TW202402315A - 槐花萃取物及其用於製備保濕、抗老或抗發炎組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種槐花萃取物的用途，其是用於製備保濕組合物、抗老組合物或抗發炎組合物，其中槐花萃取物是以水提取槐樹的花朵而得。
Description
本發明涉及一種槐花萃取物，特別是關於槐花萃取物用於製備皮膚保濕的組合物或是皮膚抗老的組合物的用途。
槐樹為落葉喬木，常植於路邊或屋旁，也是一種常見的行道樹種。槐樹約在每年四到六月開花，成串的槐花不僅芳香美觀，口味也香甜，民間也常有食用鮮採槐花的習俗。
槐花自中國古代即有被使用的歷史，本草綱目記載「炒香頻嚼，治失音及喉痹，又療吐血衄血，崩中漏下。」，本經逢原記載「槐花苦涼，陽明、厥陰血分藥也。故大小便血，及目赤腫痛皆用之。目得血而能視，赤腫乃血熱之病也。腸血痔血同柏葉微炒為末，烏梅湯服。腸風髒毒，淘淨炒香為末。腸風荊芥湯服，髒毒蘸豬髒日日服之。但性純陰，陰寒無實火禁用。」。
有鑑於此，為了開發槐花更多層面的應用，故而提出一種槐花萃取物用於製備保濕的組合物、抗老的組合物或抗發炎的組合物的用途。
在一些實施例中，本發明提供一種槐花萃取物的用途，其是用於製備保濕組合物，槐花萃取物是以水提取槐樹的花朵而得。
在一些實施例中，槐花萃取物用於避免肌膚水份散失。
在一些實施例中，槐花萃取物用於形成肌膚防水屏障。
在一些實施例中，槐花萃取物用於提升肌膚保濕因子的含量。
在一些實施例中，肌膚保濕因子包括聚角蛋白微絲（filaggrin）。在一些實施例中，肌膚保濕因子包括葡萄糖神經醯胺酶（Glucosylceramidase，GBA）。
在一些實施例中，槐花萃取物用於增加玻尿酸的含量。
在一些實施例中，槐花萃取物用於改善肌膚潤澤感。
在一些實施例中，本發明提供一種槐花萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚老化的組合物，槐花萃取物是以水提取槐樹的花朵而得。
在一些實施例中，槐花萃取物用於減少肌膚紋理。
在一些實施例中，槐花萃取物用於減少肌膚毛孔。
在一些實施例中，槐花萃取物用於改善肌膚平滑度與緊緻度。
在一些實施例中，槐花萃取物用於減少肌膚活性氧化物質的含量。
在一些實施例中，本發明提供一種槐花萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚發炎的組合物，槐花萃取物是以水提取槐樹的花朵而得。
在一些實施例中，槐花萃取物用於降低肌膚產生發炎物質的含量。
綜上所述，任一實施例的槐花萃取物可用以製備保濕的組合物或是抗老或抗發炎的組合物。在一些實施例中，槐花萃取物可具有下列至少一種作用：避免肌膚水份散失、形成肌膚防水屏障、提升肌膚保濕因子的含量、提升肌膚聚角蛋白微絲或葡萄糖神經醯胺酶、增加玻尿酸含量、改善肌膚潤澤感、減少肌膚紋理、減少肌膚毛孔、改善肌膚平滑度與緊緻度、減少肌膚活性氧化物質含量以及降低肌膚產生發炎物質的含量。
如本文所用“槐花”是指植株-槐樹的花朵。
在一些實施例中，槐花萃取物可以提取自槐樹植株，槐樹的學名為
Sophora Japonica的花朵。在一些實施例中，花朵至少包括花瓣及花蕊。在一些實施例中，花朵包括花瓣、花蕊及花萼。
在一些實施例中，提取槐花萃取物所使用的槐花可以是新鮮的花朵、乾燥的花朵或是冷凍的花朵。在一些實施例中，乾燥可以是風乾、日曬乾燥、蔭乾或冷凍乾燥。
在一些實施例中，提取槐花萃取物所使用的槐花可為完整、或是經剁碎、切丁、碾磨、研磨或其他方式等改變原物料之大小及實體完整性的物理處理程序後的槐花。
在一些實施例中，槐花萃取物是經水萃步驟製得槐花萃取液。水萃步驟以水為溶劑，在特定溫度下經過特定時間進行萃取以製得槐花萃取液。在一些實施例中，特定溫度是指90℃~80℃之間。在一實施例中，特定溫度是85±5℃。在一實施例中，特定溫度是90℃。在一些實施例中，特定時間是指60分鐘到80分鐘。在一些實施例中，特定時間是指60分鐘。
在一些實施例中，水萃步驟中，水與槐花的重量比例為20~30：1。舉例而言，水：槐花為20：1。於此，若溶劑過少或特定時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若特定時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。
在一些實施例中，槐花萃取物是經水萃步驟與過濾步驟製得槐花萃取液。其中，過濾步驟是指將經水萃步驟後的槐花萃取物再以篩網或離心等方式進行過濾，藉以去除槐花萃取物內的固形物的步驟。舉例而言，將槐花萃取液以400網目（mesh）的篩網進行過濾以製得槐花萃取液。
在一些實施例中，槐花萃取物是經水萃步驟、過濾步驟與濃縮步驟製得槐花萃取液。其中，濃縮步驟是指將經水萃步驟或水萃步驟與過濾步驟後的槐花萃取物去除多餘的水份，藉以減少槐花萃取物的存放體積的步驟。舉例而言，可以採用濃縮機（廠牌/型號：BUCHI – Rotavapor R-100），在60℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為5時停止濃縮製得槐花萃取液。在另一些實施例中，可於50-82℃下進行減壓濃縮。
在一些實施例中，槐花萃取物有效使用量為2mL/天。
在一些實施例中，本發明提供一種槐花萃取物的用途，其是用於製備保濕組合物，槐花萃取物是以水提取槐樹
Sophora Japonica的花朵而得。
在一些實施例中，槐花萃取物用於避免肌膚水份散失。於此，所述水份散失的量測是使用兩端開放的圓柱形腔體在皮膚表面形成相對穩定的測試環境，通過測定不同兩點的水蒸氣壓梯度，計算出經表皮蒸發的水份量，以此來衡量肌膚表面水份流失情況。
在一些實施例中，槐花萃取物用於形成肌膚防水屏障。在一些實施例中，槐花萃取物是透過提升維持皮膚角質細胞結構相關基因表現量以達到提升肌膚保濕的效果。在一些實施例中，維持皮膚角質細胞結構相關基因包含角蛋白（keratin, KRT）基因。其中，角蛋白基因可為下列至少一者：角蛋白10（Keratin10）基因、角蛋白14（Keratin14）基因或其任意組合。後續簡稱為KRT10基因及KRT14基因。
角質層包含表皮角化細胞所產生之角蛋白（keratin）及聚角蛋白微絲（filaggrin）等蛋白質或脂質等各種物質。角質細胞雖然為死細胞，但其主要成分為角蛋白（keratin），角蛋白能吸收水份使皮膚保持濕潤，角質細胞也會分泌如玻尿酸等物質作為細胞間質，以維持表皮層皮膚屏障之結構完整，以防止皮膚水份散失及形成完整防護。當皮膚接觸過冷或過熱之環境以及照射紫外光等刺激，會導致角質細胞無法維持正常的代謝循環，且皮膚保水能力也會下降，並導致皮膚表皮層屏障受損，讓皮膚變得粗糙、乾燥脫屑、脆弱易受刺激、敏感泛紅，因此角質層的健康與保水能力對於抵禦外來傷害著實非常重要。
在一些實施例中，槐花萃取物用於提升肌膚保濕因子的含量。在一些實施例中，槐花萃取物是透過增加神經醯胺以達到提升肌膚保濕的效果。在一些實施例中，槐花萃取物是透過提升神經醯胺生成相關基因以達到提升肌膚保濕的效果。在一些實施例中，神經醯胺生成相關基因包含葡萄糖神經醯胺酶（glucosylceramidase,GBA）。葡萄糖神經醯胺酶是合成神經醯胺（ceramide）的酵素，神經醯胺存在於體內皮膚角質層細胞間脂質中，維持肌膚柔軟度與保水能力。
在一些實施例中，肌膚保濕因子包括聚角蛋白微絲（filaggrin）。角蛋白微絲經酵素分解後可形成皮膚上的天然保濕因子（NMF）， NMF能夠協助肌膚保有細胞中的水份。
在一些實施例中，槐花萃取物用於增加玻尿酸的含量。在一些實施例中，槐花萃取物係是透過提升玻尿酸合成相關基因表現量以達到提升肌膚保濕的效果。在一些實施例中，玻尿酸合成相關基因可為玻尿酸合成酶（hyaluronan synthase, HAS）基因。其中，玻尿酸合成酶基因包括玻尿酸合成酶2（Hyaluronan synthase 2,
HAS2）基因、玻尿酸合成酶3（Hyaluronan synthase 3,
HAS3）基因或其組合。後續簡稱為HAS2基因及HAS3基因。於此，玻尿酸也可稱為透明質酸。在一些實施例中，槐花萃取物用於改善肌膚潤澤感。
在一些實施例中，本發明提供一種槐花萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚老化的組合物，槐花萃取物是以水提取槐樹
Sophora Japonica的花朵而得。
在一些實施例中，槐花萃取物用於減少肌膚紋理。於此，所述肌膚紋理是以可見光拍攝高解析度之肌膚圖像，並以電腦程式根據肌膚圖像的凹陷與凸起進行粗糙度分析。
在一些實施例中，槐花萃取物用於減少肌膚毛孔。於此，所述肌膚毛孔是以可見光拍攝高解析度之肌膚圖像，並以電腦程式根據肌膚圖像上的較粗大的毛孔數量進行計算。
在一些實施例中，槐花萃取物用於改善肌膚平滑度與緊緻度。
在一些實施例中，槐花萃取物用於減少肌膚活性氧化物質的含量。
在一些實施例中，本發明提供一種槐花萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚發炎的組合物，槐花萃取物是以水提取槐樹
Sophora Japonica的花朵而得。
在一些實施例中，槐花萃取物用於降低肌膚產生發炎物質的含量。
在一些實施例中，前述之組合物可為保健品。在一些實施例中，前述之組合物可為非醫療目的的保健品。換言之，此保健品包含有效使用量的槐花萃取物。
在一些實施例中，前述之保健組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）以及類似之物。
在一些實施例中，前述之保健組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）以及類似之物。在一些實施例中，該保健組合物可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，保健組合物可進一步包含有被廣泛地使用於食品製造技術之食品可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，食品上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，食品上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之保健組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，前述之保健組合物可為非醫療目的的可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物（food additive），意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。
在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
範例一：槐花萃取物的製備
首先，採用中國生產的乾燥槐花（學名：
Sophora Japonica），其取自槐樹的花朵，花朵包括花瓣、花蕊及花萼。
接著進行水萃步驟，以水為溶劑，將水加熱達到85±5℃（即特定溫度）之後，投入槐花。其中，槐花與水以1：20的重量比例。意即，將槐花與水混合後維持85±5℃下萃取60分鐘（即特定時間）後得到初萃液。
後續，進行過濾步驟，待初萃液冷卻至室溫後，再將初萃液以400網目的篩網過篩後取其濾液。
最後，進行濃縮步驟，取上述濾液，利用濃縮機（廠牌/型號：BUCHI – Rotavapor R-100），在設定溫度60℃±5℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為5±0.5時停止濃縮，即為槐花萃取物。
範例二：槐花萃取物對促進角蛋白相關基因表現測試
材料與儀器：
細胞株：人類初代皮膚角質細胞（Human primary epidermal keratinocytes），購自ATCC，細胞編號PCS-200-011，以下簡稱HPEK-50細胞。
培養基：角質細胞專用之無血清培養基（Keratinocyte-SFM），購自Thermo，產品編號17005042。
RNA萃取試劑套組，購自Genemark公司。
SuperScript® III反轉錄酶，購自Invitrogene公司，產品編號18080-044。
ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司。
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit，購自KAPA Biosystems公司，產品編號KK4600。
測試流程：
將HPEK-50細胞以每孔1×10
5個的密度，接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中，並在37℃下培養24小時。
於培養後，將HPEK-50細胞分為以下二組：空白組、實驗組。其中，空白組的培養液不含任何萃取物，實驗組的培養液含有0.03125 mg/mL的範例一製得的槐花萃取物。各組進行三重複，並於37℃下，培養24小時。
移除培養後的空白組、實驗組的培養液，並以PBS進行潤洗。
於潤洗後，以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破開各組的HPEK-50細胞的細胞膜，以形成細胞溶液。
使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA作為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
使用ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit及表1的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察空白組及實驗組的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線（melting curve）。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈。
使用2
- ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2
- ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct
實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct
GAPDH △△Ct= △Ct
實驗組之目標基因- △Ct
空白組之目標基因倍數變化 = 2
- ΔΔ Ct 平均值
表1
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| KRT10-F | SEQ ID NO:1 | TCCTACTTGGACAAAGTTCGGG |
| KRT10-R | SEQ ID NO:2 | CCCCTGATGTGAGTTGCCA |
| KRT14-F | SEQ ID NO:3 | TTCTGAACGAGATGCGTGAC |
| KRT14-R | SEQ ID NO:4 | GCAGCTCAATCTCCAGGTTC |
空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。（圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
測試結果請參閱圖1。在空白組的HPEK-50細胞並未經過任何處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組，KRT10基因實驗組（槐花萃取物）的KRT10基因的表現量為18倍，而KRT14基因實驗組（槐花萃取物）的KRT14基因的表現量為5.18倍。
由此可知，槐花萃取物能明顯提升KRT10基因與KRT14基因的表現量，維持表皮層皮膚屏障之結構完整，促進肌膚形成防水屏障。
範例三：槐花萃取物對促進保濕相關基因表現測試
材料與儀器：
細胞株：人類初代皮膚角質細胞（Human primary epidermal keratinocytes），購自ATCC，細胞編號PCS-200-011，以下簡稱HPEK-50細胞。
培養基：角質細胞專用之無血清培養基（Keratinocyte-SFM），購自Thermo，產品編號17005042。
RNA萃取試劑套組，購自Genemark公司。
SuperScript® III反轉錄酶，購自Invitrogene公司，產品編號18080-044。
ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司。
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit，購自KAPA Biosystems公司，產品編號KK4600。
測試流程：
將HPEK-50細胞以每孔1×10
5個的密度，接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中，並在37℃下培養24小時。
於培養後，將HPEK-50細胞分為以下二組：空白組、實驗組。其中，空白組的培養液不含任何萃取物，實驗組的培養液含有0.03125 mg/mL的範例一製得的槐花萃取物。各組進行三重複，並於37℃下，培養24小時。
移除培養後的空白組、實驗組的培養液，並以PBS進行潤洗。
於潤洗後，以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破各組的HPEK-50細胞的細胞膜，以形成細胞溶液。
使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA作為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit及表2的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察空白組及實驗組的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線（melting curve）。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈。
使用2
- ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2
- ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct
實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct
GAPDH △△Ct= △Ct
實驗組之目標基因- △Ct
空白組之目標基因倍數變化 = 2
- ΔΔ Ct 平均值
表2
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| GBA-F | SEQ ID NO:5 | TCCAGTTGCACAACTTCAGC |
| GBA-R | SEQ ID NO:6 | TTGTGCTCAGCATAGGCATC |
| FLG-F | SEQ ID NO:7 | GGCAAATCCTGAAGAATCCA |
| FLG-R | SEQ ID NO:8 | TGCTTTCTGTGCTTGTGTCC |
空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。（圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
測試結果請參閱圖2。在空白組的HPEK-50細胞並未經過任何處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組，FLG基因實驗組（槐花萃取物）的FLG基因的表現量為4.73倍，而GBA基因實驗組（槐花萃取物）的GBA基因的表現量為32.45倍。
由此可知，槐花萃取物能明顯提升FLG基因與GBA基因的表現量，藉以達到提升肌膚保濕維持肌膚保水能力的效果。
範例四：槐花萃取物對促進玻尿酸相關基因表現測試
材料與儀器：
細胞株：人類初代皮膚角質細胞（Human primary epidermal keratinocytes），購自ATCC，細胞編號PCS-200-011，以下簡稱HPEK-50細胞。
培養基：角質細胞專用之無血清培養基（Keratinocyte-SFM），購自Thermo，產品編號17005042。
RNA萃取試劑套組，購自Genemark公司。
SuperScript® III反轉錄酶，購自Invitrogene公司，產品編號18080-044。
ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司。
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit，購自KAPA Biosystems公司，產品編號KK4600。
測試流程：
將HPEK-50細胞以每孔1×10
5個的密度，接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中，並在37℃下培養24小時。
於培養後，將HPEK-50細胞分為以下二組：空白組、實驗組。其中，空白組的培養液不含任何萃取物，實驗組的培養液含有0.03125 mg/mL的範例一製得的槐花萃取物。各組進行三重複，並於37℃下，培養24小時。
移除培養後的空白組、實驗組的培養液，並以PBS進行潤洗。
於潤洗後，以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破開各組的HPEK-50細胞的細胞膜，以形成細胞溶液。
使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA作為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit及表3的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察空白組及實驗組的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線（melting curve）。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈。
使用2
- ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2
- ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct
實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct
GAPDH △△Ct= △Ct
實驗組之目標基因- △Ct
空白組之目標基因倍數變化 = 2
- ΔΔ Ct 平均值
表3
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| HAS2-F | SEQ ID NO:9 | AAGAACAACTTCCACGAAAAGGG |
| HAS2-R | SEQ ID NO:10 | GGCTGGGTCAAGCATAGTGT |
| HAS3-F | SEQ ID NO:11 | CGCAGCAACTTCCATGAGG |
| HAS3-R | SEQ ID NO:12 | AGTCGCACACCTGGATGTAGT |
空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。（圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
測試結果請參閱圖3。在空白組的HPEK-50細胞並未經過任何處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組，HAS2基因實驗組（槐花萃取物）的HAS2基因的表現量為96.66倍，而HAS3基因實驗組（槐花萃取物）的HAS3基因的表現量為10.33倍。
由此可知，槐花萃取物能明顯提升HAS2基因與HAS3基因的表現量，藉以提升肌膚玻尿酸含量。
範例五：槐花萃取物對減少活性氧物質（
ROS
）生成的測試
於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀，測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經槐花萃取物處理後，其活性氧物質含量的變化。
材料與儀器：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk，取自生物資源保存及研究中心（BCRC）；Cat. 60153 ，以下簡稱CCD-966sk細胞。
細胞培養基：含有10 vol% FBS（購自Gibco，Cat.10437028）之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號11095080）額外添加成分使其含有1% 青霉素-鏈霉素（購自Gibco，Cat.15140122）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，Cat.11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，Cat.S5761-500G）及0.1 mM非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，Cat.11140050）所配製而成。
磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯（2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883，購自Sigma）溶於二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，產品編號SI-D6883-50MG）以配製成5 mg/ml 的DCFH-DA溶液。
流式細胞儀（Flow cytometry），BD Accuri C6 Plus
雙氧水（H
2O
2）：購自Sigma-Aldrich，產品型號95299-1L。
胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。
測試流程：
將 CCD-966Sk 細胞以2×10
5cells/well的密度種入6孔細胞培養盤，添加培養液體積為2 ml/well，於 CO
2培養箱中培養24小時。
待細胞貼附後，將細胞分為實驗組、空白組以及對照組。
各組加入2 mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37℃下培養1小時。
於此，實驗組的實驗培養基為添加有0.03125 mg/mL的範例一製得的槐花萃取物之2 mL細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的2 mL細胞培養基（即不含槐花萃取物）。對照組的實驗培養基為單純的2 mL細胞培養基（即不含槐花萃取物）。
添加濃度為5 μg/mL的DCFH-DA溶液2 μL於各組細胞培養基，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。
於DCFH-DA處理後，於實驗組的實驗培養基以及對照組的實驗培養基分別加入雙氧水（H
2O
2），並於37℃下反應1小時。具體來說，35% wt的雙氧水先稀釋成100 mM（將10 μL的雙氧水加入990 μL的二次蒸餾水），再取20 μL的100 mM的雙氧水加入 2 mL的細胞培養盤中。
反應後，每孔以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
將200 μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6 mL細胞培養基終止反應。
將各組細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL離心管內，並將含有細胞與培養基之離心管以400 xg離心10分鐘。
離心後，移除上清液，並以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物。
再以400 xg離心10分鐘。
離心後，移除上清液，於暗處以1 mL的1X PBS溶液再次懸浮細胞，以得到待測細胞液。
使用流式細胞儀偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490 nm，放射波長為510-550 nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH（二氯二氫螢光素），再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF（二氯螢光素），經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以取得平均值，然後以空白組的平均值為1之相對ROS的生成量，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖4所示。
由比較空白組、對照組的結果可知，在經過雙氧水處理後，相對ROS的生成量（高螢光表現）會大幅增加（約6.5倍）；其顯示雙氧水處理確實會導致細胞內產生活性氧化物質，進而對皮膚纖維母細胞產生後續傷害。另一方面，根據比較對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過槐花萃取物處理後，相對ROS的生成量明顯由649.5%減少到447.5%（達統計上之顯著，p值小於0.001）。
如此可知，槐花萃取物可有效減少活性氧化物質在細胞內的產生或累積。換言之，槐花萃取物可作為一種活性氧化物質清除劑。亦即，槐花萃取物可透過降低細胞內活性氧化物質含量，減少細胞受到活性氧化物質等所導致的氧化傷害。
範例六：槐花萃取物對促進超氧化物歧化酶（
superoxide dismutase, SOD
）活性上的測試
已知SOD可催化超氧化物並降低自由基含量，於此，藉由檢視細胞中SOD含量而得知細胞抗氧化能力。
材料與儀器：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞購自台灣生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，編號BCRC 60153，後續簡稱皮膚纖維細胞。
細胞培養基：添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、0.1 mM非必需胺基酸、1.5 g/L碳酸氫鈉(Sigma公司，編號 S5761，美國)、1 mM丙酮酸鈉(GIBCO公司，編號11360-070，美國)的最低必需培養液(Minimum essential medium, MEM)(Eagle)(配於厄爾平衡鹽溶液(Earle's Balanced Salt Solution, Earle's BSS))(GIBCO公司，編號41500-034，美國)。
雙氧水（H
2O
2）：購自Sigma-Aldrich，產品型號95299-1L。
胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。
磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
測試流程：
在含有2 mL上述細胞培養基的6孔培養盤中每個孔接種2 × 10
5個皮膚纖維細胞，然後於37℃培養隔夜。
在移除細胞培養基之後，將細胞分成空白組及實驗組。
各組加入2 mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37℃下培養6小時。
於此，實驗組的實驗培養基為添加有0.03125 mg/mL的範例一製得的槐花萃取物及1 mM H
2O
2的2 mL細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的2 mL細胞培養基（即不含槐花萃取物）。
之後，移除培養基並以1X PBS清洗1次，然後加入胰蛋白酶來處理細胞三分鐘，繼而用細胞培養基停止胰蛋白酶活性並轉移至1.5 mL離心管中。
接著，以300xg離心5分鐘，然後以PBS清洗，接而以300xg離心5分鐘。之後，加入30μL之1X細胞裂解緩衝液，然後將細胞懸浮液在冰上反應30分鐘， 每10分鐘渦旋(vortex)混合。接著，將破碎的細胞懸浮液在4℃以10,000xg離心10分鐘以除去不溶物質，然後將25μL的1X SOD緩衝液加入活性對照孔的底部。之後，添加25μL製備的SOD標準品(S1~S7，參見表4)。
表4
| 1X SOD溶液 | ||
| S1 | 248 | 2 μL的SOD標準品 |
| S2 | 100 | 100 S1 |
| S3 | 150 | 100 S2 |
| S4 | 100 | 100 S3 |
| S5 | 100 | 100 S4 |
| S6 | 150 | 100 S5 |
| S7 | 100 | 100 S6 |
之後，將25 μL的樣品加入適當孔的底部，然後對每孔添加150 μL的Master Mix。接著，使用多道移液器(multichannel pipet)向所有孔中加入25 μL之1X黃嘌呤溶液(Xanthine solution)以起始反應，然後立即將培養盤轉移至微量滴定盤讀取儀(microtiter plate reader)，並在室溫下每分鐘以450 nm讀取吸光值，持續10分鐘，其結果顯示於圖5。
在與空白組比較下，依統計學的學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。
請參閱圖5。空白組未以H
2O
2刺激也未使用樣本進行處理，因此空白組的試驗結果代表皮膚纖維細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的SOD量為100%的情況下，實驗組的相對SOD量為122.1%。也就是說，相對於空白組，實驗組的皮膚纖維細胞經由H
2O
2刺激以及使用槐花萃取物進行處理後，其相對SOD量仍能提升22.1%。
可知，槐花萃取物能降低皮膚纖維細胞的自由基含量，達到協助皮膚抗氧化的用途。
範例七：槐花萃取物對促進
IL-8
分泌量的測試
在許多生物體內，在受到環境刺激因子（例如：UVB）的刺激下，會釋放出IL-8，並引發發炎反應，因此透過IL-8的檢測，可間接地評估發炎狀態。
材料與儀器：
細胞株：人類初代皮膚角質細胞（Human primary epidermal keratinocytes），購自ATCC，細胞編號PCS-200-011，以下簡稱HPEK-50細胞。
細胞培養基：角質細胞專用之無血清培養基（Keratinocyte-SFM），購自Gibco，產品編號10724-011。
檢測套組：ELISA Kit for Interleukin 8（IL8），購自Cloud-Clone Corp.，產品編號SEA080Hu。
檢測儀器：酵素免疫分析儀（ELISA reader），購自BioTek公司（美國）。
測試流程：
將HPEK-50細胞以每孔5×10
4個的密度接種於每孔含500 μL的細胞培養基的24孔培養盤中，並在37℃下培養24小時。於此，HPEK-50細胞分為三個試驗組別，其分別為：空白組、對照組與實驗組。各組進行三重複（意即各組各有三孔）。
培養24小時後，將各組更換為500 μL的實驗培養基，並於37℃下繼續培養2小時。其中，空白組及對照組的實驗培養基為不含樣本的細胞培養基，而實驗組的實驗培養基為含有0.03125 mg/mL的範例一製得的槐花萃取物的細胞培養基。
對照組與實驗組的HPEK-50細胞於紫外線輻射箱中於UVB（紫外光，照射能量為300 mJ）照射4.99分鐘且於37℃下繼續培養24小時。空白組的HPEK-50細胞則不施予UVB照射直接於37℃下繼續培養24小時。
將培養後的各組於每孔中取出120 μL的實驗培養基，並使用ELISA Kit for Interleukin 8（IL8）測定各組HPEK-50細胞的IL-8分泌量。於此，依照ELISA Kit for Interleukin 8（IL8）所提供的試驗流程處理各組取出的實驗培養基後，利用酵素免疫分析儀測量每孔450 nm的吸光值（OD450值）。
測試結果：
所有組別的相對IL-8分泌量係依下列公式計算：相對IL-8分泌量（%）=（各組OD450值/空白組OD450值）×100%。
在與對照組比較下，其他各組的相對IL-8分泌量的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。
請參閱圖6。空白組未以UVB刺激也未使用樣本進行處理，因此空白組的試驗結果代表HPEK-50細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對IL-8分泌量為100%的情況下，對照組的相對IL-8分泌量為117.21%，而實驗組的相對IL-8分泌量為86.71%。也就是說，相對於空白組，對照組的HPEK-50細胞經由UVB刺激後，其相對IL-8分泌量顯著提升約17.21%；而相對於空白組，實驗組的HPEK-50細胞經由UVB刺激以及使用槐花萃取物進行處理後，其相對IL-8分泌量降低約30.5%。
由上述結果可知，槐花萃取物能明顯地降低HPEK-50細胞經由UVB刺激後所提升的IL-8分泌量，還降低到遠低於HPEK-50細胞在正常的生理代謝情況下所產生的IL-8分泌量。換言之，槐花萃取物能明顯抑制角質細胞分泌IL-8，進而降低角質細胞的發炎狀態。
因此，槐花萃取物能夠降低及/或抑制發炎狀態，並且能夠降低及/或抑制角質細胞發炎。槐花萃取物亦能夠降低及/或抑制受外在環境刺激所導致的發炎，進而能夠降低/抑制肌膚發炎所致的痘痘（痤瘡）。換言之，槐花萃取物具有抗發炎的作用。
範例八：槐花萃取物的人體測試
受試者：11位受試者（受試者為自述肌膚乾燥者）。其中，各受試者為年滿20歲之成年人。
測試項目：肌膚紋理、肌膚毛孔量、經皮水份散失TEWL值以及膚況問卷調查。
其中，肌膚紋理（Texture）是使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀對受試者的面部肌膚進行檢測。其原理乃以可見光拍攝高解析度之肌膚影像，並以內建軟體根據皮膚的凹陷與凸起進行粗糙度分析以得到肌膚紋理數值。肌膚紋理測量數值越高，說明皮膚越粗糙。於量測後，將空白組的肌膚紋理表現量作為基準（即空白組的之皮膚肌膚紋理的相對表現率為100%），計算實驗組的皮膚肌膚紋理的相對表現率（%）。
其中，肌膚毛孔量是採用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀，其係透過高解析度之相機鏡頭對受試者的面部肌膚進行各組毛孔表現量的量測。藉由標準白光照射，造成面部毛孔凹陷處產生陰影，毛孔會比周圍的膚色更黑，故可以藉此偵測毛孔數量及其面積。再利用軟體根據毛孔數目、面積分析得到數值化的毛孔表現量，數值越高則顯示其毛孔數較多量、面積較大。於量測後，將空白組的毛孔表現量作為基準（即空白組的之皮膚上毛孔的相對表現率為100%），計算實驗組的皮膚上毛孔的相對表現率（%）。
其中，經皮水份散失（Trans-Epidermal Water Loss, TEWL）是使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚水份散失檢測探頭Tewameter® TM 300 （C+K Multi Probe Adapter System, Germany） 對受試者的面部肌膚進行檢測。該檢測探頭係使用兩端開放的圓柱形腔體在皮膚表面形成相對穩定的測試環境，通過測定不同兩點的水蒸氣壓梯度，計算出經表皮蒸發的水份量，以此來衡量皮膚表面水份流失情況。
其中，膚況問卷調查為針對皮膚平滑度、皮膚緊緻度及皮膚潤澤度三個項目進行自我評估，並以1至10分為評量標準，10分為最佳。再針對肌膚有感保濕、肌膚較平滑細緻、整體膚況較穩定進行自我評比，分別在普通、同意、非常同意三個選項中進行選擇。
測試方式：
令11位實驗組受試者每日食用包括2mL的範例一所製得的槐花水萃物連續食用4周。
於食用前（即第0周）所測得的數據稱為空白組，食用4周後（即第4周）所測得的數據稱為實驗組。
測試結果：
下面圖式中顯示的以所有受試者的平均值，並以第0周的數據為基礎視為100%，換算得各組別相對值。其中，使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異，以得到其p值。並且，於圖中，以「*」是指其p值小於0.05。
請參閱圖7。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者的平均肌膚紋理從第0週的100%（空白組）減少到89.7%（實驗組）。
請參閱圖8。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者的平均肌膚毛孔量從第0週的100%（空白組）減少到92.6%（實驗組）。
請參閱圖9。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者的平均經皮水份散失TEWL值從第0週的100%（空白組）減少到91.7%（實驗組）。
參考圖10。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者對於皮膚平滑度的自我評分，由第0週的（空白組）的平均5.9分提升到平均7.3分（實驗組）。
續參考圖10。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者對於皮膚緊緻度的自我評分，由第0週的（空白組）的平均5.9分提升到平均7.2分（實驗組）。
續參考圖10。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者對於皮膚潤澤度的自我評分，由第0週的（空白組）的平均6.2分提升到平均7.4分（實驗組）。換言之，受試者感覺皮膚更平滑度、皮膚更緊緻度及皮膚更潤澤度。
參考圖11。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者對於肌膚有感保濕的自我評比，有91%的人非常同意相較於最初狀態（第0週）的肌膚能感受到更為保濕。
續參考圖11。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者對於肌膚較為平滑細緻的自我評比，有55%的人非常同意相較於最初狀態（第0週）的肌膚更為平滑細緻，有18%的人同意相較於最初狀態（第0週）的肌膚更為平滑細緻。
續參考圖11。經過4周的每日服用槐花萃取物後，11位實驗組受試者對於整體膚況較穩定的自我評比，有64%的人非常同意相較於最初狀態（第0週）的整體肌膚狀態更佳，有18%的人同意相較於最初狀態（第0週）的整體肌膚狀態更佳。換言之，受試者平均有70%以上都感覺皮膚狀況得到明顯的改善。
綜上所述，任一實施例的槐花萃取物可用以製備保濕的組合物或是抗老的組合物。在一些實施例中，槐花萃取物可具有下列至少一種作用：避免肌膚水份散失、形成肌膚防水屏障、提升肌膚保濕因子的含量、提升肌膚聚角蛋白微絲或葡萄糖神經醯胺酶、增加玻尿酸含量、改善肌膚潤澤感、減少肌膚紋理、減少肌膚毛孔、改善肌膚平滑度與緊緻度、減少肌膚活性氧化物質含量以及降低肌膚產生發炎物質的含量。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是一實施例的槐花萃取物促進角蛋白相關基因表現圖。
圖2是一實施例的槐花萃取物促進保濕因子相關基因表現圖。
圖3是一實施例的槐花萃取物促進玻尿酸合成相關基因表現圖。
圖4是一實施例的槐花萃取物減少ROS含量結果圖。
圖5是一實施例的槐花萃取物提升SOD含量結果圖。
圖6是一實施例的槐花萃取物IL-8分泌量測試結果圖。
圖7是人體測試的平均肌膚紋理測試結果圖。
圖8是人體測試的平均肌膚毛孔量測試結果圖。
圖9是人體測試的平均經皮水份散失TEWL值測試結果圖。
圖10是人體測試問卷平均分數結果圖。
圖11是人體測試問卷結果分佈圓餅圖。
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Claims (15)
- 一種槐花萃取物的用途，其是用於製備保濕組合物，該槐花萃取物是以水提取槐樹的花朵而得。
- 如請求項1所述的用途，其中該槐花萃取物用於避免肌膚水份散失。
- 如請求項2所述的用途，其中該槐花萃取物用於形成肌膚防水屏障。
- 如請求項2所述的用途，其中該槐花萃取物用於提升肌膚保濕因子的含量。
- 如請求項4所述的用途，其中該肌膚保濕因子包括聚角蛋白微絲（filaggrin）。
- 如請求項4所述的用途，其中該肌膚保濕因子包括葡萄糖神經醯胺酶（Glucosylceramidase，GBA）。
- 如請求項2所述的用途，其中該槐花萃取物用於增加玻尿酸的含量。
- 如請求項1所述的用途，其中該槐花萃取物用於改善肌膚潤澤感。
- 一種槐花萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚老化的組合物，該槐花萃取物是以水提取槐樹的花朵而得。
- 如請求項9所述的用途，其中該槐花萃取物用於減少肌膚紋理。
- 如請求項9所述的用途，其中該槐花萃取物用於減少肌膚毛孔。
- 如請求項9所述的用途，其中該槐花萃取物用於改善肌膚平滑度與緊緻度。
- 如請求項9所述的用途，其中該槐花萃取物用於減少肌膚活性氧化物質的含量。
- 一種槐花萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚發炎的組合物，該槐花萃取物是以水提取槐樹的花朵而得。
- 如請求項14所述的用途，其中該槐花萃取物用於降低肌膚產生發炎物質的含量。
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