TW202402265A - 黑鑽蘋果萃取物用於製備調理肌膚狀態組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

一種黑鑽蘋果萃取物的用途，其是用於製備調理肌膚狀態組合物，其中黑鑽蘋萃取物是以水為溶劑提取自蘋果 Malus pumila的果實而得。

Description

黑鑽蘋果萃取物用於製備調理肌膚狀態組合物的用途
本發明涉及一種黑鑽蘋果萃取物，特別是關於黑鑽蘋果萃取物用於製備改善肌膚狀態的組合物的用途。
黑鑽蘋果演化自海拔3100公尺的西藏林芝市，由於日間高強度紫外線照射，以及晝夜溫差大的特殊溫度變化，這導致蘋果變種以適應此地區氣候的過度變化。黑鑽蘋果變種適應了這些外部環境的巨大變化並變種出其獨特的外觀顏色。
黑鑽蘋果變種的外表面由紅轉為紫黑色，其活性成分也產生變化。有鑑於此，為了開發黑鑽蘋果更多層面的應用，故而提出一種黑鑽蘋果萃取物用於製備調理肌膚狀態的組合物的用途。
在一些實施例中，本發明提供一種黑鑽蘋果萃取物的用途，其是用於製備調理肌膚狀態組合物，黑鑽蘋果萃取物是以水提取蘋果植株 Malus pumila的全果實而得。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進肌膚細胞粒線體活性。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進皮膚纖維細胞增生。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進皮膚傷口癒合。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進皮膚膠原蛋白含量提升。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進皮膚彈力蛋白含量提升。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進皮膚玻尿酸含量提升。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於減少皮膚皺紋量。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於提升皮膚含水量。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物為食品組合物，且食品組合物內至少包含黑鑽蘋果萃取物3克/日。
綜上所述，任一實施例的黑鑽蘋果萃取物可用以製備調理肌膚狀態的組合物。在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物可具有下列至少一種作用：促進肌膚細胞粒線體活性、促進皮膚纖維細胞增生、促進皮膚傷口癒合、促進皮膚膠原蛋白含量提升、促進皮膚彈力蛋白含量提升、促進皮膚玻尿酸含量提升、減少皮膚皺紋量、提升皮膚含水量。
如本文所用「黑鑽蘋果」是指產自海拔3000公尺的蘋果植株的果實，果實外觀呈現明顯的深紫至黑色，蘋果植株的學名為 Malus pumila。
在一些實施例中，果實為全果實。在一些實施例中，全果實包括果皮、果肉、果核(子房壁)及種子。
在一些實施例中，提取黑鑽蘋果萃取物所使用的黑鑽蘋果可以是新鮮的黑鑽蘋果、乾燥的黑鑽蘋果或是冷凍的黑鑽蘋果。在一些實施例中，乾燥可以是風乾、日曬乾燥、蔭乾或冷凍乾燥。
在一些實施例中，提取黑鑽蘋果萃取物所使用的黑鑽蘋果可為完整、或是經剁碎、切丁、切片、碾磨、研磨或其他方式等改變原物料之大小及實體完整性的物理處理程序後的黑鑽蘋果。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物是經水萃步驟製得黑鑽蘋果萃取液。水萃步驟以水為溶劑，在特定溫度下經過特定時間進行萃取以製得黑鑽蘋果萃取液。在一些實施例中，特定溫度是指90℃~80℃之間。在一實施例中，特定溫度是85±5℃。在一實施例中，特定溫度是85℃。在一些實施例中，特定時間是指60分鐘到80分鐘。在一些實施例中，特定時間是指60分鐘。
在一些實施例中，水萃步驟中，水與黑鑽蘋果的重量比例為15~5：1。舉例而言，水：黑鑽蘋果為10：1。於此，若溶劑過少或特定時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若特定時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物是經水萃步驟與過濾步驟製得黑鑽蘋果萃取液。其中，過濾步驟是指將經水萃步驟後的黑鑽蘋果萃取物再以篩網或離心等方式進行過濾，藉以去除黑鑽蘋果萃取物內的固形物的步驟。舉例而言，將黑鑽蘋果萃取液以400網目（mesh）的篩網進行過濾以製得黑鑽蘋果萃取液。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物是經水萃步驟、過濾步驟與濃縮步驟製得黑鑽蘋果萃取液。其中，濃縮步驟是指將經水萃步驟或水萃步驟與過濾步驟後的黑鑽蘋果萃取物去除多餘的水份，藉以減少黑鑽蘋果萃取物的存放體積的步驟。舉例而言，可以採用濃縮機（廠牌/型號：BUCHI – Rotavapor R-100），在60℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為10±0.5時停止濃縮製得黑鑽蘋果萃取液。在另一些實施例中，可於50~82℃下進行減壓濃縮。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物是經水萃步驟、過濾步驟、濃縮步驟與調整步驟製得黑鑽蘋果萃取液。其中，調整步驟是指添加蘋果酸將黑鑽蘋果萃取物調整到pH 2.7±1.0的步驟。在一些實施例中，蘋果酸是DL-蘋果酸(羥基丁二酸)。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物有效使用量為3克/天。
在一些實施例中，本發明提供一種黑鑽蘋果萃取物的用途，其是用於製備調理肌膚狀態組合物。於此，調理肌膚狀態是指促進肌膚細胞粒線體活性、促進皮膚纖維細胞增生、促進皮膚傷口癒合、促進皮膚膠原蛋白含量提升、促進皮膚彈力蛋白含量提升、促進皮膚玻尿酸含量提升、減少皮膚皺紋量、提升皮膚含水量其中至少一種。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進肌膚細胞粒線體活性。於此，以JC-1聚集能力作為粒線體活性之指標，在膜電位正常的健康粒線體中，JC-1以多聚體(polymer)形式存在，而當粒線體膜電位降低時，JC-1會變成單體(monomer)，其可當作粒線體活性評估的指標。粒線體為細胞的能量製造工廠，粒線體活性會受到外在環境傷害而下降，例如若肌膚長期受到UV光照射會導致粒線體DNA突變而降低其活性，如能促進粒線體活性則可以提升細胞代謝率與生長率，進而修復皮膚。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進皮膚纖維細胞增生。於此，皮膚纖維母細胞的增生則有利於維持表皮的厚度及紫外線屏障功能，亦可補充皮膚細胞外基質中的組成及維持真皮的更新。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於減少皮膚皺紋量。於此，所述皮膚皺紋量的量測是以可見光(白光)拍攝高解析度之肌膚圖像，並以軟體根據皺紋之長度與深度進行分析計算而得。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於提升皮膚含水量。於此，所述皮膚含水量的量測基於電容的原理進行測量。當水分含量發生變化時，皮膚的電容值亦發生變化，故可通過測定皮膚電容值，分析皮膚表面的含水量。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於促進皮膚彈力蛋白含量提升。在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物是透過促進彈力蛋白合成相關基因表現量以達到提升彈力蛋白量的效果。在一些實施例中，彈力蛋白合成相關基因包含彈力蛋白(Elastin,ELN)基因和人類纖維母細胞原纖維蛋白質（Fibrillin-1，FBN1）基因。
ELN基因為彈力蛋白(Elastin,ELN)的基因。其中，彈力蛋白(ELN蛋白)可與彈性蛋白結合。因此，透過觀察ELN基因的表現，可觀察蛋白質在肌膚的表現量。並且，當蛋白質的含量提高，皆有利於提高肌膚的彈性。
FBN1蛋白質是一種存在於細胞外基質的醣蛋白，會形成微絲使得締結組織具有彈性。當FBN1蛋白質在真皮層的表現減少時，會影響真皮層的微絲數量。並且，由於微絲會提供軌道主導彈性纖維的集合，因此當FBN1蛋白質的含量減少時，會影響彈性纖維的集合與合成，進而影響肌膚彈性。
在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於增加玻尿酸的含量。在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物係是透過提升玻尿酸合成相關基因表現量以達到提升肌膚保濕的效果。在一些實施例中，玻尿酸合成相關基因可為玻尿酸合成酶（hyaluronan synthase, HAS）基因。其中，玻尿酸合成酶基因包括玻尿酸合成酶2（Hyaluronan synthase 2, HAS2）基因、玻尿酸合成酶3（Hyaluronan synthase 3, HAS3）基因或其組合。後續簡稱為HAS2基因及HAS3基因。於此，玻尿酸也可稱為透明質酸。在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物用於改善肌膚潤澤感。
在一些實施例中，前述之組合物可為保健品或保健食品。在一些實施例中，前述之組合物是非醫療目的的保健品或保健食品，換言之，此保健品或保健食品包含有效使用量的黑鑽蘋果萃取物。
在一些實施例中，前述之保健組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）以及類似之物。
在一些實施例中，前述之保健組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）以及類似之物。在一些實施例中，該保健組合物可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，保健組合物可進一步包含有被廣泛地使用於食品製造技術之食品可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，食品上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，食品上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之保健組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物（food additive），意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。
在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
範例一：黑鑽蘋果萃取物的製備
首先，採用中國生產的切片風乾黑鑽蘋果的全果實為原料，全果實包括果皮、果肉、果核(子房壁)及種子。
接著進行水萃步驟，以水為溶劑，將水加熱達到85±5℃（即特定溫度）之後，投入黑鑽蘋果原料。其中，黑鑽蘋果原料與水以1：10的重量比例。意即，將黑鑽蘋果與水混合後維持85±5℃下萃取60分鐘（即特定時間）後得到初萃液。
後續，進行過濾步驟，待初萃液冷卻至室溫後，再將初萃液以400網目的篩網過篩後取其濾液。
之後，進行濃縮步驟，取上述濾液，利用濃縮機（廠牌/型號：BUCHI – Rotavapor R-100），在設定溫度60±5℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為10±0.5時停止濃縮得到濃縮液。
最後，進行調整步驟，取上述濃縮液添加適量的DL-蘋果酸調整到pH 2.7即為黑鑽蘋果萃取物。
範例二： 黑鑽蘋果萃取物促進 皮膚纖維細胞增生測試
本例以流式細胞儀評估人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經黑鑽蘋果萃取物處理後，其粒線體活性的變化。
所用材料與儀器，如下：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（後續簡稱皮膚纖維細胞，寄存編號BCRC 60153）。
細胞培養基：最低限度基本培養基（minimum essential medium，簡稱MEM培養基）(購自Gibco，產品編號11095080）額外添加成分使其含有10 vol% 胎牛血清(後續簡稱FBS)（購自Gibco，產品編號10437-028）、1% 青黴素-鏈黴素 (購自Gibco，產品編號15140122)、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，產品編號11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，產品編號S5761-500G）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，產品編號11140050）所配製而成。
磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco。
粒線體膜電位偵測套組（BDTM MitoScreen （JC-1） kit，型號551302）。其中，粒線體膜電位偵測套組具有JC-1染料（凍乾）及10X分析緩衝液。於使用前，以1X PBS將10X分析緩衝液稀釋10倍，以形成1X分析緩衝液。加入130 μL DMSO至JC-1染劑（凍乾）中，以形成JC-1儲備溶液。然後，再以1X分析緩衝液稀釋JC-1儲備溶液，以形成JC-1工作試劑（JC-1 working solution；即JC-1粒線體特異性染劑）。稀釋倍率為JC-1儲備溶液比1X分析緩衝液為1：100。
胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco，產品編號15400-054）。
流式細胞儀：購自BD Accuri公司。
CO 2培養箱：購自ASTEC，產品編號SCA-165DS。
測試流程：
測試將會分為實驗組以及空白組（未添加黑鑽蘋果萃取物的組別）二組進行，各組分別進行二重複試驗：
將皮膚纖維細胞以每孔1×10 5個的方式，接種於每孔含2 mL細胞培養基之6孔培養盤中於CO 2培養箱(環境含5%CO 2並且溫度為37℃)中培養24小時以待細胞貼附。
接著，將培養盤的各孔中的培養基更換成2 mL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基為含有1mg/mL的範例一製得的黑鑽蘋果萃取物的細胞培養基，空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含黑鑽蘋果萃取物）。
將培養盤置於CO 2培養箱中培養24小時(環境含5%CO 2並且溫度為37℃)。
移除培養盤中的實驗培養基並以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
將200 μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加細胞培養基終止反應。將各孔中之皮膚纖維細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL離心管內，並將含有皮膚纖維細胞與細胞培養基之離心管以400 xg離心5分鐘。
於離心後移除上清液，再以1X PBS溶液潤洗1次，再以400 xg離心5分鐘。
於離心後移除各離心管中的上清液並加入100 μL的JC-1工作試劑至各離心管並且充分混合後，在避光靜置15分鐘。
15分鐘後，將各離心管以400 xg離心5分鐘。
於離心後，移除各離心管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各試管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。
於離心後，移除各離心管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各離心管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。
於離心後，移除各離心管中的上清液、以500 μL的添加有2%FBS的1X PBS重新懸浮細胞，以得到待測細胞液。
以流式細胞儀量(設定激發光：488 nm；散射光：527 nm & 590 nm)測各孔的待檢測皮膚纖維細胞液中細胞粒線體的膜電位，以進行粒線體活性分析。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之結果平均以得平均值，然後以空白組的平均值為100%之相對JC-1聚集量，將實驗組的平均值換算為相對JC-1聚集量，如圖1所示。
於此，空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。（圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
參閱圖1，其為經黑鑽蘋果萃取物處理之實驗組與未經處理之空白組之JC-1聚集相對量比較長條圖。可知，在空白組的皮膚纖維細胞並未經過任何處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其粒線體活性為100%。相對於空白組，實驗組之相對JC-1聚集量約為176.05%。換言之，與空白組相較之下，實驗組的皮膚纖維細胞的粒線體活性提升76.05%。顯示黑鑽蘋果萃取物可提升皮膚纖維細胞之粒線體活性，而達到提升皮膚纖維細胞活性之效果。
範例三： 黑鑽蘋果萃取物 促進皮膚纖維細胞增生測試
本例以酵素免疫分析儀(ELISA reader)評估人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經黑鑽蘋果萃取物處理後，其細胞數量的變化。
所用材料與儀器，如下：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞(human fibroblast cells，CCD-996SK)（後續簡稱皮膚纖維細胞，寄存編號BCRC 60153）。
細胞培養基：最低限度基本培養基（minimum essential medium，簡稱MEM培養基）(購自Gibco，產品編號11095080）額外添加成分使其含有10 vol% 胎牛血清(後續簡稱FBS)（購自Gibco，產品編號10437-028）、1% 青黴素-鏈黴素 (購自Gibco，產品編號15140122)、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，產品編號11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，產品編號S5761-500G）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，產品編號11140050）所配製而成。
細胞增殖酵素結合免疫吸附分析法相關試劑(購自羅氏Roche，型號11647229001)，包括：濃度10µM的溴化去氧尿苷試劑(Bromodeoxyuridine,後續稱BrdU試劑)、細胞固定溶液（FixDenat）、1XPBS緩衝液、抗BrdU-POD工作溶液（又稱抗體偶聯物 antibody conjugate）。
測試流程：
以每孔3000個細胞殖入96孔盤，並於37℃下培育2小時後，將細胞分為三組，分別為空白組、陽性對照組及實驗組。每孔添加10µL的BrdU試劑和1mg/mL的測試樣品後，培養24小時得到各組培養液。
其中，空白組不添加任何測試樣品，實驗組添加有1mg/mL範例一所製得的黑鑽蘋果萃取物，陽性對照組添加10%的胎牛血清。
各組培養液去除上清液後，加入200µL的細胞固定溶液，室溫下處理30分鐘。
去除細胞固定溶液後，使用1XPBS洗滌一次。接著加入每孔100µL的抗BrdU-POD工作溶液，室溫下處理90分鐘。
之後，去除抗BrdU-POD工作溶液後，使用200到300µL的洗滌液充份沖洗三次後，去除洗滌液再加入100µL的底物溶液（substrate solution），室溫下處理15分鐘。
接者，每孔加入25µL的1M的H 2SO 4並處理10分鐘，之後在300rpm的振動器上振動1分鐘。
最終，並於450nm的波長下以ELISA讀取儀讀取各孔的吸光值（OD450nm）。經過吸光值的比較換算並乘回稀釋倍數，在設定空白組的細胞數量為100%時，換算實驗組的細胞數量，結果如圖2所示。
於此，所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖2所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
請參閱圖2。相較於空白組（即其相對細胞數量視為100%），實驗組的相對皮膚纖維細胞數量為225.93%。換言之，實驗組的相對皮膚纖維細胞增生數量相對於空白組明顯多達二倍以上。由此可知，黑鑽蘋果萃取物能有效促進皮膚纖維細胞增生，而皮膚纖維母細胞會分泌膠原蛋白，更有助於提升肌膚的支撐及彈性。於此，陽性對照組出現正常增生的預期結果，則可排除實驗操作上的誤失。
範例四：黑鑽蘋果萃取物促進傷口癒合的測試
於此，培養人類皮膚纖維細胞單層（cell monolayer）後再以尖銳物於細胞單層創造傷口，以測定細胞經黑鑽蘋果萃取物處理後其傷口的癒合變化狀態。基於創傷發生時為了修補傷口並避免感染，會產生顯著的細胞遷移效應，於此，採用傷口癒合試驗(Wound healing assay)這是觀察細胞遷移(Cell migration)的典型試驗之一。
所用材料與儀器，如下：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（後續簡稱皮膚纖維細胞，寄存編號BCRC 60153）。
細胞培養基：90%的添加有「Earle’s平衡鹽」最低限度基本培養基（minimum essential medium(Eagle) in Earle's BSS）額外添加成分使其含有0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate）以及10% 胎牛血清(後續簡稱FBS)（購自Gibco）所配製而成。
薄膜細胞培養皿：又稱插入式細胞培養盤或插入式細胞培養容器(Culture-Insert well)(SPL®SPLInsert™)。
測試流程：
先將薄膜細胞培養皿置入24孔盤的各孔內，再將皮膚纖維細胞以1.5×10 5cells/well的密度種入各孔，添加細胞培養基後於37℃下培育過夜以形成細胞單層(cell monolayer)。
將薄膜細胞培養皿從24孔盤的各孔中移除後，在各孔中能觀察到細胞單層上有一道大小大致相同的細胞間隙，除去細胞培養基並以使用1XPBS洗滌一次。
將潤洗後的皮膚纖維細胞分為三組(下述流程每組進行三重複)，並添加實驗培養基，然後先利用顯微鏡(ZEISS)及攝像機取得細胞影像以觀察及記錄皮膚纖維細胞的遷移距離(即0小時的間隙面積(T0))，再於37℃下額外培養6個小時。並且，以0小時的間隙面積(T0)做為初始的傷口面積，如圖3所示，以此時的狀態作為基礎水平(即第0小時)。
於此，實驗組的實驗培養基為添加範例一製得的黑鑽蘋果萃取物之2 mL細胞培養基（即黑鑽蘋果萃取物的最終濃度為1 mg/mL）。空白組的實驗培養基為單純的2 mL細胞培養基（即不含黑鑽蘋果萃取物）。陽性對照組的實驗培養基為額外添加10%FBS的2 mL細胞培養基（不含黑鑽蘋果萃取物）。
在培養第6小時使用顯微鏡觀察並記錄傷口狀態影像進行初步觀察，此時取得的傷口狀態影像如圖3所示。空白組的傷口大小在第0小時與第6小時並無肉眼可見的區別，而實驗組與陽性對照組的傷口大小具有肉眼可見的縮小，顯示可排除實驗操作上的誤失，繼續進行觀察。
後續持續於37℃下培養16小時後，再使用顯微鏡觀察並記錄傷口狀態影像，將影像以Image J軟體分析遷移百分比（migration area），並以空白組的細胞癒合率為100%為基礎，換算得到實驗組的細胞癒合率，如圖4所示。
於此，所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖4所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
請參閱圖4。相較於空白組（即其相對細胞數量視為100%），實驗組的相對皮膚纖維細胞癒合率148.91%。換言之，實驗組的相對皮膚纖維細胞增生數量相對於空白組明顯多達48.91%。由此可知，黑鑽蘋果萃取物能有效促進皮膚纖維細胞的傷口癒合。於此，陽性對照組出現正常癒合的預期結果，則可排除實驗操作上的誤失。
範例五：黑鑽蘋果萃取物促進膠原蛋白分泌測試
所用材料與儀器，如下：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966Sk (Human skin fibroblast CCD-966Sk)，取自美國標準生物品收藏中心(簡稱ATCC)保存編號Cat. CRL-1881，以下簡稱皮膚纖維細胞。
細胞培養基：為添加有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，產品編號10437-028）、1%的青黴素-鏈黴素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，產品編號15140122）及1mM的丙酮酸鈉（sodium pyruvate，Gibco公司，產品編號11360-070）的最低限度必需培養基（Minimum essential medium，簡稱MEM，以下稱MEM培養基）（Gibco公司，產品編號11095080）。
可溶性膠原蛋白檢測套組(Biocolor公司；編號產品編號S1000)。
溶劑：1XDPBS（Gibco公司，產品編號14200-075）。
二氧化碳培養箱（ASTEC公司，產品編號14200-075）。
測試流程：
首先，以2Í10 4個皮膚纖維細胞的密度植入至24孔細胞培養盤中，於37℃下的二氧化碳培養箱中培養24小時。待纖維母細胞貼附於細胞培養盤的底部後，以1XDPBS清洗一次。
將皮膚纖維細胞分為實驗組及空白組。各孔加入500μL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養48小時。
其中，實驗組的測試培養基為含有0.125%的範例一中所得到的黑鑽蘋果萃取物的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基。
收集1mL的上述各組的產品編號，並以可溶性膠原蛋白檢測套組處理以形成各組的待測溶液，接著以分光光度計測量其在555nm下之各組吸光值，測試結果如圖5所示。
於此，顯示的膠原蛋白分泌量採相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
請參閱圖5。將空白組的數值視為100%。相較於空白組，實驗組的膠原蛋白的相對分泌量為468.65%，具有統計學上的顯著差異。可知，黑鑽蘋果萃取物能顯著促進人類皮膚纖維母細胞大量分泌膠原蛋白，並顯著的提高達正常分泌的四倍以上。由此可知，黑鑽蘋果萃取物能使人類肌膚細胞能有效地分泌膠原蛋白，進而改善肌膚狀態。
範例六：黑鑽蘋果萃取物對促進彈力蛋白分泌測試
材料與儀器：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966Sk (Human skin fibroblast CCD-966Sk)，取自美國標準生物品收藏中心(簡稱ATCC)保存編號Cat. CRL-1881，以下簡稱皮膚纖維細胞。
細胞培養基：90%的添加有Earle’s平衡鹽的最低限度基本培養基（minimum essential medium (Eagle) in Earle's BSS）額外添加成分使其含有0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate）以及10% 胎牛血清(後續簡稱FBS)（購自Gibco）所配製而成。
RNA萃取試劑套組，購自Genemark公司。
SuperScript® III反轉錄酶，購自Invitrogene公司。
ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司。
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit，購自KAPA Biosystems公司，產品編號KK4600。
測試流程：
將皮膚纖維細胞以每孔1×10 5個的密度，接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中，並在37℃下培養24小時。
於培養後，將皮膚纖維細胞分為以下二組：空白組、實驗組。其中，空白組的培養液不含任何萃取物，實驗組的培養液含有0.5 mg/mL的範例一製得的黑鑽蘋果萃取物。各組進行三重複，並於37℃下，培養24小時。
移除培養後的空白組、實驗組的培養液，並以PBS進行潤洗。
於潤洗後，以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破開各組的HPEK-50細胞的細胞膜，以形成細胞溶液。
使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA作為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
使用ABI StepOnePlus TMReal-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit及表1的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察空白組及實驗組的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線（melting curve）。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈。
使用2 - ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2 - ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化： △Ct = Ct 實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct GAPDH △△Ct= △Ct 實驗組之目標基因- △Ct 空白組之目標基因倍數變化 = 2 - ΔΔ Ct 平均值
表1
引子名稱 序列編號 序列
ELN-F SEQ ID NO:1 GCTAAGGCAGCCAAGTATGG
ELN-R SEQ ID NO:2 CACCTGGGACAACTGGAATC
FBN1-F SEQ ID NO:3 TTTAGCGTCCTACACGAGCC
FBN1-R SEQ ID NO:4 CCATCCAGGGCAACAGTAAGC
於此，空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。（圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
測試結果請參閱圖6。在空白組的皮膚纖維細胞並未經過任何處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組，ELN基因實驗組（黑鑽蘋果萃取物）的ELN基因的表現量為2.62倍，而FBN1基因實驗組（黑鑽蘋果萃取物）的FBN1基因的表現量為1.89倍。
由此可知，黑鑽蘋果萃取物能明顯提升ELN基因與FBN1基因的表現量，以達到提升彈力蛋白量的效果。
範例七：黑鑽蘋果萃取物對促進玻尿酸相關基因表現測試
材料與儀器：
人類皮膚纖維母細胞CCD-966Sk (Human skin fibroblast CCD-966Sk)，取自美國標準生物品收藏中心(簡稱ATCC)保存編號Cat. CRL-1881，以下簡稱皮膚纖維細胞。
細胞培養基：90%的添加有Earle’s平衡鹽的最低限度基本培養基（minimum essential medium(Eagle) in Earle's BSS）額外添加成分使其含有0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate）以及10% 胎牛血清(後續簡稱FBS)（購自Gibco）所配製而成。
RNA萃取試劑套組，購自Genemark公司。
SuperScript® III反轉錄酶，購自Invitrogene公司，產品編號18080-044。
ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司。
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit，購自KAPA Biosystems公司，產品編號KK4600。
測試流程：
將皮膚纖維細胞以每孔1×10 5個的密度，接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中，並在37℃下培養24小時。
於培養後，將HPEK-50細胞分為以下二組：空白組、實驗組。其中，空白組的培養液不含任何萃取物，實驗組的培養液含有1 mg/mL的範例一製得的黑鑽蘋果萃取物。各組進行三重複，並於37℃下，培養24小時。
移除培養後的空白組、實驗組的培養液，並以PBS進行潤洗。
於潤洗後，以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破開各組的HPEK-50細胞的細胞膜，以形成細胞溶液。
使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA作為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2X） Kit及表2的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察空白組及實驗組的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線（melting curve）。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈。
使用2-ΔΔCt方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2-ΔΔCt方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct 實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- C tGAPDH
△△Ct= △Ct 實驗組之目標基因- △Ct 空白組之目標基因
倍數變化 = 2- ΔΔ Ct 平均值
表2
引子名稱 序列編號 序列
HAS2-F SEQ ID NO:5 AAGAACAACTTCCACGAAAAGGG
HAS2-R SEQ ID NO:6 GGCTGGGTCAAGCATAGTGT
HAS3-F SEQ ID NO:7 CGCAGCAACTTCCATGAGG
HAS3-R SEQ ID NO:8 AGTCGCACACCTGGATGTAGT
空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。（圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
測試結果請參閱圖7。在空白組的皮膚纖維細胞並未經過任何處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組，HAS2基因實驗組（黑鑽蘋果萃取物）的HAS2基因的表現量為4.35倍，而HAS3基因實驗組（黑鑽蘋果萃取物）的HAS3基因的表現量為1.82倍。
由此可知，黑鑽蘋果萃取物能明顯提升HAS2基因與HAS3基因的表現量，藉以提升肌膚玻尿酸含量。
範例八：黑鑽蘋果萃取物的人體測試
受試者：8位受試者。其中，各受試者為年滿20歲之成年人。
測試項目：肌膚皺紋量及肌膚含水量。
其中，肌膚皺紋量(Wrinkles)：使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚，尤其是眼周的區域進行拍攝，藉由標準白光照射、偵測皮膚細紋的變化，即可偵測紋理位置並得到一數值，可代表皮膚的平滑程度。於量測後，將控制組的皺紋量表現量作為基準（即控制組的之皺紋量的相對表現率為100%），計算實驗組的皮膚皺紋量的相對表現率（%）。
其中，肌膚含水量(Hydration)：使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚含水量檢測探頭Corneometer® CM825 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany)對同受試者的面部肌膚進行檢測。該檢測探頭係基於電容的原理進行測量。當水分含量發生變化時，皮膚的電容值亦發生變化，故可通過測定皮膚電容值，分析皮膚表面的含水量。
測試方式：
令8位受試者每日食用包含3克的範例一所製得的黑鑽蘋果萃取物的飲品，並且連續食用4週，其他飲食作息不改變。
於食用前（即第0週）所測得的數據稱為空白組，食用4週後（即第4週）所測得的數據稱為實驗組。
測試結果：
下面圖式中顯示的以所有受試者的平均值，並以第0週的數據為基礎視為100%，換算得各組別相對值。其中，使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異，以得到其p值。並且，於圖中，以「*」是指其p值小於0.05。
請參閱圖8。經過4週的每日服用黑鑽蘋果萃取物後，8位實驗組受試者的平均肌膚皺紋從第0週的100%（空白組）減少到90.3%（實驗組）。
請參閱圖9。經過4週的每日服用黑鑽蘋果萃取物後，8位實驗組受試者的平均肌膚含水量從第0週的100%（空白組）提升到113.4%（實驗組）。
綜上所述，任一實施例的黑鑽蘋果萃取物可用以製備調理肌膚狀態的組合物。在一些實施例中，黑鑽蘋果萃取物可具有下列至少一種作用：促進肌膚細胞粒線體活性、促進皮膚纖維細胞增生、促進皮膚傷口癒合、促進皮膚膠原蛋白含量提升、促進皮膚彈力蛋白含量提升、促進皮膚玻尿酸含量提升、減少皮膚皺紋量、提升皮膚含水量。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是一實施例的黑鑽蘋果萃取物促進粒線體活性測試結果圖。 圖2是一實施例的黑鑽蘋果萃取物促進皮膚纖維細胞增生測試結果圖。 圖3是一實施例的黑鑽蘋果萃取物促進皮膚傷口癒合測試顯微攝影。 圖4是一實施例的黑鑽蘋果萃取物促進皮膚傷口癒合測試結果圖。 圖5是一實施例的黑鑽蘋果萃取物提升皮膚膠原蛋白含量測試結果圖。 圖6是一實施例的黑鑽蘋果萃取物提升皮膚彈力蛋白含量測試結果圖。 圖7是一實施例的黑鑽蘋果萃取物提皮膚玻尿酸含量測試結果圖。 圖8是人體測試的平均肌膚皺紋量測試結果圖。 圖9是人體測試的平均皮膚含水量測試結果圖。
TW202402265A_112125557_SEQL.xml

Claims (10)

  1. 一種黑鑽蘋果萃取物的用途，其是用於製備調理肌膚狀態的組合物，該黑鑽蘋果萃取物是以水為溶劑提取自蘋果 Malus pumila植株的全果實。
  2. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物促進肌膚細胞粒線體活性。
  3. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物促進皮膚纖維細胞增生。
  4. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物促進皮膚傷口癒合。
  5. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物促進皮膚膠原蛋白含量提升。
  6. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物促進皮膚彈力蛋白含量提升。
  7. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物促進皮膚玻尿酸含量提升。
  8. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物減少皮膚皺紋量。
  9. 如請求項1所述的用途，其中該黑鑽蘋果萃取物提升皮膚含水量。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的用途，其中該組合物為一食品組合物，且該組合物內至少包含該黑鑽蘋果萃取物3克/日。
TW112125557A 2022-07-08 2023-07-07 黑鑽蘋果萃取物用於製備調理肌膚狀態組合物的用途 TW202402265A (zh)

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