KR20130011703A - 겨우살이 발효추출물, 모근 발효추출물 및 콩 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물을 포함하는 세포 증식 촉진 및 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 섬유아세포의 증식효능 측정 및 각질형성세포 분화 촉진 효과가 우수하며, 화학 물질이나 광자극에 의한 피부 조직 손상을 회복을 촉진시키는 효과 또한 우수하므로, 우수한 손상된 피부 조직 회복용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

겨우살이 발효추출물, 모근 발효추출물 및 콩 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물{The cosmetic composition for promoting cell growth and recovery of distrupted skin containing the extracts of fermented Mistletoe, fermented Imperata cylindrica and fermented soybean}

본 발명은 세포 증식 촉진 및 손상된 피부 회복 촉진 효과를 갖는 발효 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽기능은 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등)에대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다.

표피 중에서도 가장 바깥쪽에 존재하는 각질층(Stratumcorneum, horneylayer)은 각질형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다(MarceloC.L.etal,J.Invest.Dermatol.,80,pp37-44,1983).

각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basalcell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이며, 일정기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화과정을 "표피세포의 분화" 또는 "각화(keratinization)"라고 부른다.

또한, 각화 과정 중에 각질형성세포는 천연 보습인자와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부장벽으로서의 기능을 보유하게 한다.

이러한 각질층은 과도한 세안이나, 목욕 등의 생활습관적 요소나, 건조한 대기 오염물질 등의 환경적인 요인, 그리고 아토피성 피부나 노인성 피부같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제로 현대에 들어서 더욱 늘어난 다양한 요인들로 인해 최근에는 건조피부증상 및 이로 인한 제반 장해를 호소하는 부분들이 점점 증가하고 있는 추세이다.

그러나, 최근 피부에 대한 위해요인이 점점 증가되고 있고, 식생활 양상의 변화로 각질층의 생성, 탈락 속도가 늦어지며, 각질형성세포의 기능저하로 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 각질층이 정상적인 피부장벽기능을 발휘하지 못하는 피부를 가진 사람들이 증가하고 있는 추세이다. 이런 피부장벽기능의 와해는 피부건조증, 아토피피부염, 접촉성피부염, 건선 등의 다양한 피부질환을 유발하게 된다. 이와 같은 질환들은 기존의 통상적인 수분보유기능을 갖는 보습제만으로도 증상완화는 기대할 수 있지만 근본적인 치유는 어려운 실정이다.

콩(soybean) 식용작물로서 널리 재배되고 있으며, 대두라고도 한다. 대두(Glycine max (L.) Merrill)는 식물학적으로, 콩과(Leguminosae), 접형화아과(Papilionoideae), Glycine L. 종에 속해있는 한 해살이 식물로 씨에는 단백질 36~45 %, 기름이 17~22 %, 외에 트리테르페노이드사포닌, 질소화합물, 탄수화물, 사탕, 펙틴, 무기물과 비타민이 있다. 단백질의 80~90 %는 필수아미노산 즉 아르기닌, 메티오닌, 트레오닌, 로이신, 이소로이신, 발린 등으로 이루어졌다. 씨의 인지질 함량은 레시틴, 케팔린 등을 함유하며, 질소화합물로는 아데닌, 구아닌, 콜린, 트리고넬린, 아미노산인 히스티딘을 함유하고 있다(문관심, 약초의 성분과 이용, 일월서각, p387, 1999).

겨우살이(Mistletoe, Viscum album)는 겨우살이과에 속하는 식물로서 세계 전역에 30속 1,500 여종이 있는 것으로 알려져 있다. 여러 종의 겨우살이 중에서 약제로 사용되는 겨우살이는 비스쿰(Viscum) 속의 겨우살이며, 특히 유럽산 겨우살이인 비스쿰 알붐 로란타체아(Viscum album loranthacea)는 유럽에서 이미 항암 및 항암보조제로 인가되어 사용되고 있다. 한국산 겨우살이는 유럽산 겨우살이와는 아종이 다른 비스쿰 알붐 콜로라툼 (Viscum album coloratum)으로 참나무, 배나무, 오리나무, 사과나무, 팽나무, 소나무, 가문비나무 등 다양한 나무들을 숙주로 하는 반기생 식물이다. 한방에서는 상기생이라는 약초명으로 진정(鎭靜), 통경(痛經), 요통, 고혈압, 소종(消腫), 유산(流産)방지, 치통, 자통(刺痛) 등에 이용되어 왔다. 또한, 겨우살이를 발효시키는 유산균으로는 유럽에서 락토바실러스 프란타룸(Lactobacillus plantarum)이 알려져 있는데, 이 유산균으로 발효시킨 겨우살이가 체액성 및 세포성 면역체계를 자극하는 면역증강 효과가 있는 것으로 보고되어 있다. 유산균에 의한 겨우살이의 발효는 세포에 대한 겨우살이의 직접적인 독성 효과는 줄이고 반면 겨우살이의 면역증강 활성은 유지시키는 것으로 알려져 있다.

또한, 띠(Imperata cylindrica var.koenigii)는 외떡잎 식물 벼목 화본과의 여러해살이 풀로 북아메리카, 아시아, 아프리카의 온대에서 열대에 걸쳐 분포되어 있다. 줄기는 뿌리줄기의 마디에서 나오고 편평하며 줄모양이고 길이가 20~50 cm, 폭이 7~12 mm이며 끝이 뾰족하고 밑부분의 길이가 12 mm의 깃털에 둘러 쌓여 있다. 한약재 명으로 백모근이라 불리우며 중국의 약초원전 본초강목에 열을 없애고 소변을 잘보게 하며 황달, 수종을 치료하는 약재로 소개된 띠는 여러해살이 풀로서 제주도의 해안가 및 들에서 자라는데 예로부터 제주에서는 그 뿌리를 구황식물로서뿐만 아니라 황달기가 있는 환자에게 달여 먹여왔고 그 줄기는 제주도 초가 지붕을 이었던 재료로서 귀중하게 생각하여 왔다.

본 발명자는 보다 효율적인 피부손상을 예방할 수 있는 화장료 조성물에 대한 연구도중 우수한 세포 증식능을 보이는 식물 추출물을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2000-38058A 초록 KR 10-2008-54829A 초록

따라서, 본 발명의 목적은 효과적인 생약의 발효추출물 또는 그 조합을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일구체예는 모근의 효모 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 촉진 및/또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물을 제공한다.

상기 모근 효모 발효추출물은 모근을 세절하고, 세절된 모근에 효모를 접종하여 얻을 수 있으며, 또는 모근에서 추출물을 얻은 뒤, 그것을 다시 효모균주를 접종하여 발효시켜 얻을 수도 있다.

상기 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법, 즉, 통상적인 온도와 압력 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 모근 추출물 제조에 사용될 수 있는 추출용매로는 예를 들면, 물, 탄소수 C₁ 내지 C₃의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3 부틸렌 글리콜 등의 추출용매를 단독으로 또는 혼합하여 사용 가능하다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 모근 추출물 건조 중량의 1 내지 15배 정도이며, 5 내지 12배일 수 있으며, 10배일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 추출 방법으로는 열 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등을 사용할 수 있으며, 1회 또는 다수 회 반복하여 추출시켜 사용할 수 있다. 또한, 추출온도는 모근 추출물의 유용성분의 유효활성이 제거되지 않을 정도의 온도이면, 특별히 제한되지 않는다.

상기 효모 발효는 당업계에서 공지된 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다. 각 균주의 특징에 따라 통상적인 조건 및 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건에서 배양될 수 있다. 또한, 발효균의 배양을 더욱 활성화시키기 위하여 추가적인 탄소원 및/또는 pH 조절제가 첨가될 수도 있다. 예를 들면, 추출물 또는 여과되지 않은 추출물에 10⁵ 내지 10⁷ cells/ml의 일정의 농도로 효모를 접종하고, pH 5.5 내지 8.5, 온도 32 내지 40 ℃, 습도 60 내지 80 % 로 유지하면서, 조건에 따라 24 내지 96시간 동안 배양하여 발효시킬 수 있다. 생성된 발효 산물 내에 남아있는 효모균체는 오코클레이브와 같은 가압멸균 조건에서 전부 멸균시킨다.

상기 효모는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 시조사카로마이세스 속(Shizosaccharomyces sp.) 등을 사용할 수 있으며, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomycescerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루레로마이세스 락티스(Klureromyceslactis), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 모근 효모 발효추출물은 세포는 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능 측정 및 각질형성세포 분화 촉진 효과(표 2, 표 3, 도 1 및 도 2)가 우수하며, 화학 물질이나 광자극에 의한 피부 조직 손상의 회복을 촉진시키는 효과가 우수함을 확인하였다(표 4, 표 5, 도 3 및 도 4 참조).

또한, 본 발명의 일구체예는 모근 효모 발효추출물 및 겨우살이 효모 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 촉진 및/또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물을 제공한다.

상기 겨우살이 효모 발효추출물은 상기 모근 효모 발효추출물과 동일한 방법으로 얻을 수 있다. 상기 발효화장료 조성물은 모근 효모 발효추출물 및 겨우살이 효모 발효추출물을 1 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비율로 포함하거나, 2 ~ 8 : 2 ~ 8의 중량비율로 함유하거나, 4 ~ 6 : 4 ~ 6의 중량비율로 함유할 수 있다. 그러나, 함량비율은 제품의 특성에 따라 다양한 중량비로 혼합될 수 있다.

상기 모근 효모 발효추출물 및 겨우살이 효모 발효추출물의 조합은 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능 및 각질형성세포 분화 촉진 효과(표 2, 표 3, 도 1 및 도 2)가 단독 발효추출물에 비하여 현저히 우수함을 확인하였다. 또한, 화학 물질이나 광자극에 의한 피부 조직 손상의 회복을 촉진시키는 효과 또한 단독 발효추출물에 비하여 우수함을 확인하였다(표 4, 표 5, 도 3 및 도 4).

또한, 본 발명의 일 구체예는 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 촉진 및/또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물을 제공한다.

상기 콩 락토바실러스 발효추출물은 상기 모근 효모 발효추출물과 유사한 방법으로 얻을 수 있다. 다만, 발효균으로 락토바실러스균(Lactobacillus)을 사용하며, 락토바실러스균은 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum ), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus) 및 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii ) 아종 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 발효화장료 조성물은 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩락토바실러스 발효추출물을 1 ~ 10 : 1 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비율로 포함할 수 있고, 2 ~ 8 : 2 ~ 8 : 2 ~ 8의 중량비율로 함유될 수 있으며, 4 ~ 6 : 4 ~ 6 : 4 ~ 6의 중량비율로 함유될 수 있다. 그러나, 함량비율은 제품의 특성에 따라 다양한 중량비로 혼합될 수 있다.

상기 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩 락토바실러스 발효추출물은 세포는 섬유아세포의 증식효능 및 각질형성세포 분화 촉진 효과(표 2, 표 3, 도 1 및 도 2)가 단독 발효추출물에 비하여 현저히 우수함을 확인하였다. 또한, 화학 물질이나 광자극에 의한 피부 조직 손상을 회복을 촉진시키는 효과 또한 단독 발효추출물에 비하여 매우 우수함을 확인하였다(표 4, 표 5, 도 3 및 도 4).

또한, 본 발명의 일 구체예는 모근 효모 발효추출물 단독 또는 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물의 혼합물, 또는 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩락토바실러스 발효추출물의 혼합물을 함유하는 손상된 피부 회복 촉진 효과를 갖는 발효 화장품을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구체예에 따른 발효 화장료 조성물은 제품내에서 1 내지 30 중량 %로 함유되거나, 5 내지 20 중량 %로 함유될 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 화장용 조성물은 상기 추출물 이외에 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 또는 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물을 포함하는 화장료 조성물은 섬유아세포의 증식효능 측정 및 각질형성세포 분화 촉진 효과가 우수하며, 화학 물질이나 광자극에 의한 피부 조직 손상을 회복을 촉진시키는 효과 또한 우수하므로, 손상된 피부 조직 회복에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 모근 추출물, 겨우살이 추출물 및 콩 추출물, 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩락토바실러스 발효추출물 각각 및 이의 혼합물에 대한 섬유아세포의 증식효능을 그래프화 한 것이다.
도 2는 모근 추출물, 겨우살이 추출물 및 콩 추출물, 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩락토바실러스 발효추출물 각각 및 이의 혼합물에 대한 각질형성세포 분화 촉진 효과를 그래프화 한 것이다.
도 3은 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩락토바실러스 발효추출물 각각 및 이의 혼합물에 대한 화학 물질로 인한 피부 손상에 대한 회복 촉진 효과를 그래프화 한 것이다.
도 4은 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩락토바실러스 발효추출물 각각 및 이의 혼합물에 대한 광자극으로 인한 피부 손상에 대한 회복 촉진 효과를 그래프화 한 것이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 하기의 실시예나 시험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 겨우살이 추출물의 제조

건조한 겨우살이 1 kg에 3차 증류수 5ℓ를 가하고 80 내지 85℃에서 3시간 동안 3회 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 동결 건조하여 겨우살이 열수 추출물 83 g을 얻었다. 제조된 추출물을 60Co 감마선(10 kGy/H, 25 kGy)으로 조사 멸균하여 사용하였다.

< 실시예 2> 모근 추출물의 제조

건조한 모근(띠의 뿌리)를 정제수로 세척하고, 세절한 후 세절된 모근 1 kg에 3차 증류수 5ℓ를 가하고 80 내지 85℃에서 3시간 동안 3회 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 동결 건조하여 모근 열수 추출물 89 g을 얻었다. 제조된 추출물을 60Co 감마선(10 kGy/H, 25 kGy)으로 조사 멸균하여 사용하였다.

< 실시예 3> 콩 추출물의 제조

콩 추출물을 얻기 위해, 대두를 정제수로 세척하고 건조시키고, 이를 미세하게 분말화 한 후 대두 분말 1 kg에 3차 증류수 5ℓ를 가하고 80 내지 85℃에서 3시간 동안 3회 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 동결 건조하여 콩 열수 추출물 108 g을 얻었다. 제조된 추출물을 60Co 감마선(10 kGy/H, 25 kGy)으로 조사 멸균하여 사용하였다.

< 실시예 4> 겨우살이의 효모발효추출물의 제조

건조한 겨우살이를 정제수로 세척하고, 세절한 후 세절된 겨우살이 1 kg에 3차 증류수 5ℓ를 가하고 80 내지 85℃에서 3시간 동안 3회 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 건조한 후 500 ml의 겨우살이 추출액을 Co 감마선(10 kGy/H, 25 kGy)으로 조사 멸균하였다.

상기에서 얻은 추출물에 효모를 접종하였다. 이때 효모는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였다(50,000 cfu/L로 첨가). 배양은 3일 동안, 36 ℃로 유지하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심 분리 및 0.45 ㎛의 필터로 여과막을 이용하여 1차 여과하였고, 배양균 및 찌꺼기를 제거한 후, 0.25 ㎛ 여과막을 이용하여 2차 여과하였다. 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 겨우살이효모발효추출물 73 g을 수득하였다.

< 실시예 5> 모근의 효모발효추출물의 제조

건조한 모근(띠의 뿌리)를 정제수로 세척하고, 세절한 후 세절된 모근 1 kg에 3차 증류수 5ℓ를 가하고 80 내지 85℃에서 3시간 동안 3회 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 건조한 후 500 ml의 모근 추출액을 Co 감마선(10 kGy/H, 25 kGy)으로 조사 멸균하였다.

상기에서 얻은 추출물에 효모를 접종하였다. 이때 효모는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였다(50,000 cfu/L로 첨가). 배양은 3일 동안, 36 ℃로 유지하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심 분리 및 0.45 ㎛의 필터로 여과막을 이용하여 1차 여과하였고, 배양균 및 찌꺼기를 제거한 후, 0.25 ㎛ 여과막을 이용하여 2차 여과하였다. 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 모근효모발효추출물 78 g을 수득하였다.

< 실시예 6> 콩의 락토바실러스발효추출물의 제조

콩(대두)를 정제수로 세척하고 건조시키고, 이를 미세하게 분말화 한 후 대두 분말 1 kg에 3차 증류수 5ℓ를 가하고 80 내지 85℃에서 3시간 동안 3회 추출한 후 400메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛의 필터로 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 건조한 후 500 ml의 콩 추출액을 Co 감마선(10 kGy/H, 25 kGy)으로 조사 멸균하였다.

상기에서 얻은 추출물에 락토바실러스를 접종하였다. 이때 락토바실러스는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactbacillus fermentum)을 사용하였다(50,000 cfu/L로 첨가). 배양은 3일 동안, 36 ℃로 유지하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심 분리 및 0.45 ㎛의 필터로 여과막을 이용하여 1차 여과하였고, 배양균 및 찌꺼기를 제거한 후, 0.25 ㎛ 여과막을 이용하여 2차 여과하였다. 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 콩락토바실러스발효추출물 98 g을 수득하였다.

< 실시예 7 내지 14> 혼합 추출물의 제조

상기 실시예 1 내지 6에서 얻은 겨우살이 추출물, 모근 추출물, 콩 추출물, 겨우살이효모 발효추출물, 모근효모 발효추출물, 및 콩락토바실러스 발효추출물을 표 1에 제시된 것과 같은 중량 비율로 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였다.

실시예	겨우살이 추출물	모근 추출물	콩 추출물	겨우살이효모 발효추출물	모근효모 발효추출물	콩락토바실러스 발효추출물
7	50	50	-	-	-	-
8	50	-	50	-	-	-
9	-	50	50	-	-	-
10	35	35	30	-	-	-
11	-	-	-	50	50	-
12	-	-	-	50	-	50
13	-	-	-	-	50	50
14	-	-	-	35	35	30

< 실험예 1> 섬유아세포( Fibroblast )의 증식효능 측정

3.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Doubecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 인체 섬유아세포를 96웰 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하고, 시료로서 실시예 1 내지 14의 추출물 및 대조군으로서 FBS(Fetal bovin serum)을 각각 1 %의 양으로 첨가한 후, 37℃ 온도에서 2일간 배양하였다. 배양 후, 0.2% MTT(3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 각 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 다시 37℃ 온도에서 4시간 동안 배양한 후, 생성된 포르마잔(formazane)을 DMSO(Dimethylsulfoxide)로 용해시켰다. 용해된 포르마잔의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 이러한 MTT 시험을 통해 각 시료에 대한 세포증식을 평가하였다. 그 결과는 표 2와 같다.

시료	세포 증식능 (%)
대조군	29.31
실시예1	15.4
실시예2	16.3
실시예3	12.2
실시예4	24.1
실시예5	28.4
실시예6	26.3
실시예7	16.2
실시예8	15.1
실시예9	15.8
실시예10	15.9
실시예11	34.5
실시예12	32.5
실시예13	33.7
실시예14	39.4

표 2로부터, 발효추출물을 처리한 경우, 일반 추출물을 처리한 경우에 비하여 섬유아세포의 증식 효능이 매우 높음을 알 수 있다. 특히, 일반 추출물과는 달리 발효추출물의 경우에는 발효추출물을 혼합할 경우 단독으로 처리한 경우에 비하여 섬유아세포의 증식 효능이 매우 높음을 알 수 있다.

< 실험예 2> 각질형성세포 분화 촉진 효과

상기 실시예 1 내지 14로부터 수득한 추출물의 각질형성세포 분화촉진효과를 알아보기 위해, 하기와 같이 각질형성세포의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)양을 흡광도를 이용하여 측정하였다. 먼저, 신생아의 표피로부터 분리해 일차 배양한 사람의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 뒤 하기 실시예 1 내지 14의 추출물 배양액에 1 %로 처리한 후 세포가 바닥면적의 70~80 % 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이때, 저칼슘(0.02 mM)처리군과 고칼슘(1.5 mM)처리군을 각각 음성 대조군, 양성 대조군으로 하였다.

그 후 상기 배양한 세포를 수확하여 PBS로 세척한 뒤 2% SDS와 20 mM 농도의 DTT (Dithiothreitol)를 함유한 10 mM 농도의 트리스-염산완충액 (pH7.4) 1 ml를 가하여 소니케이션하여 세포 파쇄후, 보일링(boiling), 원심분리한 후 침전물을 다시 PBS 1 ml에 현탁시켜 340 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액을 일부 취하여 단백질 함량을 측정하고, 세포분화정도 평가시 기준으로 삼았다. 그 결과를 하기 표 3과 같다.

시료	각질형성세포 분화능 (%)
음성 대조군(칼슘 0.02 mM 용액)	100
양성 대조군(칼슘 1.5 mM 용액)	207
실시예1	123
실시예2	129
실시예3	118
실시예4	146
실시예5	151
실시예6	148
실시예7	124
실시예8	126
실시예9	128
실시예10	127
실시예11	167
실시예12	161
실시예13	165
실시예14	172

표 3으로부터, 발효추출물의 처리한 경우, 일반 추출물을 처리한 경우에 비하여 각질형성세포 분화 촉진 효능이 매우 높음을 알 수 있다. 특히, 일반 추출물과는 달리 발효추출물의 경우에는 발효추출물을 혼합할 경우 단독으로 처리한 경우에 비하여 각질형성세포 분화 촉진 효능이 매우 높음을 알 수 있다.

< 실험예 3> 무모생쥐 피부에서의 피부장벽기능회복 효과측정

상기 실시예 4 내지 6, 및 11 내지 14로부터 수득한 각 발효추출물 또는 발효추출물의 혼합물이 피부손상으로 인해 손상된 피부장벽기능의 회복에 미치는 효과 및 피부보습력 증가에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 출생 후 8 내지 10주 경과한 무모생쥐 (Charles River, Japan)의 등에 아세톤을 1일 2회씩 5일 동안 주기적으로 도포하여 실험동물 등피부의 장벽기능 손실을 유도한 다음 증발계(Evaporimeter)로 TEWL(Transepidermal water loss, 경피수분손실)을 측정하여 40 g/m²/hr 이상의 경피 수분손실을 나타내는 피부를 가진 실험 동물만을 대상으로 시험물질로 프로필렌글리콜과 에탄올을 7:3의 비율로 혼합한 비히클(Vehicle)(비히클처리군)과 실시예 4 내지 6, 및 11 내지 14로부터 수득한 각 발효추출물 또는 발효추출물의 혼합물을 각각 1 % 함유한 샘플을 피부면적 5 cm²당 200 μl의 용량으로 1일 2회씩 3일 동안 연속 도포하면서 일정 시간마다 TEWL을 측정하여 그 결과를 표 4 및 도 3에 나타내었다.

시료	TEWL
	0h	6h	12h	24h	48h
실시예4	47.4	43.5	40.2	28.4	20.7
실시예5	46.7	43.7	39.5	27.2	18.8
실시예6	47.3	43.2	39.2	28.7	19.5
실시예11	48.4	43.7	35.8	22.5	12.1
실시예12	47.7	45.3	38.4	25.2	13.9
실시예13	45.9	41.9	36.8	24.5	13.5
실시예14	46.2	40.5	29.7	24.5	13.5
대조군( 정제수 )	47.6	45.8	43.1	31.2	24.5

이상의 결과로부터, 실시예 11 내지 14의 혼합추출물은 피부세포의 분화 촉진과 증식 억제 및 각질형성세포의 분화촉진 및 손상된 피부 장벽회복에 있어서 그 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 4> 광접촉에 의한 손상피부 회복효과 측정 시험

피부색소 측정기(Chromameter CM2002)를 이용하여 조사 부위의 피부색 초기값을 측정하였다. 자외선 조사 후 손상피부 회복 효과는 솔라 시뮬레이터(solar simulator)를 이용하여 10명의 시험자들의 양쪽팔에서 최소 홍반량을 측정하였다. 우선, 홍반을 유발하기 위해 시험자들의 양쪽팔에 자외선(UV)을 FDA 방법에 의거하여 조사하였다.

자외선 조사후 8, 16, 24, 48시간 이후 실시예 4 내지 6 및 11 내지 14의 추출물을 시험자의 한쪽 팔에 도포하였고, 다른 쪽 팔에는 증류수를 도포하였다. 자외선 전후에 피부색을 측정하였다. 자외선 조사 후 전 피부색을 100으로 조정하고 상대적으로 홍반지수를 측정하였다. 아노바 테스트(Anova test) 통계유의는 p< 0.05이다.

시료	홍반지수( Erythema index )
	8시간	16시간	24시간	48시간
실시예4	137.62	176.52	174.86	142.98
실시예5	131.36	170.12	167.41	141.52
실시예6	132.47	171.68	168.24	142.74
실시예11	121.82	141.34	139.26	124.72
실시예12	121.71	143.52	142.26	124.68
실시예13	123.36	145.74	147.74	132.47
실시예14	117.24	131.23	129.54	119.24
대조군( 정제수 )	152.45	196.52	194.34	188.26

< 실험예 5> 독성 시험

실시예 4 내지 6으로부터 수득한 각 발효추출물의 세포 독성 시험을 실시하였다. 96웰 플레이트에 세포를 접종하고 24 시간 후, 실시예 4 내지 6으로부터 수득한 각 발효추출물을 일정한 농도로 처리하여 37 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터에서 배양하였다. 48 시간 배양 후, 배지를 제거하고 MTT(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliu, bromide) 용액 100 ㎕을 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 용액을 제거하고 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 염색된 세포를 녹인 후 ELISA 리더(reader)를 이용하여 파장 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 수학식 1를 이용하여 계산하였다. 그 결과, 실시예 4 내지 6으로부터 수득한 각 발효추출물(0.5 mg/㎖ 또는 1 mg/㎖)을 처리한 구는 무처리구와 비교하였을 때, 세포 생존율이 96.2 % 내지 98.3 %로 나타났다(표 6).

추출물의 세포 독성 측정

	함유량	무처리군	실시예4	실시예5	실시예6
세포 생존율(%)	0.5 ㎎/㎖	100	98.3	97.2	97.6
	1 ㎎/㎖	100	97.1	96.2	98.3

본 발명의 조성물은 아래와 같은 제형으로 제조할 수 있으며, 아래의 제제는 본 발명을 예시한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 유연 화장수

정제수에 부틸렌 글리콜, 글리세린, 폴리옥시에틸렌 경화 피마지유, 베타인, 구연산, 구연산나트륨 및 방부제를 첨가하여 교반한 후 용해시킨 다음, 에탄올에 향료를 넣어 용해시킨 혼합물을 첨가하였다. 여기에 상기 실시예 14에 따른 겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물을 가하여 충분히 교반한 후, 숙성시켜 본 발명에 따른 상기 혼합추출물을 함유한 유연 화장수를 제조하였다. 하기 표 7에 각 성분의 함량을 나타내었다.

성분	함량(중량%)
겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물	4.0
부틸렌 글리콜	3.5
글리세린	2.5
폴리옥시에틸렌 경화 피마자유	0.1
에탄올	2.5
베타인	1.0
구연산	0.01
구연산 나트륨	0.03
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

< 제제예 2> 영양 화장수

상기 실시예 14에 따른 겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 카르복시비닐폴리머, 아르기닌, 방부제 및 정제수를 70 ℃ ~ 75 ℃에서 교반하면서 가열하였다. 여기에 75 ℃ ~ 80 ℃에서 교반하여 가열시킨 스쿠알란, 부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 소르비탄스테아레이트, 포리소르베이트 60, 글리세릴 스테아레이트 및 스테아릴글리세레티네이트 혼합물을 가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45℃정도로 냉각하면서 향료를 첨가하여 교반한 다음, 30 ℃까지 냉각한 후 숙성시켜 본 발명에 따른 상기 혼합추출물을 함유한 영양화장수를 제조하였다. 하기 표 8에 각 성분의 함량을 나타내었다.

성분	함량(중량%)
겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물	6.0
부틸렌 글리콜	8.0
글리세린	5.0
스쿠알란	4.0
부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트	5.0
소르비탄스테아레이트	1.5
폴리소르베이트 60	1.0
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

< 제제예 3> 영양 에센스

시토 시테롤, 폴리글리세릴-2-올레이트, 세라마이드, 세테아레스-4 및 콜레스테롤을 교반하여 혼합한 다음, 상기 실시예 14에 따른 겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물, 디세틸포스페이트, 농글리세린 및 정제수 혼합용액을 첨가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45 ℃로 냉각되면 향료를 첨가하여 교반하고 30 ℃까지 냉각시켜 숙성시켰다. 여기에 카르복시비닐폴리머, 산탄검 및 방부제를 첨가하여 안정화시킨 후 숙성시켜 본 발명에 따른 상기 혼합발효추출물을 함유한 영양 에센스를 제조하였다. 하기 표 9에 각 성분의 함량을 나타내었다.

성분	함량(중량%)
겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물	7.0
시토 스테롤	1.7
폴리글리세릴-2-올레이트	1.5
세라마이드	0.5
세테아레스-4	1.2
콜레스테롤	1.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.2
산탄검	0.2
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

< 제제예 4> 영양 크림

1,3-부틸렌 글리콜, 글레세린, 하이드로제네이트드 레시진, 옥틸도데카놀, 트리옥타노인, 스테아릭에씨드, 폴리솔베이트 60, 및 소르비탄세스퀴올레이트을 교반하여 혼합한 다음, 상기 실시예 14에 따른 겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물, 트리에탄올아민, 디메치콘, EDTA, 글리세린 및 정제수 혼합용액을 첨가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45 ℃로 냉각되면 향료를 첨가하여 교반하고 30 ℃까지 냉각시켜 숙성시켰다. 여기에 산탄검 및 방부제를 첨가하여 안정화시킨 후 숙성시켜 본 발명에 따른 상기 혼합추출물을 함유한 영양 크림을 제조하였다. 하기 표 10에 각 성분의 함량을 나타내었다.

성분	함량(중량%)
겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물	10.0
1,3-부틸렌 글리콜	3.0
글리세린	3.0
하이드로제네이티드 레시친	1.0
옥틸도데카놀	3.0
트리옥타노인	2.0
스테아릭에씨드	1.5
세토스테아릴알콜	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	2.0
디메치콘	3.0
항산화제	0.3
산탄검	0.2
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
정제수	잔량

< 제제예 5> 팩

글리세린, 1,3-부틸렌 글리콜, 소듐하이루로네이트, 글리신, 및 폴리아크릴아마이드을 교반하여 혼합한 다음, 상기 실시예 14에 따른 겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물, 스쿠알렌, 디메치콘, 트리에탄올아민, 및 EDTA 합용액을 첨가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45 ℃로 냉각되면 향료를 첨가하여 교반하고 30 ℃까지 냉각시켜 숙성시켰다. 여기에 산탄검 및 방부제를 첨가하여 안정화시킨 후 숙성시킨후 부직포에 본 발명에 따른 상기 혼합추출물을 도포하여 팩을 제조하였다. 하기 표 11에 각 성분의 함량을 나타내었다.

성분	함량(중량%)
겨우살이 발효추출물, 모근발효추출물 및 콩발효추출물	8.0
글리세린	7.0
1,3-부틸렌 글리콜	3.0
스쿠알렌	3.0
디메치콘	3.0
소듐하이루로네이트	0.1
글리신	2.0
폴리아크릴아마이드	5.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
정제수	잔량

Claims (8)

1. 모근의 효모 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 겨우살이의 효모 발효추출물을 더 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 모근 효모 발효추출물과 겨우살이 효모 발효추출물을 1 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비율로 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.
4. 제2항에 있어서, 콩의 락토바실러스 발효추출물을 더 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 모근 효모 발효추출물, 겨우살이 효모 발효추출물 및 콩 락토바실러스 발효추출물을 1 ~ 10 : 1 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비율로 포함하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애, 시조사카로마이세스 폼베, 클루레로마이세스 락티스 및 사카로마이세스 보울라디로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.
7. 제4항에 있어서, 락토바실러스는 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스플란타룸, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 헬베티커스 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 수렴화장수, 밀크 로션, 파운데이션, 비누 또는 세안폼으로 제제화된 것을 특징으로 하는 세포 증식 촉진 또는 손상된 피부 회복 촉진용 발효 화장료 조성물.

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