TWI734474B - 刺果番荔枝發酵物於製備緊緻肌膚、抗醣化、及基因調節之組合物之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種刺果番荔枝發酵物於製備緊緻肌膚、抗醣化、及基因調節之組合物之用途。該刺果番荔枝發酵物係藉由對一刺果番荔枝水萃取物進行釀酒酵母、乳酸桿菌、及醋酸桿菌之三階段發酵而製得。該刺果番荔枝發酵物促進膠原蛋白緊緻，抑制蛋白質醣化，促進抗老化基因CCT6A 、CCT8 、PINK1 、TERT 、及TERC 、皮膚保濕基因SMPD1 、抗發炎基因IL-10 、及先天免疫力刺激基因IL-18 之表現，及/或抑制黑色素生成相關基因MITF 之表現，因此有助於延緩皮膚老化現象。

Description

刺果番荔枝發酵物於製備緊緻肌膚、抗醣化、及基因調節之組合物之用途
本發明係關於一種植物發酵物的美容及保健用途，特別係關於一種刺果番荔枝發酵物於製備緊緻肌膚、抗醣化、及基因調節之組合物之用途。
皮膚提供個體對抗陽光中紫外線輻射、病原體、摩擦力等環境因子的第一階段保護。皮膚由外向內依序包含表皮層、主要由結締組織構成的真皮層、及皮下組織。表皮層包含最外側的角質層並且不斷更新。表皮層與真皮層間存在持續分裂的細胞，例如皮膚纖維母細胞(skin fibroblasts)、角質形成細胞(keratinocytes)、及黑色素細胞(melanocytes)。真皮層含有膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白(elastin)、及玻尿酸(hyaluronic acid)等分子，其賦予肌膚彈性和支撐力量。隨著年齡增長，皮膚會出現皺紋、細紋、鬆弛、凹陷、毛孔粗大等老化現象。這些皮膚老化現象的形成與諸多因素有關，原因之一是真皮層中的纖維母細胞施加於細胞外間質(extracellular matrix)的收縮力變弱，另一原因是具有正常功能的膠原蛋白與彈性蛋白的含量隨年齡增加而減少。因此，皮膚抗老化的策略包括設法提升真皮層中結締組織的緊緻程度，以及減少健康的膠原蛋白與彈性蛋白流失。
醣化反應(glycation)是導致皮膚喪失健康的膠原蛋白及彈性蛋白的原因之一。醣化反應係指還原糖的醛(酮)基與含胺基物質(例如蛋白質、核酸等)的胺基之間的一種非酵素性反應，其最終生成醣化終產物(advanced glycated end products，AGEs)。醣化反應會影響膠原蛋白聚集形成纖維，而且醣化終產物修飾的膠原蛋白纖維變得僵硬而易脆。此外，醣化終產物累積於皮膚內細胞外間質會干擾周圍細胞的增生、分化、移動、或基因表現，甚至會促進可分解膠原蛋白與彈性蛋白的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)生成，以及增加可引起發炎反應的細胞因子分泌。這些因素最終會促成皮膚老化。
此外，在細胞層次，老化可能的內部機制包括染色體末端的端粒(telomere)縮短、蛋白質品質不良、粒線體功能下降等。是故，皮膚抗老化的標靶宜包括細胞內的端粒酶反應、粒線體活性、及蛋白質品質控管等。
有鑑於此，開發一種能促進真皮層結締組織緊緻，抑制醣化反應，並且提升皮膚細胞自身抗老化能力的組合物，以維持皮膚的年輕狀態，實有其必要。
緣此，本發明之一目的在提供一種刺果番荔枝(Annona muricata )發酵物於製備緊緻肌膚及抗醣化之組合物之用途，其中該刺果番荔枝發酵物係藉由以下步驟製得：(a)以水萃取一刺果番荔枝果實而獲得一刺果番荔枝水萃取物而獲得一刺果番荔枝水萃取物，(b)添加一釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )至該刺果番荔枝水萃取物及進行發酵以獲得一第一中間發酵物，(c)添加一乳酸桿菌(Lactobacillus spp. )至該第一中間發酵物及進行發酵以獲得一第二中間發酵物，以及(d)添加一醋化醋酸桿菌(Acetobacter spp. )至該第二中間發酵物及進行發酵以獲得該刺果番荔枝發酵物。
在本發明之一實施例中，該乳酸桿菌係為一胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum )，且該醋酸桿菌係為一醋化醋酸桿菌(Acetobacter aceti )。
在本發明之一實施例中，該釀酒酵母進行發酵1至2天，該乳酸桿菌進行發酵1至2天，及該醋酸桿菌進行發酵4至6天。
在本發明之一實施例中，該釀酒酵母的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.02%至0.5%，該乳酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.01至0.25%，及該醋酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的1%至10%。
在本發明之一實施例中，該刺果番荔枝與水的重量比為1：2至1：5。
本發明之另一目的在提供一種前述刺果番荔枝於製備基因調節之組合物之用途。所述基因調節係促進一編碼伴隨蛋白T複合體(chaperonin containing TCP1 complex，CCT)次單元6A(CCT6A)、伴隨蛋白T複合體次單元8(CCT8)、磷酸酶及張力蛋白同源物誘導激酶1(phosphatase and tensin homolog (PTEN)-induced putative kinase 1，PINK1)、端粒酶反轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、端粒酶核醣核酸組分(telomerase RNA component，TERC)、鞘磷脂磷酸二酯酶1(sphingomyelin phosphodiesterase 1，SMPD1)、介白素-10(interleukin 10，IL-10)、或介白素-18(interleukin 18，IL-18)之基因的表現量，及/或抑制一編碼小眼畸形相關轉錄因子(microphthalamia-associated transcription factor，MITF)之基因的表現量。
本發明揭示經過特定發酵過程之刺果番荔枝發酵物具備促進膠原蛋白緊緻與抑制蛋白質醣化的功效。此外，透過基因調節，刺果番荔枝發酵物能增加抗老化、皮膚保濕、抗發炎、及先天免疫力相關蛋白質之產生，並且降低黑色素生成相關蛋白之形成。因此，對一個體施予有效量的刺果番荔枝發酵物有助於延緩皮膚老化現象，如皮膚鬆弛、乾燥、皺紋、及黑斑，甚至有益於延緩個體老化過程及提升各體免疫力，增進成人健康。因此，刺果番荔枝發酵物可用於製備抑緊緻肌膚及抗醣化之組合物，或可用於製備基因調節之組合物。該組合物可具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型，且可製成食品、飲品、營養補充劑、醫藥品、或保養品，藉由口服或局部施用方式給予一個體。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
本發明揭露一種刺果番荔枝發酵物，其係經水萃取及三階段發酵而製得，具體而言，該刺果番荔枝發酵物之製備係利用釀酒酵母、乳酸桿菌、及醋酸桿菌對一刺果番荔枝水萃取依序進行發酵。以下實施例詳細說明該刺果番荔枝發酵物具備促進膠原蛋白緊緻、抑制蛋白質醣化、及基因調節等多種功效，其中該基因調節包括促進一編碼伴隨蛋白T複合體(CCT)次單元6A(CCT6A)、伴隨蛋白T複合體次單元8(CCT8)、磷酸酶及張力蛋白同源物誘導激酶1(PINK1)、端粒酶反轉錄酶(TERT)、端粒酶核醣核酸組分(TERC)、鞘磷脂磷酸二酯酶1(SMPD1)、介白素-10(IL-10)、或介白素-18(IL-18)之基因的表現量，及/或抑制一編碼小眼畸形相關轉錄因子(MITF)之基因的表現量。定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本文所述的刺果番荔枝發酵物是刺果番荔枝(Annona muricata )果實的發酵物。刺果番荔枝是番荔枝(Annonaceae)番荔枝屬(Annona )的常綠喬木，別名羅李亮果。其果實呈心臟形且有芳香味，表面有刺狀突起，果肉可食用。
如本文中所使用的，用語「釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )」、「乳酸桿菌(Lactobacillus spp. )」以及「醋酸桿菌(Acetobacter spp. )」分別意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易於獲得的釀酒酵母菌、乳酸菌以及醋酸桿菌(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的釀酒酵母菌、乳酸桿菌以及醋酸桿菌株。
本文所述的醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而製備成一適合於非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型(dosage form)，其包括但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)、細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
本文所述的醫藥組合物可包含一廣泛使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。該些試劑的選用與數量落在熟習此項技術者的專業素養與例行技術範疇內。
前述醫藥上可接受的載劑可包含一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、含糖溶液、含醇水溶液(aqueous solution containing alcohol)、及它們的組合。材料與方法 微生物
自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)購買釀酒酵母(BCRC 20271)、胚芽乳酸桿菌(BCRC 910805)、及醋化醋酸桿菌(BCRC 11688)。材料
自Thermo Fisher Scientific公司購買含Earle’s平衡鹽溶液之Eagle’s最低基本培養基(Gibco Eagle’s minimum essential medium， MEM)、RPMI 1640培養基(Gibco RPMI medium 1640)、胎牛血清(Gibco fetal bovine serum，FBS)、青黴素/鏈黴素(Gibco penicillin/streptomycin)、非必需胺基酸、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、磷酸緩衝鹽溶液(Gibco phosphate buffered saline，PBS)、及大鼠尾部第一型膠原蛋白(Gibco)。自Lonza購買X-VIVO 10無血清培養基(購自Lonza，編號(BE)04-380Q)。自Sigma公司購買氫氧化鈉。自J.T. Baker公司購買99.9%冰醋酸。細胞培養
以下實施例所用細胞包括購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)之人類皮膚纖維母細胞CCD-966SK(ATCC BCRC 60153)，購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之人類單核細胞株(human monocytic cell line) THP-1 (ATCC TIB-202)，及分離自捐贈者血液之人類外周血單核細胞(peripheral mononuclear mononuclear cell，PBMC)。CCD-966SK細胞係在37°C、5%二氧化碳的條件下培養於添加10% FBS、0.1 mM非必需胺基酸、1.5 g/L碳酸氫鈉、及1 mM丙酮酸鈉之MEM
培養基，以下稱MEM細胞培養基。THP-1細胞係在37°C、5%二氧化碳的條件下培養於添加10%的FBS及1%的青黴素/鏈黴素之RPMI 1640培養基，以下稱RPMI細胞培養基。外周血單核細胞係在37°C、5%二氧化碳的條件下培養於X-VIVO10無血清培養基，以下稱X-VIVO細胞培養基。膠原蛋白緊緻試驗 (collagen contraction assay)
本試驗包含二部分。在第一部分，將0.2 mL膠原蛋白溶液(含3 mg/mL膠原蛋白之0.1%醋酸水溶液)加入含0.4 mL MEM細胞培養基之1.6 mL微量離心管，再立即加入1 μL 1 M氫氧化鈉水溶液及混合所得混合物，而後使該混合物在室溫固化20分鐘。在另外的微量離心管重複前述步驟，但增加氫氧化鈉水溶液的用量(如2 μL、3 μL及更多)，直至確定產生固態膠體(約在中性pH，此時細胞培養中酚紅指示劑呈粉紅色)所需的氫氧化鈉水溶液用量。
在第二部分，於無菌狀態下配製一膠原蛋白溶液(含3 mg/mL膠原蛋白之0.1%醋酸水溶液)及一皮膚纖維母細胞懸浮液(含1.5×105 個CCD-966SK細胞/mL之MEM。
培養基)。其後，將3.3 mL之該膠原蛋白溶液加入6.6 mL之該細胞懸浮液，再立即加入適當量之1 M氫氧化鈉水溶液及混合所得混合物，以獲得即將固化的含有皮膚纖維母細胞之膠原蛋白膠體。將該膠體依500 μL/孔迅速移入一24孔培養盤，並於室溫下靜置20分種即獲致一含有皮膚纖維母細胞之膠原蛋白固態膠體。將指定培養基依500 μL/孔加入該24孔培養盤，並利用一微量吸管使該固態膠體的邊緣脫離對該24孔培養盤之黏附後，將該24孔培養盤置於一培養箱內，在37°C、5%二氧化碳的濕潤空氣中隔夜培養，期間使用一裝設在該培養箱頂端的數位相機拍攝該固態膠體於培養開始及結束時的影像，以量測該固態膠體於不同時點的直徑及計算其於指定處理後的相對直徑。基因表現量分析
目標基因之訊息核醣核酸(mRNA)表現量之測定係基於定量聚合酶鏈鎖反應(quantitative polymerase chain reaction，簡稱qPCR)，或基於核酸雜交技術。以下分述各目標基因表現量之測定方法。抗發炎及調節先天免疫力基因之表現
人類單核細胞株THP-1中抗發炎及調節先天免疫力基因的表現量係利用qPCR測定，其步驟簡述如下。依據廠商使用說明，利用RNA萃取套組(RNA Extraction Kit；Geneaid)自經指定處理之細胞分離出RNA，於37°C下以反轉錄酶SuperScript® III Reverse Transcriptase (Invitrogen)將2000 ng RNA反轉錄為互補去氧核醣核酸(cDNA)。其後，利用qPCR套組(KAPA CYBR FAST qPCR Kit (2X)；KAPA Biosystems)以及目標基因與作為內部對照之甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因之引子對(表1)在PCR反應儀(Step One Plus Real-Time PCR system；Applied Biosystems)對前述cDNA進行qPCR，並分析PCR產物的解鏈曲線(melting curve)。
最終，使用 2-ΔΔCT 方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為一目標基因相對於控制組之相應基因的RNA表現量的倍數。該方法以GAPDH 基因的循環閾值(CT )作為內部對照之參考基因的循環閾值，按照以下公式計算倍數變化： ΔCT =實驗組或控制組的目標基因的CT  - 內部對照的CT ΔΔCT = 實驗組的ΔCT - 控制組的ΔCT 倍數變化 = 2 ‐ ΔΔCt 平均值
統計分析係使用Excel 軟體中的STDEV函數計算各基因相對表現量的標準差，並以單尾學生t檢定(TTEST)判斷數據間差異在統計上的顯著性。 表1
基因 正向引子(F)及反向引子(R)之核苷酸序列 SEQ ID NO
IL-10 F: TCAAGGCGCTGTGAATCC 1
R: GATGTCAAACTCACTCATGGCT 2
IL-18 F: TCTTCATTGACCAAGGAAATCGG 3
R: TCCGGGGTGCATTATCTCTAC 4
GAPDH F: CTGGGCTACACTGAGCACC 5
R: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG 6
抗老化基因之表現
皮膚纖維母細胞CCD-966SK中抗老化基因的表現量係利用qPCR測定，其步驟類似前述抗發炎基因表現之測定。抗老化基因及作為內部對照之GAPDH 基因之引子對如表2所示。 表2
基因 正向引子(F)及反向引子(R)之核苷酸序列 SEQ ID NO
CCT6A F: TGGCCAGAACATCTCTTCGTACT 7
R: AGTCCACTACAGCCTCTGTTAAGACA 8
CCT8 F: TCTTCATTGACCAAGGAAATCGG 9
R: TCCGGGGTGCATTATCTCTAC 10
PINK1 F: CTGTGGTGGCTAGTGCTCCT 11
R: TCCAGACGTGAGACAGTTGG 12
TERT F: GGACTGCGCTTGGCTGCG 13
R: GTCGGAAGCAGAGGTCAGGCA 14
TERC F: AAGAGTTGGGCTCTGTCAGC 15
R: GACTCGCTCCGTTCCTCTTC 16
GAPDH F: CTGGGCTACACTGAGCACC 5
R: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG 6
保濕及黑色素形成相關基因之表現
外周血單核細胞中保濕及黑色素生成相關基因的表現量係基於核酸雜交技術，利用NanoString多重基因單分子計數分析(NanoString nCounter analysis，簡稱nCounter分析)測定，其步驟簡述如下。依據廠商使用說明，利用RNA萃取套組(RNA Extraction Kit；Geneaid)自經指定處理之細胞分離出RNA。其後，將75 ng該RNA與目標基因的螢光條形碼標記探針雜交，並利用奈米序列計數儀(NanoString nCounter；購自NanoString technologies公司，美國)對前述RNA進行直接計數。各目標基因的相對表現量係以nSolver分析軟體(nSolver™ Analysis Software version 4.0)計算。總多酚含量之測定
樣品中總多酚含量係以Folin-Ciocalteu比色法進行定量，其係利用多酚具有的抗氧化特性而進行的，該Folin-Ciocalteu比色法所用的試劑中，含有磷鎢酸(Phosphotungstic acid)、及磷鉬酸(Phosphomolybdic acid)，其被多酚類物質還原 (即由Mo6+ 變為Mo5+ )後，會生成能夠吸收750 nm波長的光之藍色的化合物，且該藍色化合物於750 nm的吸光值與待測物中總多酚的含量呈正比，因而可以用於定量待測物中總多酚的含量。
在Folin-Ciocalteu比色法中，係使用沒食子酸 (Gallic acid，購自Sigma，美國，編號為 G7384)作為標準品，以製作吸光值對濃度的標準曲線。首先，精密秤取10.0 g的沒食子酸置於10 mL的容量瓶中，再加入ddH2 O至總體積達10 mL，即完成沒食子酸之標準品溶液 (Gallic acid stock, 1000
Figure 02_image001
g/mL)；接著，將該標準品溶液稀釋10倍至濃度為100
Figure 02_image001
g/mL (100
Figure 02_image001
L之Gallic acid stock
Figure 02_image003
900
Figure 02_image001
L 之ddH2 O，未使用完之Gallic acid stock則儲存於-20o C下)，接著將該100
Figure 02_image001
g/mL的沒食子酸進行系列稀釋成0、20、40、60、80、及100
Figure 02_image001
L/mL之沒食子酸 (如表3所示)，並分別取100
Figure 02_image001
L之各濃度的標準溶液至10 mL之玻璃試管中，再分別加入500
Figure 02_image001
L 之Folin-Ciocalteu的酚試劑 (購自Merck，德國，編號為1.09001.0500)混合均勻並靜置3分鐘後，加入400
Figure 02_image001
L之7.5%的碳酸鈉 (Sodium carbonate，將7.5 g之無水碳酸鈉定量至100 mL之ddH2 O中，其中該無水碳酸鈉係購自Sigma，美國，編號為31432)均勻混合後靜置反應30-60分鐘，較佳為30分鐘，再以震盪(Vortex)混合靜置至確定無氣泡後，分別取出200
Figure 02_image001
L的各管反應溶液置於96孔培養板中，並測量其於750 nm之吸光值，以繪製標準溶液之迴歸曲線公式。 表3. 系列稀釋沒食子酸標準品之配方
濃度(
Figure 02_image001
g/mL)		 0 20 40 60 80 100
Gallic acid stock 0
Figure 02_image001
L		 20
Figure 02_image001
L		 40
Figure 02_image001
L		 60
Figure 02_image001
L		 80
Figure 02_image001
L		 100
Figure 02_image001
L
ddH2 O 100
Figure 02_image001
L		 80
Figure 02_image001
L		 60
Figure 02_image001
L		 40
Figure 02_image001
L		 20
Figure 02_image001
L		 10
Figure 02_image001
L
肌膚紫外線色斑之測量
以VISIA肌膚檢測儀 (CIS-VISIA.7 VISIA Complexion Analysis System，Canfield scientific，美國，序號V71214)進行全臉紫外線色斑檢測，其係使用高解析單眼相機搭配三種光源 (全光域波長、紫外光及偏光波域的光源)來拍攝臉部肌膚並取得清晰圖檔後，利用專業軟體進行紫外線色斑數量分析。肌膚含水量之測量
以CK Cutometer® dual MPA 580多探頭膚質分析儀 (CK electronic，德國)進行皮膚含水量的測定，其中係利用電容測量來測量皮膚水合作用的狀態，且係利用探頭按壓皮膚來進行測量。肌膚皺紋之測量
以VISIA肌膚檢測儀 (CIS-VISIA.7 VISIA Complexion Analysis System，Canfield scientific，美國，序號V71214)進行全臉皺紋檢測，其係使用高解析單眼相機搭配三種光源 (全光域波長、紫外光及偏光波域的光源)來拍攝臉部肌膚並取得清晰圖檔後，利用專業軟體進行皺紋數量分析。榖胱 甘肽 S 轉移酶活性之測定
其中，榖胱甘肽S轉移酶 (Glutathione S-transferase, GST)活性係利用GST-RBC 生化比色法進行測定，其中係使用谷胱甘肽S轉移酶測定試劑套組 (GTS assay kit，購自abcam，編號 ab112132)分析紅血球細胞中谷胱甘肽S轉移酶的活性，其中係將待測血液樣品以該谷胱甘肽S轉移酶測定試劑套組於室溫下進行染色15分鐘，並以PBS清洗與回溶後，置於流式細胞儀 (Accuri C6 Plus，BD)中進行分析，其中偵測螢光訊號為FL1 channel (Ex/Em = 490/525 nm)，並以該螢光訊號作為紅血球細胞中榖胱甘肽S轉移酶的活性。實施例 1 刺果番荔枝 發酵物之製備
本文所述的刺果番荔枝發酵物是刺果番荔枝(Annona muricata )果實的發酵物，其係經水萃取及三階段發酵而製得，以下舉例說明該發酵物之製備步驟。
首先，將刺果番荔枝的果實洗淨及去皮，以研磨、攪碎等方式破碎該果實以獲得一刺果番荔枝果泥，再將刺果番荔枝果泥與水依1：2至1：5之重量比混合以進行萃取，其中重量比較佳為1：3。該萃取係在60°C至100°C，較佳為80°C至95°C進行0.5至2小時以獲得一刺果番荔枝水萃取物。該萃取完成後，添加5%至15%(w/w)，較佳為8%至10%(w/w)，更佳為8%(w/w)之葡萄糖至該刺果番荔枝水萃取物，使其pH值約為3.5至3.7及白利糖度約為9.5至10.2，其中pH值較佳為3.56且白利糖度較佳為9.7。
經上述步驟所得刺果番荔枝水萃取物冷卻至室溫後用於三階段發酵。各階段的較佳發酵條件如下： 階段一：添加釀酒酵母(BCRC 20271)至該刺果番荔枝水萃取物，並於25°C至35°C進行發酵1至2天以獲得一第一中間發酵物。該釀酒酵母的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.02%至0.5%(w/w)；在本發明之一較佳實施例中，以刺果番荔枝果泥與水依1：3之重量比例混合所得的刺果番荔枝水萃取物，為計算該釀酒酵母的添加量。 階段二：添加胚芽乳酸桿菌(BCRC 910805)至該第一中間發酵物，並於25°C至35°C進行發酵1至2天以獲得一第二中間發酵物。該胚芽乳酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.01%至0.25%(w/w)；在本發明之一較佳實施例中，以刺果番荔枝果泥與水依1：3之重量比例混合所得的刺果番荔枝水萃取物，為計算該胚芽乳酸桿菌的添加量。 階段三：添加醋化醋酸桿菌(BCRC 11688)至該第二中間發酵物，並於25°C至35°C進行發酵4至6天以獲得一刺果番荔枝發酵物，其pH值約為3.3至3.5及白利糖度約為1.8至2.5，其中pH值較佳為3.4且白利糖度較佳為2。該醋化醋酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的1%至10%(w/w) ；在本發明之一較佳實施例中，以刺果番荔枝果泥與水依1：3之重量比例混合所得的刺果番荔枝水萃取物，為計算該醋化醋酸桿菌的添加量。
該刺果番荔枝發酵物可進一步在45°C至70°C進行減壓濃縮而獲得一濃縮產物，並可透過200至400目(mesh)之濾網過濾以移除殘餘固體物。經過濃縮、過濾的刺果番荔枝發酵物可選擇性地添加50至70%(w/w)、較佳為60%(w/w)異麥芽寡糖(白利糖度約為30至50、較佳為40)。最終，經加工處理的刺果番荔枝發酵物於後續利用前於95°C至120°C滅菌70至90分鐘。實施例 2 刺果番荔枝 發酵物促進膠原蛋白緊緻
為探討本發明刺果番荔枝發酵物的皮膚緊緻效果，利用膠原蛋白緊緻試驗，評估一含有皮膚纖維母細胞之膠原蛋白固態膠體以依據實施例1製得之刺果番荔枝發酵物處理後的尺寸變化，並使用如實施例1所載之刺果番荔枝水萃取物進行對比試驗，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，製備一含有人類皮膚纖維母細胞CCD-966SK之膠原蛋白固態膠體，將其隔夜培養於含0.25 mg/mL刺果番荔枝發酵物之500 μL MEM細胞培養基、含0.25 mg/mL刺果番荔枝水萃取物之500 μL MEM細胞培養基、或單純500 μL MEM細胞培養基(控制組)，並觀察該固態膠體於培養開始及結束時的直徑，以計算該固態膠體於不同處理後的相對直徑。
圖1顯示經前述不同處理的膠原蛋白固態膠體的相對直徑，其係以百分比表示固態膠體於培養結束時相對於培養開始時之直徑比值；**表示相比控制組為p＜ 0.01。依據圖1，相比控制組膠體於隔夜培養後的相對直徑約為75%，施予刺果番荔枝水萃取物使膠體的相對直徑略減少至約68%。意外地，刺果番荔枝發酵物之處理使膠體的相對直徑顯著減少至約63%。此結果顯示刺果番荔枝發酵物能有效增強皮膚纖維母細胞施於膠原蛋白膠體的收縮力，因此具備皮膚緊緻及減少皮膚皺紋的效果。實施例 3 刺果番荔枝 發酵物抑制蛋白質醣化
身體內蛋白質的醣化反應會導致蛋白質結構改變與功能缺失，進而促進老化與相關疾病發生。為探討本發明刺果番荔枝發酵物是否能抑制蛋白質醣化，利用抗醣化分析測定依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物對牛血清蛋白(BSA)醣化的抑制作用，並使用如實施例1所載之刺果番荔枝水萃取物進行對比試驗，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，利用200 mM磷酸鹽緩衝溶液(pH 7.4)配製60 mg/mL 的膠原蛋白溶液(含0.06%疊氮化鈉)及1.5 M果糖溶液。為進行蛋白質醣化反應，將0.25 mL 膠原蛋白溶液與0.25 mL果糖溶液之混合物與0.25 mL之刺果番荔枝發酵物樣品(濃度為500 mg/mL)、刺果番荔枝水萃取物樣品(濃度為500 mg/mL)、或樣品溶劑(控制組)均勻混合，於50°C反應24小時，再添加胺基胍(aminoguanidine，AG，購自Sigma)以中止醣化反應。使用分光螢光計(spectrofluorometer，FLx 800，BioTek)測量前述反應液(0.1 mL)在0小時與24小時的螢光強度(激發波長360 nm，放射波長460 nm)，並依下列公式計算蛋白質醣化終產物(AGEs)生成率：[(樣品螢光強度24 小時 - 樣品螢光強度0 小時 )/(控制組螢光強度24 小時 - 控制組螢光強度0 小時 )]×100%。
圖2顯示前述不同樣品對牛血清蛋白醣化的抑制作用。依據圖2，刺果番荔枝水萃取物無法抑制牛血清蛋白之醣化，然而刺果番荔枝發酵物顯著減少醣化終產物生成約13%。此結果顯示刺果番荔枝水萃取物因為本文所述發酵製成而轉變為具備抑制蛋白質醣化的能力，因此有益於體內蛋白質維持正常功能，並且減少醣化終產物引起的氧化壓力增加，進而延緩老化的進展。例如，刺果番荔枝發酵物可藉由抑制膠原蛋白及彈力蛋白之醣化而減少皮膚中具正常功能的膠原蛋白及彈力蛋白的流失，亦可降低皮膚細胞的氧化壓力，因此延緩皮膚老化。實施例 4 刺果番荔枝 發酵物促進抗老化基因之表現
為探討本發明刺果番荔枝發酵物對對皮膚細胞抗老化能力的影響，以qPCR測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966SK以依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物處理後，其抗老化相關蛋白質的基因表現量變化。同時，使用如實施例1所載之刺果番荔枝水萃取物進行對比試驗。該抗老化相關蛋白質包括伴隨蛋白T複合體(CCT)次單元如CCT6A及CCT8、磷酸酶及張力蛋白同源物誘導激酶1(PINK1)、端粒酶反轉錄酶(TERT)、及端粒酶核醣核酸組分(TERC) ，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，將CCD-966SK細胞依1.5×105 個細胞/孔接種於一六孔培養盤，各孔含有2 mL MEM細胞培養基。在37°C培養細胞24小時後，移除該細胞培養基並以PBS溶液清洗細胞。其後，以含40 mg/mL刺果番荔枝發酵物之2 mL MEM細胞培養基(實驗組1)、含40 mg/mL刺果番荔枝水萃取物之2 mL MEM細胞培養基(實驗組2)、或者單純以2 mL MEM細胞培養基(控制組)處理細胞。前述三組細胞於37°C培養24小時後用於qPCR分析。
圖3顯示前述三組細胞中CCT6A 、CCT8 、PINK1 、TERT 、及TERC 基因之相對表現量；* 及** 分別表示相比控制組為p＜ 0.05及p＜ 0.01。依據圖3，相比控制組，刺果番荔枝水萃取物之處理對CCT6A 、CCT8 、PINK1 、TERT 、及TERC 基因之表現無顯著影響。然而，刺果番荔枝發酵物之處理使CCT6A 、CCT8 、PINK1 、TERT 、及TERC 基因之表現量顯著增加。鑒於先前研究指出伴隨蛋白T複合體協助蛋白質正常摺疊，PINK1促進老化粒線體更新，TERT及TERC參與端粒酶反應以延長端粒，圖3所示數據顯示刺果番荔枝發酵物能藉由促進CCT6A 、CCT8 、PINK1 、TERT 、及TERC 等多種抗老化基因的表現，使皮膚纖維母細胞持續保有分裂能力，並且改善皮膚細胞的蛋白質品質與粒線體活性，因此有助於維持皮膚細胞的活力及延緩肌膚老化。實施例 5 刺果番荔枝 發酵物促進保濕基因之表現且抑制黑色素生成相關基因之表現
為探討本發明刺果番荔枝發酵物對皮膚保濕及黑色素生成的影響，利用n-Counter分析測定人類外周血單核細胞(PBMC)依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物處理後，其保濕與黑色素生成相關蛋白的基因表現量變化。該保濕相關蛋白包括鞘磷脂磷酸二酯酶1(SMPD1)；該黑色素生成相關蛋白質包括小眼畸形相關轉錄因子(MITF)，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，將細胞依1×105 個細胞/孔接種於一六孔培養盤，各孔含有2 mL X-VIVO 10細胞培養基。在37°C培養細胞24小時後，移除該細胞培養基並以細胞裂解液(Geneaid)收集細胞。其後，以含5 mg/mL刺果番荔枝發酵物之2 mL X-VIVO 10細胞培養基(實驗組)或者單純以2 mL X-VIVO 10細胞培養基(控制組)處理細胞。該二組細胞於37°C培養24小時後用於nCounter分析。
圖4顯示前述二組細胞中SMPD1 基因之相對表現量；*** 表示相比控制組為p＜ 0.001。依據圖4，相比控制組，以刺果番荔枝發酵物處理細胞24小時顯著提升SMPD1 基因的表現量約155%，顯示刺果番荔枝發酵物能促進細胞產出角質層脂質主要成分之一的神經醯胺(ceramide)，因此提升皮膚的角質層屏障力及減少皮膚中水分散失，進而避免皮膚乾燥與鬆弛。
圖5顯示前述二組細胞中MITF 基因之相對表現量；*** 表示相比控制組為p＜ 0.001。依據圖5，相比控制組，刺果番荔枝發酵物之處理顯著抑制MITF 基因的表現量約62%。此結果說明刺果番荔枝發酵物能藉由抑制黑色素生成相關蛋白質之形成而達到皮膚美白效果。實施例 6 刺果番荔枝 發酵物促進抗發炎及調節先天免疫力基因之表現
為探討本發明刺果番荔枝發酵物對個體免疫狀態的影響，以qPCR測定人類外周血單核細胞(PBMC)以依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物處理後，其免疫調節細胞激素的基因表現量變化。同時，使用如實施例1所載之刺果番荔枝水萃取物進行對比試驗。該免疫調節細胞激素包括介白素-10(IL-10)及介白素-18(IL-18)，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，將人類外周血單核細胞依1×105 個細胞/孔接種於6孔盤，各孔含有2 mL RPMI細胞培養基。在37°C培養細胞24小時後，移除該細胞培養基並以PBS溶液清洗細胞。其後，以含40 mg/mL刺果番荔枝發酵物之2 mL RPMI細胞培養基(實驗組1)、含40 mg/mL 刺果番荔枝水萃取物之2 mL RPMI細胞培養基(實驗組2)、或者單純以2 mL RPMI細胞培養基(控制組)處理細胞。前述三組細胞於37°C培養24小時後用於qPCR分析。
圖6及圖7分別顯示前述三組細胞中IL-10 及IL-18 基因之相對表現量；* 表示相比控制組為p＜ 0.05。依據圖6，相比控制組，刺果番荔枝水萃取物之處理略為抑制抗發炎基因IL-10 之表現。相對地，刺果番荔枝發酵物之處理使IL-10 基因之表現量上調約80%。此結果說明刺果番荔枝發酵物能藉由促進抗發炎細胞激素IL-10之合成而避免過度發炎造成的身體損傷。
依據圖7，相比控制組，刺果番荔枝水萃取物之處理對IL-18 基因之表現無顯著影響，但刺果番荔枝發酵物之處理使IL-18 基因之表現量顯著上調約50%。鑒於IL-18的作用之一是促進自然殺手細胞的活性，此結果說明刺果番荔枝發酵物有提升個體先天免疫力的潛力。實施例 7 刺果番荔枝 發酵物中總多酚含量的提升
為探討本發明三階段發酵製程對刺果番荔枝發酵物中活性成分的影響，使用Folin-Ciocalteu比色法測定依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物中總多酚的含量，同時使用相同方法測定如實施例1所載之刺果番荔枝水萃取物中總多酚的含量以進行對比試驗，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，分別將該刺果番荔枝水萃取物、及本發明之刺果番荔枝發酵物直接與水以1:5之重量比進行稀釋，接著分別取100
Figure 02_image001
L之該刺果番荔枝水萃取物的稀釋液、及本發明之刺果番荔枝發酵物的稀釋液於不同10 mL之玻璃試管中，再以前述Folin-Ciocalteu比色法測定該刺果番荔枝水萃取物、及本發明之刺果番荔枝發酵物中總多酚之濃度。
依據圖8，刺果番荔枝水萃取物僅含有約18 μg/mL的總多酚含量，而本發明之金銀花發酵物中總多分含量卻顯著的高達約52 μg/mL，為刺果番荔枝水萃取物的約3倍。此結果顯示，本發明之三段式發酵製成可顯著提高本發明刺果番荔枝發酵物中總多酚的含量，以達到提升功效成份，增強保健抗氧化功效之目的。實施例 8 刺果番荔枝 發酵物減少人體臉部肌膚的紫外線色斑
為探討本發明刺果番荔枝發酵物於人體驗證中，實際對肌膚產生的美白功效，使用膚質檢測儀測定依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物作用後，人體肌膚之紫外線色斑的淡化程度，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，募集8位年齡介於30-55歲之肌膚欠佳的成人為受試者，每日服用6 mL的本發明之刺果番荔枝發酵物，並分別於服用前、及服用28日後，以前述肌膚紫外線色斑之測量方法，分別測量該些受試者之肌膚。其中，以使用前紫外線色斑數量為100%，相對於使用前所得出之百分比，為使用後之改善狀況百分比。
依據圖9，服用本發明之刺果番荔枝發酵物後，比服用前顯著地減少5.9%的皮膚紫外線色斑，且改善率高達88.9% (結果未顯示)，此結果顯示本發明之刺果番荔枝發酵物能有效減少皮膚紫外線色斑，具有肌膚色之淡斑美白的功效。實施例 9 刺果番荔枝 發酵物提升人體臉部肌膚的含水量
為探討本發明刺果番荔枝發酵物於人體驗證中，實際對肌膚產生的保濕功效，使用多探頭膚質分析儀測定依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物作用後，人體肌膚的含水量提升的程度，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，募集8位年齡介於30-55歲之肌膚欠佳的成人為受試者，每日服用6  mL的本發明之刺果番荔枝發酵物，並分別於服用前、及服用28日後，以前述肌膚含水量之測量方法，分別測量該些受試者之肌膚。其中，以使用前肌膚含水量為100%，相對於使用前所得出之百分比，為使用後之提升狀況百分比。
依據圖10，服用本發明之刺果番荔枝發酵物後，比服用前顯著地提升肌膚含水量，且改善率高達88.9% (結果未顯示)，此結果顯示本發明之刺果番荔枝發酵物能確實具有肌膚保濕的功效。實施例 10 刺果番荔枝 發酵物減少人體臉部肌膚的皺紋
為探討本發明刺果番荔枝發酵物於人體驗證中，實際對肌膚產生的抗老化功效，使用膚質檢測儀測定依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物作用後，人體肌膚之皺紋的改善程度，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，募集8位年齡介於30-55歲之肌膚欠佳的成人為受試者，每日服用6 mL的本發明之刺果番荔枝發酵物，並分別於服用前、及服用28日後，以前述肌膚皺紋之測量方法，分別測量該些受試者之肌膚。其中，以使用前皺紋數量為100%，相對於使用前所得出之百分比，為使用後之改善狀況百分比。
依據圖11，服用本發明之刺果番荔枝發酵物後，比服用前顯著地減少肌膚皺紋的數量，此結果顯示本發明之刺果番荔枝發酵物能有效減少皮膚的皺紋，具有肌膚抗老化的功效。實施例 11 刺果番荔枝 發酵物減少人體血液中的榖胱甘肽 S 轉移酶
谷胱甘肽S轉移酶 (Glutathione S-transferase, GST)廣泛存在於哺乳動物各組織中，用以催化谷胱甘肽 (Glutathione, GSH)與化學物質的親電子基團進行結合，最終形成硫醚氨酸排出體外，在體內解毒的功能上起重要作用。GSH-ST具有消除體內過氧化物及解毒的雙重功能。其中，谷胱甘肽S轉移酶在谷胱甘肽過氧化物酶 (Glutathione peroxide, GSH-PX)活力低下的條件下，只有清除體內脂質過氧化物 (Lipid peroxide, LPO)的功能。
為探討本發明刺果番荔枝發酵物實際於提升人體抗氧化及免疫力的功效，使用生化比色法測定依實施例1製得之刺果番荔枝發酵物作用後，人體血球細胞中谷胱甘肽S轉移酶的活性，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，募集8位年齡介於30-55歲之免疫力欠佳的成人為受試者，每日服用6 mL 的本發明之刺果番荔枝發酵物，並分別於服用前、及服用28日後，分別將受試者血液中的紅血球細胞以紅血球分離液進行分離，並將該經分離的受試者血液以PBS調整至106 cells/mL後，以前述榖胱甘肽S轉移酶活性之測定方法，分別測量該些受試者血液中谷胱甘肽S轉移酶的活性。其中，以使用前谷胱甘肽S轉移酶的活性為1，使用後所得出之數值為使用前之倍數。
依據圖12，服用本發明之刺果番荔枝發酵物後，受試者血液中谷胱甘肽S轉移酶的活性，比服用前顯著地提升17%，且改善率高達100% (結果未顯示)，此結果顯示本發明之刺果番荔枝發酵物能有效提升抗氧化與免疫力的指標酵素，確實具有提升人體中整體抗氧化及免疫力的功效。實施例 12 刺果番荔枝 發酵物提升人體血液中抗發炎基因之表現
為探討本發明刺果番荔枝發酵物實際於提升人體抗發炎的功效，以qPCR測定人體中人類外周血單核細胞以實施例1製得之刺果番荔枝發酵物作用後，其免疫調節之細胞激素的基因表現量變化，其中以實施例1製備所得之本發明刺果番荔枝發酵物皆具有以下測試之功效。簡言之，募集8位年齡介於30-55歲之免疫力欠佳的成人為受試者，每日服用6 mL的本發明之刺果番荔枝發酵物，並分別於服用前、及服用28日後，分別將受試者血液中的人類外周血單核細胞以淋巴球分離液進行分離，並將該經分離的受試者血液以PBS調整至106 cells/mL後，用於前述qPCR分析以定量該人類外周血單核細胞中IL-10 基因的表現量。
依據圖13，顯示前述三組細胞中IL-10 基因之相對表現量；* 表示相比控制組為p＜ 0.05。其中，相比服用前控制組，服用本發明之刺果番荔枝發酵物後，受試者血液中IL-10 基因的表現量，比服用前顯著地提升13.5%，且改善率高達77.8% (結果未顯示)，此結果說明刺果番荔枝發酵物能藉由促進抗發炎細胞激素IL-10之合成而避免過度發炎造成的身體損傷。
綜上所述，上述實驗數據顯示經過特定發酵過程之刺果番荔枝發酵物具備促進膠原蛋白緊緻與抑制蛋白質醣化的功效。此外，透過基因調節，刺果番荔枝發酵物能增加抗老化、皮膚保濕、抗發炎、及先天免疫力相關蛋白質之產生，並且降低黑色素生成相關蛋白之形成。因此，對一個體施予有效量的刺果番荔枝發酵物有助於延緩皮膚老化現象，如皮膚鬆弛、乾燥、皺紋、及黑斑，甚至有益於延緩個體老化過程及提升個體免疫力，增進成人健康。因此，刺果番荔枝發酵物可用於製備抑緊緻肌膚及抗醣化之組合物，或可用於製備基因調節之組合物。該組合物可具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型，且可製成食品、飲品、營養補充劑、醫藥品、或保養品，藉由口服或局部施用方式給予一個體。
無。
圖1顯示含膠原蛋白固態膠體以刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物處理後的相對直徑(%)。 圖2顯示刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物對牛血清蛋白醣化的作用效果。 圖3顯示人類皮膚纖維母細胞以刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物處理24小時後，相對於控制組細胞的CCT6A 、CCT8 、PINK1 、TERT 、及TERC 基因的相對表現量。 圖4顯示人類外周血單核細胞以本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物處理24小時後，相對於控制組細胞的SMPD1 基因的相對表現量。 圖5顯示人類外周血單核細胞以本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物處理24小時後，相對於控制組細胞的MITF 基因的相對表現量。 圖6顯示人類單核細胞株以刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物處理24小時後，相對於控制組細胞的IL-10 基因的相對表現量。 圖7顯示人類單核細胞株以刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物處理24小時後，相對於控制組細胞的IL-18 基因的相對表現量。 圖8顯示刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物中總多酚含量。 圖9顯示受試者服用刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物第0週與第4週後，臉部肌膚的紫外線色斑數量。 圖10顯示受試者服用刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物第0週與第4週後，臉部肌膚的含水量。 圖11顯示受試者服用刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物第0週與第4週後，臉部肌膚的皺紋數量。 圖12顯示受試者服用刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物第0週與第4週後，血液中谷胱甘肽S轉移酶的活性。 圖13顯示受試者服用刺果番荔枝水萃取物或本發明一實施例之刺果番荔枝發酵物第0週與第4週後，血液中IL-10 基因的表現量。
無。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
無。

Claims (8)

  1. 一種刺果番荔枝發酵物於製備緊緻肌膚及抗醣化之組合物之用途，其中該刺果番荔枝發酵物係藉由以下步驟製得：(a)以水萃取一刺果番荔枝(Annona muricata)果實而獲得一刺果番荔枝水萃取物；(b)添加一釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)至該刺果番荔枝水萃取物及進行發酵以獲得一第一中間發酵物；(c)添加一胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)至該第一中間發酵物及進行發酵以獲得一第二中間發酵物；以及(d)添加一醋化醋酸桿菌(Acetobacter aceti)至該第二中間發酵物及進行發酵以獲得該刺果番荔枝發酵物。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該釀酒酵母進行發酵1至2天，該乳酸桿菌進行發酵1至2天，及該醋酸桿菌進行發酵4至6天。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該釀酒酵母的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.02%至0.5%，該乳酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.01至0.25%，及該醋酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的1%至10%。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該刺果番荔枝與水的重量比為1：2至1：5。
  5. 一種刺果番荔枝發酵物於製備基因調節之組合物之用途，其中該刺果番荔枝發酵物係藉由以下步驟製得：(a)以水萃取一刺果番荔枝(Annona muricata)果實而獲得一刺果番荔枝水萃取物；(b)添加一釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)至該刺果番荔枝水萃取物及進行發酵以獲得一第一中間發酵物； (c)添加一胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)至該第一中間發酵物及進行發酵以獲得一第二中間發酵物；以及(d)添加一醋化醋酸桿菌(Acetobacter aceti)至該第二中間發酵物及進行發酵以獲得該刺果番荔枝發酵物；且其中該基因調節係促進一編碼伴隨蛋白T複合體次單元6A(CCT6A)、伴隨蛋白T複合體次單元8(CCT8)、磷酸酶及張力蛋白同源物誘導激酶1(PINK1)、端粒酶反轉錄酶(TERT)、端粒酶核醣核酸組分(TERC)、鞘磷脂磷酸二酯酶1(SMPD1)、介白素-10(IL-10)、或介白素-18(IL-18)之基因的表現量，及/或抑制一編碼黑色素生成基因編碼小眼畸形相關轉錄因子(MITF)之基因的表現量。
  6. 如請求項5所述之用途，其中該釀酒酵母進行發酵1至2天，該乳酸桿菌進行發酵1至2天，及該醋酸桿菌進行發酵4至6天。
  7. 如請求項5所述之用途，其中該釀酒酵母的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.02%至0.5%，該乳酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的0.01至0.25%，及該醋酸桿菌的添加量為該刺果番荔枝水萃取物重量的1%至10%。
  8. 如請求項5所述之用途，其中該刺果番荔枝與水的重量比為1：2至1：5。
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Soheil Zorofchian Moghadamtousi et al. "Annona muricata (Annonaceae): A Review of Its Traditional Uses, Isolated Acetogenins and Biological Activities", Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 15625-15658; doi:10.3390/ijms160715625 Rajeswari et al., "Phytochemical and pharmacological properties of Annona muricata: a review", Int J Pharm Pharm Sci, Vol 4, Issue 2, 3-6. *

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