 있어서, 주름 파라미터 R1 및 R3를 설명하는 도면이다.
도 8a 내지 도 8f는 본원의 일 실시예에 따른 밀배아 발효물의 추출물 함유 제품(CJD 크림)과 음성 대조군 제품(control 크림)을 비교한 도면이다. 도 8a는 시점별 피부 눈가 주름의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 시점별 제품 사용에 따른 눈가 주름의 증감율을 나타낸 그래프이며, 도 8c는 제품 사용에 따른 개체의 눈가 주름 변화를 나타낸 사진이다. 도 8d는 시점별 피부 진피치밀도의 변화를 나타낸 그래프이며, 도 8e는 시점별 제품 사용에 따른 진피치밀도 증감율을 나타낸 그래프이고, 도 8f는 제품사용에 따른 개체의 진피치밀도 변화를 나타낸 사진이다.
도 9a 내지 도 9f는 본원의 일 실시예에 따른 밀배아 발효물의 추출물 함유 제품(CJD 크림)과 양성 대조군 제품(ADE 크림: 아데노신함유)을 비교한 도면이다. 도 9a는 시점별 피부 눈가 주름의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 9b는 시점별 제품 사용에 따른 눈가 주름의 증감율을 나타낸 그래프이며, 도 9c는 제품 사용에 따른 개체의 눈가 주름 변화를 나타낸 사진이다. 도 9d는 시점별 피부 진피치밀도의 변화를 나타낸 그래프이며, 도 9e는 시점별 제품 사용에 따른 진피치밀도 증감율을 나타낸 그래프이고, 도 9f는 제품사용에 따른 개체의 진피치밀도 변화를 나타낸 사진이다.

이하, 본원을 하기 예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본원이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 밀배아 발효물의 추출물 제조

플라스크에 밀배아(CJ제일제당) 50g과 물 500g을 넣고 잘 혼합한 다음, 121℃에서 15분간 멸균하고 냉각하였다. 이후, 밀배아 중량대비 5%(2.5g)의 건조효모[빵효모(사카로마이세스 세레비지애), Angel Yeast]를 접종하고, 30℃에서 40시간 동안 발효한 다음, 8000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상기 상등액을 동결건조하여 회수하여 밀배아 발효물의 추출물을 제조하였다.

본 실시예에서 상기 밀배아 발효물의 추출물은 'CJ'로 명명하였다.

제조예 2: 밀배아 발효물의 추출물의 성분 분석

밀배아 발효물의 추출물의 성분을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과 2,6-디메톡시벤조퀴논(2,6-DMBQ: 2,6-Dimethoxybenzoquinone)이 포함되어 있었으며, 이의 함량은 밀배아 발효물의 추출물의 동결건조물 기준 700ppm이었다. 상기 DMBQ 함량은 시판 2,6-DMBQ(Sigma-Aldrich)를 클로로포름을 이용하여 농도별로 희석한 다음, HPLC에서 분석되는 피크 면적으로 검량선을 그린 후, 밀배아 발효물의 추출물 내의 DMBQ의 피크 면적을 검량선을 이용하여 환산하여 계산하였다(도 1).

이하의 실험예 및 실시예에서의 2,6-DMBQ는 Sigma-Aldrich에서 구매하여 사용하였다.

실험예1 : 세포 독성 실험(cell viability assay)

상기 제조예 1의 밀배아 발효물의 추출물(CJ)에 대하여, NHDF 세포에서의 세포독성을 측정하였다. 구체적으로, NHDF 세포를 96-웰 플레이트에 6x10³ 세포/웰로 분주한 다음 0.1% 인슐린(Insulin), 0.1% rhFGF, 0.1% 겐타마이신(gentamicin), 2% FBS를 함유하는 FBM(Fibroblast Basal Medium, Lonza, CC-3131) 배지에 넣고 37℃를 유지하며 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 12시간의 기아상태를 유지한 뒤, 농도별 제조예 1의 밀배아 발효물의 추출물(실험구) 및 첨가제(supplement)가 제외된 FBM 배지(대조구)를 각각 넣고, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1(water-soluble tetrazolium salt-1, Roche) 반응액을 첨가제가 제외된 FBM 배지에 1/10로 희석하고 이를 각 웰당 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후, NHDF 세포에 시료를 제외한 FBM 배지만 처리한 경우(대조구)에 대하여, 제조예 1의 밀배아 발효물의 추출물(CJ)을 처리한 경우(실험구)의 상대적인 세포생존율을 백분율로 나타내었다.

그 결과, 시료 200 μg/ml 이하에서는 별다른 세포 독성을 보이지 않음을 확인하였다(도 2). 이에 따라 이후 in vitro 실험에서는 시료의 농도를 50 μg/ml 이하로 설정하였다.

더불어, 2,6-DMBQ(Sigma-Aldrich)의 인간 피부 섬유아세포(HDF: Human dermal fibroblast) 대한 세포독성을 측정하였다. 구체적으로, HDF 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 세포수가 6X10⁵ 세포/웰이 되도록 배양하였다. 100 mm 세포 배양 접시를 사용하여 5% CO₂ 배양기에 배양하고, 합류에 도달한 세포는 Trypsin-EDTA를 사용하여 계대 배양하여 유지하였다. 이후, 96 웰 세포 배양 플레이트에 2X10³ 세포/웰 농도의 HDF 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Thermo) 배양액으로 24시간 배양한 후, 2,6-DMBQ를 처리하였다. 상기 2,6-DMBQ 처리는 2,6-DMBQ를 물에 용해시켜 스톡(stock)을 농도 별로 1/2씩 희석하여 준비하고 DMEM(serum free, P/S 1%) 배지에 최종농도(0.3125 μg/ml, 0.625 μg/ml 및 1.25 μg/ml)가 되도록 희석하여 이전 배양액을 모두 제거(suction)한 후첨가하여 48시간 배양하여 실시하였다. 배양이 끝난 세포는 EZ-CYTOX(EZ-1000, Daeil lab service, Korea) 10% 함유한 DMEM(serum free, P/S 1%) 배지로 교체한 후 Plate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정해 세포생존율을 구하였다.

그 결과, 1.25 μg/ml 이하의 농도에서 모두 세포 독성을 보이지 않음을 확인하였다(도 3).

DMBQ가 HDF 세포의 생존율에 미치는 영향

농도(μg/ml)	세포생존율(%)		통계 분석 (p-value)
농도(μg/ml)	평균	표준편차	통계 분석 (p-value)
대조구(Control)	100.0	2.5	-
0.3125	107.9	7.0	0.179
0.625	105.3	1.7	0.045
1.25	110.8	4.7	0.037

실험예 2: 주름 개선 효능 평가

2-1: 제1형 프로콜라겐 생합성 촉진 실험

NHDF 세포를 48-웰 플레이트에 1x10⁴세포/웰로 분주하고 실험예 1과 동일한 FBM 배지에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 24시간 세포의 기아상태를 유지한 다음 제조예 1의 밀배아 발효물의 추출물 및 2,6-DMBQ를 각각 FBM(첨가물 제외)에 희석하여 농도 별로(밀배아 발효물의 추출물: 1 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml; 2,6-DMBQ: 15 ng/ml, 30 ng/ml, 60 ng/ml 및 120 ng/ml) 각각 세포에 처리 한 후 24시간 배양하였다. 이후, 배양된 세포의 배지를 수거하여 프로콜라겐 타입 I c-펩타이드(PIP) EIA 키트(TAKARA, MK101)을 사용하여 프로콜라겐 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척하고, 1N NaOH로 세포용해(lysis)시킨 후, 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 프로콜라겐 합성양을 계산하였다.

그 결과, 밀배아 발효물의 추출물은 농도 의존적으로 프로콜라겐의 생성량을 증가시키는 것을 확인하였다(도 4a). 또한, 2,6-DMBQ의 경우 15 ng/ml 내지 120 ng/ml 농도 범위에서 프로콜라겐 발현을 통계적으로 유의한 수준으로 촉진하였으며, 15 ng/ml 내지 30 ng/ml 농도 범위에서는 농도 의존적인 양상을 보여 30 ng/ml 처리시 최고 188.53 ± 9.23% 수준까지 촉진하여 양성 대조군과 유사한 매우 우수한 프로콜라겐 발현 촉진능이 있음을 확인할 수 있었다(표 2, 도 4b, Paired t-test : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

농도(ng/ml)	제1형 프로콜라겐 발현양(%)		통계 분석 (p-value)
농도(ng/ml)	평균	표준편차	통계 분석 (p-value)
Control	100.0	11.6	-
15	172.4	2.6	0.0063
30	188.5	9.2	0.0006
60	177.8	5.3	0.0025
120	161.9	15.0	0.0057
TGF-β(5 ng/ml)	203.8	5.9	0.009

2-2: 콜라게나아제 ( MMP -1) 발현 억제 실험

주름이 생성되는 여러 기전 중, 자외선에 의하여 발현되는 콜라겐 분해효소인 콜라게나아제(MMP-1, Matrix metalloproteinase-1)의 발현 정도를 면역 ELISA 에세이를 이용하여 측정함으로써 시료의 주름 개선 효능을 평가하였다.

구체적으로, NHDF 세포를 24-웰 플레이트에 2x10⁴ 세포/웰로 분주한 다음 실험예 1과 동일한 배지에서 24시간 배양하였다. 24시간 이후 배지를 버리고 DPBS로 세척한 다음, DPBS 200 ㎕를 첨가하여 UV-B 40 mJ/㎠를 조사하였다. 이후 상기 실험예 2-1과 동일 농도의 제조예 1의 밀배아 발효물의 추출물(CJ)을 각각 상기 세포에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후, 배양액을 취하여 인간 전체 MMP-1 ELISA 키트(R&D system, DY901)로 MMP-1 양을 측정하였고, 측정된 MMP-1 양은 총 단백질 양으로 보정하였다.

2,6-DMBQ 처리의 경우, 상기 방법에서 UV-B 조사를 15mJ/cm²로 실시한 것만을 제외하고 동일한 방법으로 MMP-1 양을 측정하였으며 레티놀산(Retinoic acid)을 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, UVB 조사에 따라 MMP-1 발현이 증가한 대조군(+)에 밀배아 발효물의 추출물(CJ)을 처리함에 따라 MMP-1이 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 보였다(도 5a).

또한, 2,6-DMBQ를 처리한 경우 15 내지 120 ng/ml 농도 범위에서 유의한 수준의 MMP-1 억제 효과를 보였으며, 농도 의존적인 양상을 보여 120 ng/ml 처리시 음성 대조군에 비하여 최고 68%까지 발현을 억제함을 확인할 수 있었다(표 3, 도 5b).

농도(ng/ml)	MMP-1 발현율 (% of control)		통계 분석 (p-value)	발현 억제율 (% of control
농도(ng/ml)	평균	표준편차	통계 분석 (p-value)	발현 억제율 (% of control
non-UV	61.8	6.0	-	-
대조군(control)	100.0	10.3	-	0.0
15	92.5	16.6	0.5	19.7
30	89.5	14.8	0.4	27.4
60	83.2	9.8	0.1	44.1
120	73.7	6.6	0.0	68.7
레티놀산 (200 ng/ml)	63.7	9.9	0.0	95.0

2-3: 엘라스타아제( elastase ) 저해 실험

밀배아 발효물의 추출물 및 2,6-DMBQ가 엘라스타아제의 활성을 억제함을 확인하기 위해 엘라스타아제와 기질인 N-STANA(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide)와의 반응 억제 정도를 평가하였다. 먼저, 피부 섬유아세포인 NHDF 세포에 0.1% triton X-100이 함유된 0.2M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가한 후 초음파 분쇄기를 통하여 균질화시켰다. 이를 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 엘라스타아제 활성 확인을 위한 시료로 사용하였다.

상기 시료 200 ㎍/ml, 0.2M Tris-HCl 완충액 및 제조예 1의 밀배아 발효물의 추출물(CJ)을 농도별로 각각 혼합한 후, 50 mM N-STANA를 넣고 37℃에서 배양한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후, 밀배아 발효물의 추출물을 처리하지 않은 음성 대조군('-'로 표시) 대비 엘라스타아제 활성 억제 정도를 계산하였다. 양성 대조군으로는 엘라스타아제 활성 억제제로 알려진 포스포라미돈(phosphoramidon, 10 mM, '+'로 표시)을 사용하였다.

그 결과, 밀배아 발효물의 추출물(50 ㎍/ml)은 음성 대조군대비 약 62%로 엘라스타아제 활성을 억제함과 동시에 양성 대조군에 동등 수준의 효과를 나타냄을 확인하였다(도 6).

실시예 1: 밀배아 발효물의 추출물을 함유한 화장료의 제조

1-1 화장 크림의 제조

하기 표 4에 개시된 조성(중량%)과 같이, 제조예 1의 밀배아 발효물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

1-2: 화장 크림의 주름 개선 효능에 대한 임상 평가

1-2-1: 실험개요

상기 실시예 1-1에서 제조된 화장 크림(이하 'CJD 크림'이라 함)의 주름 개선 효과를, 음성 대조군(상기 표 4의 조성에서 밀배아 발효물의 추출물 대신 동량의 정제수를 포함하는 크림, 이하 'control 크림'이라 함) 또는 양성 대조군(밀배아 발효물의 추출물 대신, 주름 개선 기능성 고시 원료인 아데노신(adenosine) 0.04%를 동량 함유하는 크림, 이하 'ADE 크림'이라 함)과 각각 비교하여 임상평가를 수행하였다. 평가대상은 눈가주름이 생성된(경희대피부공학센터 SOP의 육안평가등급 3이상) 30~55세의 한국 성인여성 20명으로 하였다.

먼저 무작위 배정(block randomization)을 통해 대조군 크림 및 ADE 크림과 CJD 크림을 도포할 부위를 배정하고 12주간 사용하도록 한 다음, 사용 전(0주), 사용 4주 후, 8주 후, 12주 후 시점에서 육안평가, 기기측정(사진촬영, 피부주름, 진피치밀도) 및 안전성 평가를 실시하여, 밀배아 발효물의 추출물을 함유하는 크림의 인체 피부의 주름 개선에 대한 유효성을 평가하였다. 구체적인 시료 정보 및 사용 방법을 하기 표 5 및 표 6에 정리하였다.

임상평가대상자들은 매 평가시점에서 세안을 한 다음 공기의 이동과 직사광선이 없는 항온항습 조건(22±2℃, 50±5%)이 유지되는 공간에서 20분간 피부 안정을 취한 후 각 측정 및 평가에 참여하였다. 측정 및 평가절차를 하기 표 7에 정리하였다.

기기 측정은 제품 사용 전(0주), 사용 4주 후, 8주 후, 12주 후 시점에서 임상평가대사장자들의 오른쪽과 왼쪽 뺨의 진피치밀도를 측정하였으며, 오른쪽과 왼쪽 눈가의 주름을 측정하였다.

1-2-2: Control 크림 대비 평가

눈가주름(Replica) 측정

Skin-Visiometer® SV600(Courage+Khazaka GmbH, Germany)는 인공 광원에서 방출된 빛이 실리콘 재질을 투과하면서 생기는 빛의 강도를 분석하여 피부주름 개선 정도를 측정하는 기기로서, 제작된 모사판을 기기 내 분석 키트에 넣고 Visiometer의 이미지 분석 소프트웨어(Image analyzer software)에 의해 분석하였다. R1, R3값이 작아질수록 피부 주름이 개선되어 주름의 깊이가 낮아짐을 의미하며 단위는 임의의 단위(AU: arbitrary unit)이다. 도 7에서 보는 바와 같이, 주름 파라미터(roughness parameter, R-parameter) R1은 피부거칠기(skin roughness)로 프로필의 가장 높은 지점과 가장 낮은 지점 간의 거리를 나타내며, R3는 평균 거칠기(average roughness)로 프로필을 연속적으로 5개의 길이로 균분한 다음 각 영역에서의 R1값을 산술 평균한 값이다.

측정 결과, 하기 표 8과 같이 CJD 크림은 제품 사용 후 모든 시점(4주, 8주, 12주 후)에 R1, R3가 사용 전에 비하여 통계적으로 유의하게 감소하였으며, Control 크림에 비하여 주름 개선 효과가 우수하게 나타났다.

그룹 간 비교한 결과, 하기 표 9 및 도 8a 내지 도 8c와 같이 크림 사용 8주 후의 피부 거칠기(R1) 값과 평균 거칠기(R3) 값이 Control 크림 사용군에 비해 CJD 크림 사용군에서 통계적으로 유의하게 감소하였다.

진피 치밀도 측정

DermaScanC®USB는 20MHz의 고해상도 초음파 영상장치로 밀도가 다른 조직 사이에서 반사되어 다양한 크기의 에코를 생성하는 초음파를 이용하여 피부속 변화, 콜라겐 섬유 반사율에 의한 진피층 변화 등을 영상화하는 장치이다. 에코의 크기는 컴퓨터에 의해 합성되어 색상으로 표현되어 2차원적 화상을 만든다. 본 시험에서는 각 평가시점마다 DermaScanC®USB를 사용하여 연구대상자를 얼굴 좌측과 우측 뺨 부위(눈꼬리 아래와 코 끝 옆이 만나는 부위)의 진피 치밀도를 측정하였다. 촬영된 영상에서 밀도 값을 분석하였다.

크림 사용 전과 비교 시, CJD 크림 사용군이 제품사용 12주 후 시점에 진피의 밀도(intensity)가 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였다(표 10 및 도 8d 내지 도 8f).

그룹 간 비교 시, 제품사용 12주 후 시점에 CJD 크림이 Control 크림 사용군에 비해 진피의 밀도(intensity)가 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였다 (표 11 및 도 8d, 8f).

안전성 평가

시험제품(CJD 크림 및 Control 크림) 사용 4주 후, 8주 후, 12주 후 시점에 임상평가대상자의 피부 상태를 관찰하고 연구대상자와의 질의 응답을 통해 주관적, 객관적 자극에 대한 피부상태를 확인하여 기록, 평가하였다. 그 결과, 모든 임상평가대상자에게서 어떠한 피부 이상 반응도 관찰되지 않았다(표 12).

기기평가를 통해 산출된 결과는 SPSS® Package Program version 22를 이용하여 통계분석 하였다. 시험제품 사용 전 측정값의 정규성은 Sapiro-wilks test를 군간의 제품 사용 전 측정값의 동질성은 Paired T-test를 이용하여 검정하였다. 제품 사용 전, 후 비교는 측정값이 정규분포를 만족할 경우 반복측정 분산분석법(Repeated Measures ANOVA)을, 정규분포를 만족하지 않을 경우 비모수적 방법(Krusckal-Wallis 및 Mann-Whitney U test)을 통하여 통계적 유의성을 검증하였다. 군간 비교는 동일 연구대상자에게서 반복 측정되어 산출된 결과의 상호의존성(교호작용)을 고려하여 반복측정 분산분석법(Repeated Measures ANOVA)을 이용하여 통계적 유의성을 검증하였고, 유의수준은 p<0.05으로 설정하였다. 설문평가는 빈도 분석을 이용하여 분석하였다.

상기 임상평가 결과에 의하면 모든 임상평가 대상자들에게서 피부이상반응을 관찰할 수 없었으며, CJD크림은 Control 크림에 비하여 유의한 주름 개선 효과를 나타내었다.

1-2-3: ADE 크림 대비 평가

눈가주름(Replica) 측정

상기 1-2-2의 눈가주름 측정 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, CJD 크림 사용 8주 경과 시, 사용 전에 비하여 피부 거칠기가, 12주 후 시점에는 피부 거칠기(R1)와 평균 거칠기(R3)가 통계적으로 유의하게 감소(개선)하였다(p<0.05)(표 13 및 도 9a 내지 9c). 이러한 개선 효과는 ADE 크림에 비해 우수하게 나타났다.

그룹 간 시점별 R-파라미터 변화는 하기 표 14와 같으며, 밀배아 발효 추출물은 천연 추출물이지만, 미생물 발효 후 화학적 정제공정(수지 흡착, 암모니아, 에탄올 용출 등)을 거쳐 수득된 아데노신을 함유한 ADE 크림과 동등 수준의 효과를 가짐을 알 수 있었다.

진피 치밀도 측정

1-2-2의 진피 치밀도 측정 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, CJD 크림은 제품사용 12주 후 시점에 진피의 두께(distance)가, 8주, 12주 후 시점에 밀도(intensity)가 통계적으로 유의하게 증가(개선)하였다(p<0.05)(표 15 및 도 9d 내지 9f). 이러한 개선 효과는 ADE 크림과 유사하거나 더 높게 나타났다.

그룹 간 시점별 피부 진피치 밀도 변화는 하기 표 16과 같으며, 전술한 바와 마찬가지로, 밀배아 발효 추출물은 천연 추출물이지만 화학적 정제 공정을 거친 아데노신을 함유한 ADE 크림과 동등 수준의 효과를 가짐을 알 수 있었다.

안전성 평가

시험제품(CJD 크림 및 ADE 크림) 사용 4주 후, 8주 후, 12주 후 시점에 임상평가대상자의 피부 상태를 관찰하고 연구대상자와의 질의 응답을 통해 주관적, 객관적 자극에 대한 피부상태를 확인하여 기록, 평가하였다. 그 결과, 모든 임상평가대상자에게서 어떠한 피부 이상 반응도 관찰되지 않았다(표 17).

상기 임상평가 결과에 의하면 모든 임상평가대상자들에게서 피부이상반응을 관찰할 수 없었으며, CJD 크림은 ADE 크림에 버금가는 주름 개선 효과를 보이는 것으로 나타났다.

이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서, 상기 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]
삭제
제1항에 있어서,
상기 밀배아 발효물은 밀배아 또는 이를 포함한 배지에 효모를 접종한 후 배양하여 수득한 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 배양은 20℃ 내지 40℃에서 12 시간 내지 60 시간 동안 실시하는, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 전체 화장료 조성물 중 0.001 중량%내지 10 중량%로 포함하는 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 프로콜라겐 생합성을 촉진하는, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 자외선에 의한 콜라게나아제(MMP-1) 발현을 억제하는 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 엘라스타아제 활성을 억제하는 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 진피 치밀도를 증가시키는 것인, 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
하기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는, 피부 주름 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
하기 화학식 1의 화합물, 또는 밀배아 발효물 또는 이의 추출물을 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물로서, 상기 밀배아 발효물 또는 이의 추출물은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는, 피부 주름 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
[화학식 1]