CN111184822A - 白茅根发酵物用于提升基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、提升抗氧化能力的用途 - Google Patents

Abstract

本发明是关于植物发酵物的用途，尤其是一种白茅根发酵物用于提升基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、提升抗氧化能力的用途。本发明提供一种白茅根发酵物是将白茅根水萃取物以酵母菌、及乳酸杆菌进行二段式发酵所制得。本发明还提供一种白茅根发酵物用于制备提升皮肤细胞角蛋白基因、聚角蛋白微丝基因与玻尿酸合成酶基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、及提升抗氧化能力的组合物用途，所述白茅根发酵物能有效使皮肤保湿能力上升、维持角质细胞排列、维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能，并能使皮肤紧致有弹性，以及防止皮肤老化。

Description

白茅根发酵物用于提升基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋 白增生、提升抗氧化能力的用途

技术领域

本发明是关于植物发酵物的用途，尤其是一种白茅根发酵物用于提升基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、提升抗氧化能力的用途。

背景技术

表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与细胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。

表皮层中的角质层，其角质细胞虽然为死细胞，但其主要成分为角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮肤保持湿润，角质细胞也会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，以防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤接触过冷或过热的环境以及照射紫外光等刺激，会导致角质细胞无法维持正常的代谢循环，且皮肤保水能力也会下降，并导致皮肤表皮层屏障受损，让皮肤变得粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红，因此角质层的健康与保水能力对于抵御外来伤害着实非常重要。

综合上面所述，因应讲求天然健康的现代趋势，为改善因角质细胞受损及保水能力下降，导致皮肤变得脆弱、易敏的问题，开发一种能有效使角质细胞分泌更多保湿因子，并维持角质细胞排列、维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能的综合皮肤保健组合物，着实有其必要性。

发明内容

缘此，本发明的一目的在提供一种白茅根发酵物用于制备提升角蛋白(Keratin，KRT)基因、聚角蛋白微丝(Filaggrin，FLG)基因、及/或玻尿酸合成酶(Hyaluronansynthase，HAS)基因表现量的组合物的用途。

本发明的又一目的在提供一种白茅根发酵物用于制备促进皮肤细胞增生胶原蛋白及/或弹力蛋白的组合物的用途。

本发明的又一目的在提供一种白茅根发酵物用于制备提升皮肤细胞抗氧化活性的组合物的用途。

本发明的另一目的在提供一种白茅根发酵物的制造方法，包含：将一白茅根水萃取物经由一酵母菌、及一乳酸杆菌依序进行发酵而获得；其中该白茅根发酵物是由一白茅根水萃取物与一微生物群的二阶段发酵而得，其中该微生物群是由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、及一乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)所组成。

在本发明的一实施例中，其中该白茅根水萃取物是一白茅根以1∶18-30的固液比例与水混合，并在50-100℃下灭菌萃取0.5-3小时所得；且该酵母菌为BCRC20271的菌株、该乳酸杆菌为BCRC910805的菌株；该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)、该乳酸杆菌的添加量0.01-0.25％(v/v)；且该酵母菌、及该乳酸杆菌的培养时间分别皆是1-3天；且该发酵是提高白茅根的总多糖含量，其中该白茅根发酵物的总多糖至少为20％。

在本发明的又一实施例中，该KRT基因是角蛋白14(Keratin14，KRT14)基因；且该HAS基因包含玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2，HAS2)基因及玻尿酸合成酶3(Hyaluronan synthase 3，HAS3)基因。

本发明的白茅根发酵物在经过本发明微生物发酵步骤后，能有效提升其中效性成分总多糖的含量，以提升皮肤保湿的功效，并提升皮肤角质层结构的完整；亦能藉由有效提高KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因的表现量，而有效使皮肤角质分泌更多保湿因子，并使皮肤保湿能力上升、维持角质细胞排列、维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能；亦能有效促进皮肤细胞的胶原蛋白增生，并能使皮肤恢复光滑紧致，以提升皮肤饱水度使皮肤丰盈细滑；亦能有效促进皮肤细胞的弹力蛋白增生，以维持皮肤紧实有弹性，并减少皮肤的皱纹产生使皮肤丰盈细滑；以及能有效清除皮肤细胞中的自由基，能提升皮肤细胞抗氧化能力，以防止皮肤老化的发生。因此，本发明的白茅根发酵物可用于制备提升皮肤细胞角蛋白基因、聚角蛋白微丝基因与玻尿酸合成酶基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、及提升抗氧化能力的组合物的用途，该组合物该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的一实施例白茅根发酵物与白茅根水萃取物中总多糖含量比较的柱形图；

图2是本发明的一实施例白茅根发酵物提升KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因表现量的效果的柱形图；**p＜0.01；

图3是本发明的一实施例白茅根发酵物促进胶原蛋白增生的效果的柱形图；**p＜0.01；###p＜0.001；

图4是本发明的一实施例白茅根发酵物促进弹力蛋白增生的效果的柱形图；**P＜0.01；##p＜0.01；

图5是本发明的一实施例白茅根发酵物提升细胞抗氧化能力的效果的柱形图；***p＜0.001；###p＜0.001。

具体实施方式

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student′s t-test)分析。

白茅根(Imperata cylindrica)为禾本科(Gramineae)茅根属(Imperata)多年生草本植物，又称茅草、白茅草、茅根，植株高20～80公分，根茎呈白色，横走于地下，节部生有鳞片，尖端有甜味，单叶互生，集中于基部，老时基部常有破碎呈纤维状的叶鞘，叶片扁平，呈条状或条状披针形，夏季开花，花为银白色，分枝密集。目前已知白茅根具有清热润肺、生津解毒、健肝养脾功效，降火生津、凉血、利尿等功效。

如本文中所使用的，用语「白茅根发酵物」意为白茅根水萃取物以酵母菌及乳酸杆菌经一二段式发酵而得，其中白茅根水萃取物是白茅根与溶剂以1∶18-30(w/w)比例经一时间与温度萃取而得。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional inj ection)。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。

依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。

依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum，jelly)以及白凡士林(white petrolatum，)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如

974P(

974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。

依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(externaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

本发明提供一种白茅根发酵物用于制备提升皮肤细胞角蛋白基因、聚角蛋白微丝基因与玻尿酸合成酶基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、及提升抗氧化能力的组合物的用途，本发明的白茅根发酵物是将白茅根水萃取物以酵母菌及乳酸杆菌进行二段式发酵所得的白茅根发酵物，其中白茅根水萃取物是以一溶剂萃取一白茅根所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，本发明的白茅根发酵物可用于提升KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因的表现量、促进皮肤细胞的胶原蛋白及弹力蛋白的增生、使皮肤保湿能力上升、维持角质细胞排列、维持角质层结构完整、及提升皮肤细胞抗氧化能力。

同时，本发明用于制备提升皮肤细胞角蛋白基因、聚角蛋白微丝基因与玻尿酸合成酶基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、及提升抗氧化能力的组合物，亦可包含一有效量的白茅根发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、一食品或一保养品。

以下将详细说明本发明白茅根发酵物的详细制备方法，与该白茅根发酵物于总多糖含量提升的测试、于提升KRT基因、FLG基因、HAS基因的测试、于促进皮肤细胞增生胶原蛋白的测试、促进皮肤细胞增生弹力蛋白的测试、以及于提升细胞抗氧化能力的测试，以证实该白茅根发酵物对于提升KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因的表现量、促进皮肤细胞的胶原蛋白及弹力蛋白的增生、使皮肤保湿能力上升、维持角质细胞排列、维持角质层结构完整、及提升皮肤细胞抗氧化能力的功效。

实施例1 本发明的白茅根发酵物的制备方法

在本发明一实施例中，将白茅根彻底清洗，取洗净后的白茅根以1∶18-30的固液重量比例与水混合，在50-100℃下灭菌萃取0.5-3小时，以获得白茅根水萃取物，该白茅根水萃取物冷却至室温供后续二段式发酵使用，首先殖入0.01-0.5％(v/v)酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC20271)于该白茅根水萃取物内于20-37℃进行发酵1-3天后，接着直接加入0.01-0.25％(v/v)乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum TCI028，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC910805)于20-37℃发酵1-3天；其中，此二种菌的发酵依序为：酵母菌、及乳酸杆菌，且无法前后对调，最后在不移除此二种菌的情况下，使用设定的糖度范围35～45°、pH2～4、酒精＜3％等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到发酵液，其总多糖含量至少占20％。接着将发酵液进行高温灭菌，将该发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400mesh网筛过滤，再0.5-1.5％的防腐剂(Phenoxyethanol)调整规格后灭菌，即得到本发明的白茅根发酵物，其中通过微生物发酵制成，使白茅根的有效物质大量释出。

实施例2 本发明的发酵步骤提升白茅根水萃取物中总多糖含量的效果

本实施例为了比较本发明的白茅根发酵物中总多糖含量是否较白茅根水萃取物高，因此使用苯酚-硫酸法(Phenol-sulfuric acid assay)来定量样品中总多糖的浓度，其中当糖类遇到强酸时，结构式上的羟基会与酚结合，并产生橘黄色液体，因此可用比色法(特别是样品于490nm的吸光值)检测其中的总多糖的浓度。首先，精密秤取10mg的D-葡萄糖(D-Glucose，购自J.T.Baker，美国，编号为1916-01)置于10mL的容量瓶中，再加入ddH₂O至总体积达10mL，并完成D-葡萄糖的标准品(D-Glucose stock，1mg/mL)，接着将上述标准品以表一的配方进行系列稀释，以dd H₂O稀释为0μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、及200μg/mL的D-Glucose。另外，取1.25g的Phenol(购自Merck，德国，编号1.00206.0250)于容量瓶中，再加入ddH₂O至总体积达25mL，以完成5％苯酚的作用溶液。

表一、序列稀释d-葡萄糖标准品的配方

接着绘制标准溶液的回归曲线，取各浓度的标准溶液100μL于玻璃试管中，分别加入500μL的5％苯酚溶液，并缓慢地加入2.5mL硫酸溶液(95.5％的H₂SO4，购自Showa，日本，编号1970-5250)于各试管中，以漩涡混合器(Vortex)混合均匀后静置20分钟，接着取200μL各组混合液于96孔培养盘中，测量于490nm的吸光值，以绘制标准溶液的回归曲线公式。接着，分别取100μL的白茅根水萃取物、及本发明的白茅根发酵物于玻璃试管中，分别加入500μL的5％苯酚溶液，并缓慢地加入2.5mL硫酸溶液于各试管中，以Vortex混合均匀后静置20分钟，接着取200μL各组混合液于96孔培养盘中，测量于490nm的吸光值，并以上述的标准溶液的回归曲线公式，以内差法算出浓度后再回乘稀释倍数以取得原白茅根水萃取物及本发明的白茅根发酵物中总多糖的浓度。

本发明的白茅根发酵物中总多糖含量上升的结果如图2所示。白茅根经本发明的二段式发酵作用后，其中总多糖含量较单纯的白茅根水萃取物高出21％，此结果显示本发明的白茅根发酵物在经过本发明微生物发酵步骤后，可有效提升其中的总多糖含量，该发酵步骤能提升皮肤保湿的功效，并提升皮肤角质层结构的完整。

实施例3 本发明的白茅根发酵物于提升KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因表现量的功效

本发明以人类初代皮肤角质细胞(human primary epidermal keratinocytes，HPEK)进行本发明的白茅根发酵物调控TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的分析。该人类初级皮肤角质细胞购自CELLnTEC公司(瑞士)编号HPEK-50，将该细胞培养于无血清的角质细胞培养液(keratinocyte-SFM)(Gibco公司，编号为#17005042，美国)，并于含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中进行培养。

将1.5×10⁵个HPEK-50细胞培养于含有2mL上述细胞培养液的六孔培养盘中，于37℃培养24小时后，在不干扰贴附的细胞的情况下移除培养液，接着将细胞分成以下三组：(1)仅含有细胞培养液的控制组、(2)加入0.125％白茅根水萃取物的比较组、及(3)加入0.125％本发明的白茅根发酵物的实验组分别作用6小时，接着将角质细胞以细胞裂解液(RB buffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)分别收集两组细胞内的RNA，接着利用

III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板并以引子产生mRNA反转录的相应cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将两组反转录后产物分别以表二的组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、HAS2基因、及HAS3基因的mRNA表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2^-ΔCt，其中ΔCt＝Ct_目标基因-Ct_ACTB(β-肌动蛋白，beta-actin)，再利用Excel软件进行非成对单尾student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显着差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。

表二、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引子

本发明的白茅根发酵物提升KRT14基因、FLG基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的结果如图2所示。先前研究指出TGM会使角质化细胞的细胞膜与结构蛋白间形成强力键结，并能增加表皮层的强度与稳定性；KRT会形成角蛋微丝，而FLG会帮助角蛋白微丝组装成坚固的网络，为皮肤提供强度和弹性；AQP则会加角质细胞内水的通透性，以提高角质细胞的含水量；HAS会促进角质细胞分泌玻尿酸的能力，并使皮肤角质层结构完整且提升皮肤屏障功能，能使皮肤保水力提升，其中提升AQP基因及HAS基因的表现量，特别是HAS基因，能够有效使角质细胞分泌更多保湿因子。

人类初代角质细胞经本发明的白茅根发酵物处理后，KRT14基因表现量较控制组高约1.2倍、FLG基因表现量较控制组高约1.4倍、HAS2基因表现量较控制组显着的高约1.5倍、及HAS3基因表现量较控制组高约1.2倍，且KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因的表现量皆较比较组为高；另外，TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、及AQP3基因则与控制组差异不大，此结果显示本发明的白茅根发酵物在经过微生物发酵步骤后，可藉由有效提高KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因的表现量，而有效能使皮肤角质分泌更多保湿因子，并使皮肤保湿能力上升、维持角质细胞排列、维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能。

实施例4 本发明的白茅根发酵物于促进皮肤纤维母细胞增生胶原蛋白的功效

本发明实施例以人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast，CCD-966sk)进行本发明的白茅根发酵物于促进胶原蛋白增生的分析。该人类皮肤纤维母细胞购自美国典型培养物保藏中心

编号CRL-1881，将该细胞培养于含有10％的胎牛血清(FetalBovine Serum)以及90％的Minimum Essential Medium(MEM)的培养液(购自Gibco，美国)，其中含有1mM的丙酮酸钠(Sodium pyruvate)以及1％的青霉素/链霉素(penicillins/streptomycin)。

首先，将2×10⁴个人类皮肤纤维母细胞种植于含500μL的上述培养液的24孔培养盘中，并于37℃培养24小时后，以1倍磷酸盐缓冲溶液(1xPhosphate buffered saline，1xPBS)在不扰动细胞的情况下冲洗细胞，接着将细胞分成以下二组：(1)加入0.125％白茅根水萃取物的比较组、及(2)加入0.125％本发明的白茅根发酵物的实验组，分别溶于500μL不含胎牛血清的MEM，并以没有加入任何萃取物的组别为空白控制组，以及仅含有培养液不含细胞的组别以作为后续读取吸光值的背景值，于37℃培养48小时后，在不扰动细胞的情况下，每组细胞收集1mL的培养液，并置于1.5mL离心管中，以可溶性胶原蛋白分析套组(Sircol^TM Soluble Collagen Assay kit，Bicolor Life Science Assays，NothermIreland，英国)，检测皮肤纤维母细胞分泌的胶原蛋白的量。首先加入200μL的胶原蛋白分离与浓缩试剂(collagen isolation&concentration reagent)并上下倒置6-8次以混合均匀，接着将离心管于4℃放置16-18小时，时间到后取出，避免摇晃到管身，并在4℃下以12000rpm离心10分钟，离心后小心地移除1mL的上清液，再加入1mL的Sircol染剂(Sircoldye reagent)使胶原蛋白染色，并轻柔地摇晃30分钟以混合均匀，接着在4℃下以12000rpm离心10分钟后移除上清液，再加入750μL酸性盐清洗剂(Acid-salt washing reagent)，以将多余的染剂清洗掉，并在4℃下以12000rpm离心10分钟后移除上清液，并小心地以棉球将残留于管壁及盖子的液体移除，接着加入250μL的强碱试剂(alkali reagent)并以试管震荡器使胶原蛋白均匀溶解，最后以酵素免疫分析仪(ELISA reader，BioTek)测量此各组及空白控制组的产物于555nm的吸光值，并于扣除背景值后，计算该各组的读值与空白控制组的差异的百分比，再以Excel软体进行student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显着差异(与空白控制组比较：*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001。与白茅根水萃取物比较：#p值＜0.05；##p值＜0.01；###p值＜0.001)。

本发明的白茅根发酵物于促进皮肤细胞中胶原蛋白增生的实验结果如图3所示。人类初代角质细胞经本发明的白茅根发酵物处理后的实验组，较空白控制组显着高出23％的胶原蛋白含量，以白茅根水萃取物处理的比较组仅较空白控制组高出2％，其中实验组亦与比较组具有显着差异性。此结果显示本发明的白茅根发酵物在经过微生物发酵步骤后，能有效促进皮肤细胞的胶原蛋白增生，并能使皮肤恢复光滑紧致，以提升皮肤饱水量以使皮肤丰盈细滑。

实施例5 本发明的白茅根发酵物于促进皮肤纤维母细胞增生弹力蛋白的功效

本发明实施例以人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast，CCD-966sk)进行本发明的白茅根发酵物于促进弹力蛋白增生的分析。该人类皮肤纤维母细胞购自美国典型培养物保藏中心

编号CRL-1881，将该细胞培养于含有10％的胎牛血清(FetalBovine Serum)以及90％的Minimum Essential Medium(MEM)的培养液(购自Gibco，美国)，其中含有1mM的丙酮酸钠(Sodium pyruvate)以及1％的青霉素/链霉素(penicillins/streptomycin)。

首先，将1×10⁵个人类皮肤纤维母细胞种植于含2mL的上述培养液的6孔培养盘中，并于37℃培养24小时后，以磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline，PBS)在不扰动细胞的情况下冲洗细胞，接着将细胞分成以下二组：(1)加入0.125％白茅根水萃取物的比较组、及(2)加入0.125％本发明的白茅根发酵物的实验组，分别溶于2mL不含胎牛血清的MEM，并以没有加入任何萃取物的组别为空白控制组，以及仅含有培养液不含细胞的组别以作为后续读取吸光值的背景值，将上述各组细胞于37℃培养48小时后，在不扰动细胞的情况下移除培养液并以1xPBS清洗细胞一次，接着加入200μL胰蛋白酶(Trypsin)反应3分钟，使细胞由培养盘上脱落，加入1mL的细胞培养液终止反应，并将细胞连同培养液收集至1.5mL试管，并以300g离心5分钟后移除上清液，并以1xPBS清洗细胞一次后，再以300g离心5分钟后移除上清液，并加入约300μL的1xPBS重新悬浮细胞，接着以弹性蛋白分析套组(Fastin^TM Elastin Assay kit，购自Biocolor，英国)，检测皮肤纤维母细胞分泌的弹性蛋白的量。首先加入100μL的1.0M草酸溶液，并置于100℃的加热板上作用1小时，接着于各管中加入与管内溶液相同体积的弹性蛋白沉淀试剂(Elastin Precipitating Reagent)，关紧上盖后以vortex充分混合均匀，并静置15分钟使弹性蛋白完全沉淀，接着10,000g离心10分钟后，将离心管中的液体排空，并将离心管倒置且在纸巾上轻敲，使移除管中大部分的剩余液体，接着加入1mL的TPPS(5，10，15，20-tetraphenyl-21H，23H-porphine tetra-sulfonate)染料试剂，并将离心管上下倒置数次以混合均匀后置于机械振荡器上设定6rpm反应90分钟，移除未结合的染剂，其中在离心管的底部和可观察到弹性蛋白-染剂复合物(elastin-dye complex)的红褐色沉淀物，接着于各管中加入250μL的染料解离试剂(DyeDissociation Reagent)，关紧上盖后以vortex充分混合使染剂释放到溶液中，以确保所有结合的染剂已进入溶液中，再将各管的内容物转移至96孔培养盘中，并以酵素免疫分析仪(ELISA reader，BioTek)测量此各组及空白控制组的产物于513nm的吸光值，并于扣除背景值后，计算该各组的读值与空白控制组的差异的百分比，再以Excel软件进行student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显着差异(与空白控制组比较：*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001。与白茅根水萃取物比较：#p值＜0.05；##p值＜0.01；###p值＜0.001)。

本发明的白茅根发酵物于促进皮肤细胞中弹力蛋白增生的实验结果如图4所示。人类初代角质细胞经本发明的白茅根发酵物处理后的实验组，较空白控制组显着高出34％的弹力蛋白含量，以白茅根水萃取物处理的比较组仅较空白控制组高出约2％，其中实验组亦与比较组具有显着差异性。此结果显示本发明的白茅根发酵物在经过微生物发酵步骤后，能有效促进皮肤细胞的弹力蛋白增生，并能维持皮肤紧实有弹性，以减少皮肤的皱纹产生使皮肤丰盈细滑。

实施例6 本发明的白茅根发酵物于提升细胞抗氧化能力的功效

本发明实施例以人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast，CCD-966sk)进行本发明的白茅根发酵物于提升细胞抗氧化能力的分析。该人类皮肤纤维母细胞购自美国典型培养物保藏中心

编号CRL-1881。该细胞是培养于90％含有0.1mM的非必需氨基酸、1.5g/L的碳酸氢钠及1mM丙酮酸钠的MEM(Minimum essential medium，购自Eagle，美国，编号61100-061)细胞培养液中，其中含有10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国)。

将2×10⁵个CCD-966sk细胞培养于含有2mL上述细胞培养液的6孔培养盘中，于37℃培养24小时后，在不干扰贴附的细胞的情况下移除培养液，接着将细胞分成以下四组(每组n＝2)：(1)仅加入细胞培养液作用2小时的空白控制组、(2)加入1mM的H₂O₂(购自Sigma，美国，原液浓度为35％)的正控制组、(3)同时加入1mM的H₂O₂及白茅根水萃取物的比较组、及(4)同时加入1mM的H₂O₂及本发明的白茅根发酵物的实验组，其中第(2)组、第(3)组、及第(4)组皆于37℃下反应1小时。接着各组分别加入5μg/mL的DCFH-DA于37℃处理15分钟，再以H₂O₂于37℃处理细胞1小时后，以1mL的1xPBS清洗细胞两次，并加入200μL胰蛋白酶在黑暗中反应5分钟，使细胞由培养盘上脱落，加入适当的培养液终止反应，并将细胞连同培养液收集至1.5mL离心管，以400g离心10分钟后移除上清液，再以1mL的1xPBS冲洗细胞一次后，并于400g离心10分钟后除上清液，接着以1mL的1xPBS重新悬浮细胞，并加入DCFH-DA(购自Sigma，美国，编号SI-D6883-50MG，5mg/mL保存于DMSO中)标记细胞，并使用流式细胞仪检测细胞于激发波长450-490nm、放射波长510-550nm的荧光数值，计算含有荧光讯号的细胞数。再利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显着差异(与空白控制组比较：*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001。与白茅根水萃取物比较：#p值＜0.05；##p值＜0.01；###p值＜0.001)。

Dichloro-dihydro-fluorescin diacetate(DCFH-DA)是一种稳定的非极性化合物，可自由通透细胞膜，当DCFH-DA进入细胞后，会被细胞内的脂质酶水解，形成具有极性的DCFH，停留在细胞内无法出来，并会细胞内的活性氧类物质(Reactive Oxygen Species，简称ROS)与DCFH产生氧化还原反应形成Dichloro-fluorescin(DCF)，以450-490nm波长激发后，会产生的绿色荧光可以被于510-550nm波长被侦测出，因此侦测经DCFH-DA处理的细胞的荧光强度，能反映细胞内活性氧物质的含量。

本发明的白茅根发酵物于提升细胞抗氧化能力的实验结果如图5所示，其中以空白控制组所测得的荧光数值作为0％、以经H₂O₂处理的正控制组所测得的荧光数值为100％。人类初代角质细胞经本发明的白茅根发酵物处理后的实验组，能显着减少15％的ROS含量，以白茅根水萃取物处理的比较组仅能减少约3.5％，其中实验组亦与比较组具有显着差异性。此结果显示本发明的白茅根发酵物在经过微生物发酵步骤后，能有效清除皮肤细胞中的自由基，能提升皮肤细胞抗氧化能力，以防止皮肤老化的发生。

综上所述，本发明的白茅根发酵物在经过微生物发酵步骤后，能有效提升其中效性成分总多糖的含量，以提升皮肤保湿的功效，并提升皮肤角质层结构的完整；亦能藉由有效提高KRT14基因、FLG基因、HAS2基因及HAS3基因的表现量，而有效使皮肤角质分泌更多保湿因子，并使皮肤保湿能力上升、维持角质细胞排列、维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能；亦能有效促进皮肤细胞的胶原蛋白增生，并能使皮肤恢复光滑紧致，以提升皮肤饱水度使皮肤丰盈细滑；亦能有效促进皮肤细胞的弹力蛋白增生，以维持皮肤紧实有弹性，并减少皮肤的皱纹产生使皮肤丰盈细滑；以及能有效清除皮肤细胞中的自由基，能提升皮肤细胞抗氧化能力，以防止皮肤老化的发生。因此，本发明的白茅根发酵物可用于制备提升皮肤细胞角蛋白基因、聚角蛋白微丝基因与玻尿酸合成酶基因表现量、促进胶原蛋白与弹力蛋白增生、及提升抗氧化能力的组合物的用途，该组合物该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。

Claims (15)

1.一种白茅根发酵物用于制备提升角蛋白(Keratin，KRT)基因、聚角蛋白微丝(Filaggrin，FLG)基因、及/或玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase，HAS)基因表现量的组合物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述KRT基因是角蛋白14(Keratin14，KRT14)基因。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述HAS基因包含玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2，HAS2)基因及玻尿酸合成酶3(Hyaluronan synthase 3，HAS3)基因。

4.一种白茅根发酵物用于制备促进皮肤细胞增生胶原蛋白及/或弹力蛋白的组合物的用途。

5.一种白茅根发酵物用于制备提升皮肤细胞抗氧化活性的组合物的用途。

6.根据权利要求1、4、或5所述的用途，其特征在于，所述白茅根发酵物是由一白茅根水萃取物与一微生物群的二阶段发酵而得，其中所述微生物群是由一酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、及一乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)所组成。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述二阶段发酵是依序经该酵母菌、及该乳酸杆菌发酵而成。

8.根据权利要求1、4、或5所述的用途，其特征在于，所述白茅根发酵物的总多糖至少为20％。

9.根据权利要求1、4、或5所述的用途，其特征在于，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。

10.一种白茅根发酵物的制造方法，包含：

将一白茅根水萃取物经由一酵母菌、及一乳酸杆菌依序进行发酵而获得。

11.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于，所述酵母菌为BCRC20271的菌株；所述乳酸杆菌为BCRC910805的菌株。

12.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于，所述酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)；且所述乳酸杆菌的添加量0.01-0.25％(v/v)。

13.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于，所述酵母菌、及所述乳酸杆菌的培养时间分别皆是1-3天。

14.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于，所述白茅根水萃取物是一白茅根以1∶18-30的固液比例与水混合，并在50-100℃下灭菌萃取0.5-3小时所得。

15.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于，所述发酵提高白茅根的总多糖含量达至少20％。

Images