TWI817363B - 刺果番荔枝（Ａｎｎｏｎａ ｍｕｒｉｃａｔａ）發酵液之生物活性物質用於製備抑制黑色素生成以及提升人類單核白血球細胞抗氧化力之組合物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種生物活性物質用於製備提升人類單核白血球細胞抗氧化力之組合物之用途，其中生物活性物質係從刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液萃取並純化而得，且生物活性物質為式(II)至式(VIII)之化合物中的至少一者。
Description
本發明關於刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液用於製備抑制黑色素生成或提升免疫細胞抗氧化力之組合物之用途。
肌膚老化可以分為內源性和外源性。高達70%屬外源性衰老，而其最主要的誘因是紫外線所造成的光老化。舉例來說，肌膚可能會因為太陽光的紫外線照射而產生黑色素沉澱，使肌膚整體較為暗沈之老化狀態。另外，30%屬於內源性衰老，其中又以受到體內或攝取過多醣類食物所產生的醣化及氧化反應等因子為主。
然而，體內多餘的醣類和蛋白質結合後，會在體溫的加熱之下引起醣化反應，進而產生醣化蛋白及醣化終產物(Advanced Glycation Endproducts,AGEs)。醣化終產物會蓄積在身體裡面，造成氧化壓力，導致慢性發炎現象等免疫問題。
鑑於上述問題，本發明之一目的在於提供一種刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液或其生物活性物質用於製備抑制黑色素及或提升免疫細胞抗氧化力之組合物之用途。
在一些實施例中，一種生物活性物質用於製備提升免疫細胞抗氧化力之組合物之用途，其中生物活性物質係從刺果番荔枝發酵液萃取後純化而得，且生物活性物質為式(I)至式(VIII)之化合物中的至少一者。
在一些實施例中，一種生物活性物質用於製備抑制黑色素生成之組合物之用途，其中生物活性物質係從刺果番荔枝發酵液萃取後純化而得，且生物活性物質為式(I)、式(III)、式(V)、式(VI)、式(VII)及式(VIII)之化合物中的至少一者。
在一些實施例中，一種刺果番荔枝發酵液用於製備抑制黑色素生成之組合物之用途，其中刺果番荔枝發酵液是以水萃取刺果番荔
枝原料再經過複數菌種進行發酵後，再以溶劑進行分配層析而得。
綜上所述，任一實施例之刺果番荔枝發酵液或其生物活性物質，其具有抑制黑色素生成及/或提升免疫細胞抗氧化力之能力。
圖1為刺果番荔枝發酵液的分層液之黑色素含量檢測結果比較圖。
圖2為刺果番荔枝水萃取物之HPLC圖譜結果圖。
圖3為刺果番荔枝發酵液的分離部之HPLC圖譜結果圖。
圖4A為化合物01的1H-NMR圖譜。
圖4B為化合物01的ESIMS圖譜。
圖5A為化合物02的1H-NMR圖譜。
圖5B為化合物02的ESIMS圖譜。
圖6A為化合物03的1H-NMR圖譜。
圖6B為化合物03的ESIMS圖譜。
圖7A為化合物04的1H-NMR圖譜。
圖7B為化合物04的ESIMS圖譜。
圖8A為化合物05的1H-NMR圖譜。
圖8B為化合物05的ESIMS圖譜。
圖9A為化合物06的1H-NMR圖譜。
圖9B為化合物06的ESIMS圖譜。
圖10A為化合物07的1H-NMR圖譜。
圖10B為化合物07的ESIMS圖譜。
圖11A為化合物08的1H-NMR圖譜。
圖11B為化合物08的ESIMS圖譜。
圖12為生物活性物質的黑色素含量檢測結果比較圖。
圖13及圖14為生物活性物質的抗氧化試驗結果比較圖。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
本文所述「刺果番荔枝(Annona muricata)」是番荔枝科(Annonaceae)番荔枝屬(Annona)的常綠喬木，別名羅李亮果。刺果番荔枝果實呈心臟形且有芳香味，表面有刺狀突起，果肉可食用。
本文所述「刺果番荔枝原料」可以包括含有果皮的刺果番荔枝果肉/果實、未含有果皮的果肉/果實、含有籽或去籽的果肉/果實。其中，「刺果番荔枝原料」可為完整之果肉/果實、或者是經由剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之果肉/果實。並且，刺果番荔枝果肉/果實可以採用原始(即未經乾燥處理)或經乾燥處理後的果肉/果實。
本文中所述之「釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」、「胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)」以及「醋化醋酸桿菌(Acetobacter aceti)」分別意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易於獲得的釀酒酵母菌、胚芽乳酸桿菌以及醋化醋酸桿菌(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技術領域中所慣用的微
生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的釀酒酵母菌、胚芽乳酸桿菌以及醋化醋酸桿菌。
本文中所述的「wt%」係指重量百分比，而「vol%」係指體積百分比。
本文中所述的「白利糖度」是測量糖度的單位，代表在20℃情況下，每100克水溶液中溶解的糖克數。
在一些實施例中，刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液是藉由以下步驟而製得：a.以水萃取刺果番荔枝原料而獲得刺果番荔枝水萃取物；b.添加釀酒酵母菌至刺果番荔枝水萃取物，然後進行發酵以獲得第一中間發酵液；c.添加乳酸桿菌至第一中間發酵物，然後進行發酵以獲得第二中間發酵液；以及d.添加醋酸桿菌至第二中間發酵物，然後進行發酵以獲得一發酵原液。
在一些實施例中，步驟a可包括將刺果番荔枝原料與水混合以獲得一混合物以及在一萃取溫度下對獲得的混合物進行一既定時間的萃取。其中，既定時間為0.5至2小時。
於步驟a的一些實施例中，刺果番荔枝原料與水是以1：2至1：5之重量比進行混合。在一些實施例中，刺果番荔枝原料與水的重量比較佳為1：3。
於步驟a的一些實施例中，萃取溫度可介在60℃至100℃。
在一些實施例中，萃取溫度較佳可為80℃至95℃。
於步驟b的一些實施例中，釀酒酵母菌的添加量為刺果番荔枝水萃取物重量的0.02wt%至0.5wt%。
於步驟c的一些實施例中，乳酸桿菌的添加量為刺果番荔枝水萃取物重量的0.01wt%至0.25wt%。
於步驟d的一些實施例中，醋酸桿菌的添加量為刺果番荔枝水萃取物重量的1wt%至10wt%。
在一些實施例中，可先添加5wt%至15wt%葡萄糖至刺果番荔枝水萃取物中再以含糖的刺果番荔枝水萃取物進行步驟b。在一些實施例中，葡萄糖的添加量亦可為8wt%至10wt%。在一些實施例中，葡萄糖的添加量更佳可為8wt%。
在一些實施例中，所述刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液的製備方法可進一步包括以下步驟：e.以至少一溶劑對步驟d所得的發酵原液進行分配層析(即層析萃取)以獲得複數分離層。
在一些實施例中，步驟e使用的溶劑可為乙酸乙酯或正丁醇。
在一些實施例中，步驟e所得的分離層可具有抑制黑色素的作用。
應可理解的是，本文所述的「刺果番荔枝發酵液」可以是步驟d所得的發酵原液，或是步驟e所得的分離層。
在一些實施例中，步驟e所得的分離層可再經由一沖提液
進行純化以獲得下列式(I)至式(VIII)的化合物(即生物活性物質)。其中，純化所使用的沖提液可為甲醇或甲醇與水的混合溶液。
在一些實施例中，進行純化的分離層是以乙酸乙脂作為溶劑進行分配層析而得。
在一些實施例中，式(I)至式(VIII)之化合物可具有提升免疫細胞抗氧化力的作用。
在一些實施例中，式(I)至式(VIII)之化合物是透過抑制醣化終產物所導致的活性氧物質生成以達到提升免疫細胞抗氧化力的作用。
在一些實施例中，具有提升免疫細胞抗氧化力的生物活性物質的濃度可為250μg/mL。
在一些實施例中，具有提升免疫細胞抗氧化力的生物活性物質較佳可為乙酸酪醇酯或順式-香豆酸葡萄糖基酯。
在一些實施例中，式(I)、式(III)、式(V)、式(VI)、式(VII)及式(VIII)之化合物可具有抑制黑色素生成的作用。
在一些實施例中，具有抑制黑色素生成的生物活性物質的濃度可為250μg/mL。
在一些實施例中，所述組合物為醫藥組合物、可食用組合物、或保養品組合物。
在一些實施例中，當所述組合物為醫藥組合物時，此醫藥組合物包含有有效含量的刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液或/和由其所得的生物活性物質。
在一些實施例中，所述醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
在一些實施例中，所述醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。在一些實施例中，所述醫藥組合物可以選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal
injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
在一些實施例中，所述醫藥組合物可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
在一些實施例中，當所述組合物為可食用組合物時，此可食用組合物包含有有效含量的刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液或/和由其所得的生物活性物質。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或食品添加物(food additive)，意即利用習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，
食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。
在一些實施例中，所述食品產品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
在一些實施例中，當所述組合物為保養品組合物時，此保養品組合物包含有有效含量的刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液或/和由其所得的生物活性物質。在一些實施例中，此保養品組合物可為但不限於化妝水、凝膠、精華液、乳液、乳霜、洗臉或沐浴產品、防曬產品、美白產品、香膏、軟膏、面膜。
下列範例所用之溶劑，除了有特別註記說明外，則皆購自於台灣默克(Merck)公司。
例1：刺果番荔枝發酵液之製備
首先，將刺果番荔枝的完整果實洗淨及去皮，以研磨、攪碎等方式破碎去皮後的果實以獲得刺果番荔枝果泥，再將刺果番荔枝果泥與水依1：3之重量比混合並進行萃取步驟以獲得刺果番荔枝水萃取物。萃取步驟係於85±5℃進行0.5至2小時的浸提。接著，在刺果番荔枝水萃取物尚未回溫至室溫前，添加8wt%之葡萄糖至此刺果番荔枝水萃取物，使其pH值約為3.5±0.1及其白利糖度約為9.7。
待刺果番荔枝水萃取物冷卻至室溫後，進行三階段發酵。三階段發酵如下：
階段一：先添加刺果番荔枝水萃取物重量的0.02wt%至
0.5wt%之釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，所採用的菌株為國際寄存編號ATCC26602的菌株)於刺果番荔枝水萃取物中，於30±5℃進行發酵1至2天以獲得第一中間發酵物。
階段二：添加刺果番荔枝水萃取物重量的0.01wt%至0.25wt%之胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum，所採用的菌株為國際寄存編號DSM33108的菌株)於第一中間發酵物中，於30±5℃進行發酵1至2天以獲得第二中間發酵物。
階段三：添加刺果番荔枝水萃取物重量的1wt%至10wt%之醋化醋酸桿菌(Acetobacter aceti)於第二中間發酵物中，於35℃進行發酵4至6天以獲得第三中間發酵物。所採用的醋化醋酸桿菌為寄存於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection andResearch Center，BCRC)寄存編號BCRC11688的菌株。
接著，將此第三中間發酵物進一步於45℃至70℃進行減壓濃縮，並透過200至400目(mesh)之濾網過濾以移除殘餘固體物而得到粗產物。添加60wt%異麥芽寡糖於此粗產物中，使其白利糖度約為40±10，並將調整過白利糖度的粗產物置於95℃至120℃，進行滅菌70至90分鐘，最後得到發酵原液。
然後，將此發酵原液以純的乙酸乙酯(即不參雜其他溶劑的乙酸乙酯)進行液相-液相分配萃取，而得到二分離層(以下稱第一分離層與第二分離層)。其中，第一分離層為24.3公克(10%)的乙酸乙酯可溶部。接著，將第二分離層以純的正丁醇(即不參雜其他溶劑的正丁醇)進行液相-液相分配萃取，而得到二分離層(以下稱第三分離層與第四分離
層)。其中，第三分離層為41.5公克(17%)的正丁醇可溶部；第四分離層為178.3公克(73%)的水可溶部。
例2：黑色素含量檢測
材料與儀器：
1.細胞株：小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自美國典型培養物保存中心(American Type CμLtureCollection，ATCC®，No.6475)，以下簡稱B16F10細胞。
2.培養基：將DMEM改良培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，購自Gibco，Cat.12100-038)添加額外成分使其含有1vol%的抗生素溶液(Antibiotic Antimycotic Solution，購自Gibco，15240-062)及10vol% FBS(Fetal Bovine Serum，購自Gibco，10437-028)。
3.磷酸緩衝鹽溶液(以下簡稱PBS溶液)：購自Gibco，產品編號10437-028。
4.麴酸(Kojic acid)：購自Sigma-Aldrich，產品編號K3125-5G。
5.胰蛋白酶溶液：將10X Trypsin-EDTA(購自Gibco，產品編號15400-054)以PBS溶液稀釋10倍而得。
6.1N氫氧化鈉溶液：氫氧化鈉購自於Sigma-Aldrich，產品編號221465，以二次蒸餾水配製為1N濃度之氫氧化鈉溶液。
7.ELISA讀盤機：品牌BioTek，型號FLx800。
實驗步驟：
將B16F10細胞以1.5 x 105的每孔密度種入6孔培養盤中，
每一孔中加入3mL上述的新鮮培養基，於5% CO2，37℃環境下，培養24小時。
移除每孔的培養基。將B16F10細胞分為控制組、對照組、實驗組。控制組加入2mL的新鮮培養基。於對照組中，加入含有250μg/mL麴酸之新鮮培養基。由於麴酸已被廣泛認知為具有有效降低黑色素生成效果之物質，故作為本實驗的對照組。實驗組分成4組：於實驗組1加入含有0.25vol%例1的發酵原液之新鮮培養基；於實驗組2加入含有250μg/mL之例1的第一分離層的新鮮培養基；於實驗組3加入含有250μg/mL之例1的第三分離層的新鮮培養基；於實驗組4加入含有250μg/mL之例1的第四分離層的新鮮培養基。各組進行三重複，於37℃環境下，培養48小時。
將各組的培養基移除，並以PBS溶液清洗細胞兩次。接著，加入200μL之胰蛋白酶溶液對細胞作用3分鐘後，於每組細胞加入6mL的新鮮培養基終止反應。
收集每組的懸浮細胞與培養基於15mL離心管內，並以400g離心5分鐘使細胞沉澱。然後，將各組離心收集到的沉澱細胞以PBS溶液清洗兩次後，以去除管內殘餘的培養基。接著，加入200μL之PBS溶液讓細胞懸浮，並將各組的細胞懸浮放入液態氮冷凍10分鐘。之後，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。
將各組解凍後的細胞以12,000g離心30分鐘。接著，移除上清液，加入120μL之1N氫氧化鈉溶液讓細胞重新懸浮，並置於60℃下，乾浴1小時。最後，使用ELISA讀盤機測定各組的405nm吸光值。
以控制組所測得的405nm吸光值作為100%黑色素相對量(%)，其他各組以下列公式計算出各自的黑色素相對量。
黑色素相對量(%)=(各組405nm吸光值/控制組405nm吸光值)x 100%。
所得黑色素相對量以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定進行統計分析，其結果如圖1所示。圖1中每組數值為取自三次重複實驗的平均值±標準差。與控制組數值相比，計算出每組的p值。圖中「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
參閱圖1，對照組之黑色素相對量為57.5%；實驗組1之黑色素相對量為75.6%；實驗組2之黑色素相對量為49.7%；實驗組3之黑色素相對量為56.4%；實驗組4之黑色素相對量為64.7%。也就表示，經過麴酸處理，其對黑色素生成抑制率為42.5%；經過例1中的發酵原液處理，其黑色素生成抑制率為24.4%；經第一分離層、第三分離層及第四分離層處理，其對黑色素生成抑制率分別可達50.3%、43.6%、35.3%。由此可知，經第一分離層及第三分離層處理後，其對黑色素抑制效果皆與麴酸相似，甚至效果更佳。並且，經第一分離層、第三分離層以及第四分離層處理後，其對黑色素抑制效果也比經發酵原液處理者佳。也表示，第一分離層含有最多具有美白效果的生物活性物質，其次為第三分離層。基此，相較麴酸和發酵原液，經分配層析而得的刺果番荔枝發酵液具有更好的美白效果。
例3：生物活性物質的製備
將例1的第一分離層進行管柱層析(column chromatography)，所使用的管柱為葡聚糖凝膠(品牌Sephadex，產品編號：LH-20)，沖提液為甲醇，流速為5毫升/分鐘，每5分鐘收集一支收集管。於沖提過程中，以薄層層析(Thin layer chromatography,TLC)法觀察每支收集管中的沖提物狀態。於此，薄層層析法所使用之薄層層析片為德國商默克(Merck)公司之產品(產品名稱：TLC Silica gel 60 RP-18 F254s，產品編號：1.16835.0001)，使用的展開劑為甲醇(甲醇購自於台灣默克公司，產品編號：1.06018.4000)與純水。將每支收集管的沖提液分別以甲醇與純水配置的展開劑進行展開，展開劑配製5種比例，分別為甲醇與純水體積比1：9之溶液；甲醇與純水體積1：4之溶液；甲醇與純水體積比3：7之溶液；甲醇與純水體積比2：3之溶液；甲醇與純水體積比1：1之溶液，並於展開完成後以波長為254nm及365nm的紫外光燈進行結果觀測。
根據薄層層析片的展開結果，將具有相似展開結果的收集管合併，最後得到6個分離部，此些分離部分別命為EAF1、EAF2、EAF3、EAF4、EAF5、EAF6。
然後，將10μL之50mg/mL的EAF2至EAF6分別以逆向-高效能液相層析法(Reversed-phase high-performance liquid chromatography)進行沖提並分別收集各自的純化產物。於此，逆向-高效能液相層析法所使用的管柱為購自於美商Phenomenex Inc.公司(品牌LUNA®，產品編號00G-4252-N0)，其固定相為多孔矽膠，顆粒大小為5μm。所使用的儀器為美商安捷倫科技公司(Agilent
Technologies,Inc.)出產的高效能液相層析儀(產品名稱Agilent 1200series HPLC system)，沖提速度設定為2mL/min，沖提溫度為40℃。
於此，EAF2至EAF6所使用的沖提液有所不同。於EAF2中，使用的沖提液為甲醇：水之體積比為1：4之溶液；於EAF3中，使用的沖提液為甲醇：水之體積比為1：3之溶液；於EAF4中，使用的沖提液為甲醇：水之體積比為3：7之溶液；於EAF5中，使用的沖提液為甲醇：水之體積比為4：6之溶液；於EAF6中，使用的沖提液為甲醇：水之體積比為5：5之溶液。
由EAF2得到的HPLC圖譜顯示兩個明顯波鋒，並將每一個波鋒所對應時間點收集到的純化產物分別命名為純化產物-05與純化產物-06。
由EAF3得到的HPLC圖譜顯示一個明顯波鋒，並將此波鋒所對應時間點收集到的純化產物命名為純化產物-01。
由EAF4得到的HPLC圖譜顯示一個明顯波鋒，並將此波鋒所對應時間點收集到的純化產物命名為純化產物-07。
由EAF5得到的HPLC圖譜顯示兩個明顯波鋒，並將每一個波鋒所對應時間點收集到的純化產物分別命名為純化產物-02與純化產物-03。
由EAF6得到的HPLC圖譜顯示一個明顯波鋒，並將此波鋒所對應時間點收集到的純化產物命名為純化產物-04。
以HPLC分析每個純化產物(及其所含有的純化合物)對
應於發酵液的波峰位置，分析結果如下：將純化合物-01至純化合物-08的HPLC圖譜進行疊圖而得到刺果番荔枝發酵液的分離部之HPLC圖譜，如圖3所示。依每個明顯波峰於時間軸先後出現次序，依序標示：波峰5(即代表由EAF2得到的純化產物-05)，波峰1(即代表由EAF3得到的純化產物-01)，波峰6(即代表由EAF2得到的純化產物-06)，波峰2(即代表由EAF5得到的純化產物-02)，波峰7(即代表由EAF4得到的純化產物-07)，波峰3(即代表由EAF5得到的純化產物-03)，波峰4(即代表由EAF6得到的純化產物-04)。
另外，將例1的刺果番荔枝水萃取物也進行如前述之逆向-高效能液相層析法進行分析，用以與刺果番荔枝發酵液的分離部之HPLC圖譜(圖3)作參照比對。於此層析過程中，採用前述之儀器、管柱、分析樣品濃度、沖提速度及溫度，在此不再累述。當沖提時間為0~10分鐘時，沖提液為甲醇：水之體積比為2：98之溶液；沖提時間為10~40分鐘時，沖提液由甲醇：水之體積比為2：98之溶液，線性變化至甲醇：水之體積比為70：30之溶液；沖提時間為40~50分鐘時，沖提液由甲醇：水之體積比為70：30之溶液，線性變化至甲醇：水之體積比為100：0之溶液；沖提時間為50~60分鐘時，沖提液為甲醇：水之體積比為100：0之溶液。
依據刺果番荔枝發酵液的分離部之HPLC圖譜(圖3)中所標示的明顯波峰之時間點，於刺果番荔枝水萃取物之HPLC圖譜上標示相同時間點所對應的波峰號碼，其結果如圖2所示。
請參閱圖2和圖3，由於刺果番荔枝水萃取物之HPLC圖譜
(圖2)和刺果番荔枝發酵液的分離部之HPLC圖譜(圖3)都有明顯波峰1、波峰5、波峰6及波峰7。也就表示，刺果番荔枝水萃取物和刺果番荔枝發酵液皆含有純化產物-01、純化產物-05、純化產物-06、及純化產物-07。
其中，於圖2的HPLC圖譜結果中，波峰1之面積數值為122150mAU；於圖3的HPLC圖譜結果中，波峰1之面積數值為892412mAU。由此可知，純化產物-01在刺果番荔枝發酵液的含量為在刺果番荔枝水萃取物含量的7.3倍。而波峰2、波峰3及波峰4僅出現於刺果番荔枝發酵液的分離部之HPLC圖譜(圖3)。也就表示，純化產物-02、純化產物-03及純化產物-04僅出現於刺果番荔枝發酵液。換言之，三階段發酵過程會產生純化產物-01、純化產物-02、純化產物-03及純化產物-04。基此，可知刺果番荔枝發酵液所含的生物活性物質不同於刺果番荔枝水萃取物所含的生物活性物質。
此外，將前述所得到的純化產物-01至純化產物-07進行氫-核磁共振光譜(1H-NMR)以及電噴灑離子化質譜(ESIMS)分析其化學結構。所使用的儀器為德國商Bruker公司生產的核磁共振光譜儀(產品名稱AscendTM400 MHz Spectrometer)，以及質譜儀串聯質譜-二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜(產品名稱Bruker amaZon SL)。根據此分析結果，各自純化產物所含物質確認如下。
1.純化產物-01為化合物01，其為如式(I)所示之酪醇(Tyrosol)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.02(2H,d,J=8.5Hz),6.69(2H,d,J=8.5Hz),3.68(2H,t,J=7.2Hz),2.71(2H,t,J=7.2Hz)。
高解析ESIMS-(-)結果為137.0612([M-H]-，分子式為C8H10O2，陰離子分子量理論值為137.0608)。化合物01的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖4A、圖4B所示。
2.純化產物-02為化合物02，其為如式(II)所示之乳酸酪醇酯(Tyrosol lactate)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.04(2H,d,J=8.5Hz),6.71(2H,d,J=8.5Hz),4.40-4.25(2H,m),4.22(1H,q,J=7.0Hz),2.84(2H,t,J=6.5Hz),1.30(3H,d,J=7.0Hz)。
高解析ESIMS-(-)結果為209.0822([M-H]-，分子式為C11H14O4，陰離子分子量理論值為209.0819)。化合物02的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖5A、圖5B所示。
3.純化產物-03為化合物03，其為如式(III)所示之乙酸酪醇酯(Tyrosolacetate)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.02(2H,d,J=8.5Hz),6.70(2H,d,J=8.5Hz),4.18(2H,t,J=7.1Hz),2.80(2H,t,J=7.1Hz),1.99(3H,s)。
高解析ESIMS-(-)結果為179.0723([M-H]-，分子式為C10H12O3，陰離子分子量理論值為179.0714)。化合物03的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖6A、圖6B所示。
4.純化產物-04為化合物04，其為如式(IV)所示之乳酸-2-苯乙醇酯(2-phenylethyllactate)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.30-7.15(5H,m),4.40-4.25(2H,m),4.21(1H,q,J=6.9Hz),2.94(2H,t,J=6.8Hz),1.28(3H,d,J=6.8Hz)。
高解析ESIMS-(+)結果為195.1012([M+H]+，分子式為C11H14O3，陽離子分子量理論值為195.1016)。化合物04的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖7A、圖7B所示。
5.純化產物-05為化合物05，其為如式(V)所示之3-(4-羥基苯基)乳酸(或稱3-對羥基苯乳酸)(3-(4-hydroxyphenyl)-lactic acid)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.07(2H,d,J=8.5Hz),6.69(2H,d,J=8.5Hz),4.24(1H,dd,J=7.6,4.5Hz),2.99(1H,dd,J=13.9,4.5Hz),2.79(1H,dd,J=13.9,7.6Hz)。
高解析ESIMS-(-)結果為181.0498([M-H]-，分子式為C9H10O4，陰離子分子量理論值為181.0506)。化合物05的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖8A、圖8B所示。
6.純化產物-06為化合物06，其為如式(VI)所示之對-羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)。
1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.89(2H,d,J=8.8Hz),6.83(2H,d,J=8.8Hz)。
高解析ESIMS-(-)結果為137.0233([M-H]-，分子式為C7H6O3，陰離子分子量理論值為137.0244)。化合物06的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖9A、圖9B所示。
7.純化產物-07含有化合物07與化合物08：化合物07為如式(VII)所示之反式-香豆酸葡萄糖基酯(trans-p-coumaric acid glucosyl eater)。化合物08為如式(VIII)所示之順式-香豆酸葡萄糖基酯(cis-p-coumaric acid glucosyl eater)。
化合物07的1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.72(1H,d,J=15.8Hz),7.49(2H,d,J=8.7Hz),6.82(2H,d,J=8.7Hz),6.37(1H,d,J=15.8Hz),5.57(1H,d,J=7.8Hz),3.84(1H,dd,J=10.8,2.2Hz),3.68(1H,dd,J=10.8,4.7Hz),3.50-3.25(4H,m)。
化合物07的高解析ESIMS-(-)結果為325.0930([M-H]-，分子式為C15H18O8，陰離子分子量理論值為325.0929)。化合物07的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖10A、圖10B所示。
化合物08的1H-NMR(400MHz,MeOH-d4)結果為：7.73(2H,d,J=9.0Hz),6.95(1H,d,J=12.6Hz),6.75(2H,d,J=9.0Hz),5.81(1H,d,J=12.6Hz),5.54(1H,d,J=8.0Hz),3.85(1H,brd,J=12.0Hz),3.68(1H,dd,J=12.0,4.6Hz),3.50-3.30(4H,m)。
化合物08的高解析ESIMS-(-)結果為325.0930([M-H]-，分子式為C15H18O8，陰離子分子量理論值為325.0929)。化合物08的1H-NMR圖譜和ESIMS圖譜如圖11A、圖11B所示。
綜合前述對圖2和圖3的HPLC圖譜分析結果與化合物01至化合物08的氫-核磁共振光譜(1H-NMR)結果，進一步可知，相較於刺果番荔枝水萃取物，刺果番荔枝發酵液含有豐富的苯乙醇(2-phenylethyl alcohol,PEA)類化合物，其為酪醇(即化合物01)、乳酸酪醇酯(即化合物02)、乙酸酪醇酯(即化合物03)及乳酸-2-苯乙醇酯(即化合物04)。其
中，刺果番荔枝發酵液中的酪醇(即化合物01)含量為刺果番荔枝水萃取物含量的7.3倍。另外，乳酸酪醇酯(即化合物02)、乙酸酪醇酯(即化合物03)及乳酸-2-苯乙醇酯(即化合物04)等生物活性物質皆未見於為發酵前的刺果番荔枝水萃取物，代表此三種化合物需要經過三階段發酵過程才會生成。
例4：生物活性物質的黑色素含量檢測
於此範例中，採用如前述例2中的黑色素含量檢測方式，使用相同的材料與儀器、實驗步驟以及各組的黑色素相對量之計算方式，在此不再累述。
將B16F10細胞分為控制組、對照組、實驗組。控制組加入2mL的新鮮培養基。於對照組中，加入含有250μg/mL麴酸之新鮮培養基。實驗組則分成8組，分別加入含有20μg/mL之例3的化合物01至化合物08(分別對應於實驗組1至實驗組8)之新鮮培養基。各組進行三重複，於37℃環境下，培養24小時。控制組、對照組與實驗組1、3、5、6、7、8所測得之黑色素相對量如圖12所示。
請參閱圖12，對照組之黑色素相對量為71.2%；實驗組1之黑色素相對量為77.9%；實驗組3之黑色素相對量為85.9%；實驗組5之黑色素相對量為81.2%；實驗組6之黑色素相對量為77.4%；實驗組7之黑色素相對量為75.3%；實驗組8之黑色素相對量為76.8%。也就表示，經過麴酸處理，其對黑色素生成抑制率為28.8%；經過化合物01、03、05、06、07、08處理，其對黑色素生成抑制率分別為22.1%、14.1%、18.8%、22.6%、24.7%、23.2%。其中，化合物01、03、05、06、07、
08的濃度(20μg/mL)僅要麴酸的濃度(250μg/mL)的十分之一，甚至更少，即可達到如麴酸抑制黑色素生成效果。換言之，化合物01、03、05、06、07、08的美白功效優於麴酸的美白功效。亦即，刺果番荔枝發酵液中含有具有美白功效的生物活性物質，具體而言，此些生物活性物質為酪醇(即化合物01)、乙酸酪醇酯(即化合物03)、3-(4-羥基苯基)乳酸(即化合物05)、對-羥基苯甲酸(即化合物06)、反式-香豆酸葡萄糖基酯(即化合物07)及順式-香豆酸葡萄糖基酯(即化合物08)。
例5：生物活性物質的抗氧化試驗
材料與儀器：
1.細胞株：人類單核白血球細胞THP-1(生物資源保存及研究中心，編號No.60430)，以下簡稱THP-1細胞。
2.培養基：添加有RPMI培養基(RPMI medium 1640，購自Gibco)、10vol%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，購自Gibco)及2g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate，購自Sigma-Aldrich)。
3.醣化終產物溶液：以PBS溶液配置含有3mg/mL的胎牛膠原蛋白(Bovine Collagen；購自Sigma-Aldrich，產品型號C2124)及0.2M的葡萄糖溶液之反應溶液，並在60℃烘箱反應四天，以得到醣化終產物溶液。
4.DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883，購自Sigma-Aldrich)溶於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma-Aldrich，產品編號SI-D6883-50MG)以配製為濃度5mg/mL的CFH-DA溶液。
5.胰蛋白酶溶液：將10X Trypsin-EDTA(購自Gibco，產品編號15400-054)以PBS溶液稀釋10倍而得。
6.流式細胞儀(Flow cytometry)：購自Beckman，產品編號No.660519。
實驗流程：
將THP-1細胞以1.5 x 105的每孔密度種入6孔培養盤中，每一孔中加入2mL上述的新鮮培養基，於5%CO2，37℃環境下，培養24小時。
移除培養基。將THP-1細胞分為控制組、對照組、實驗組。控制組與對照組分別加入2mL的新鮮培養基。實驗組分成8組，於每一實驗組分別加入含有20μg/mL之例3中的化合物01至化合物08(分別對應於實驗組1至實驗組8)之新鮮培養基。各組進行三重複，於37℃環境下，培養1小時。
接著，於對照組與各實驗組的培養盤孔中，加入130μL之醣化終產物溶液，繼續培養3小時。也就表示，控制組為不經過任一之化合物01至化合物08以及醣化終產物處理；對照組為經過醣化終產物處理；各個實驗組則經過任一之化合物01至化合物08以及醣化終產物處理。
移除培養基，取2μL的DCFH-DA溶液加入每孔中的培養基，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。然後，以PBS溶液清洗細胞兩次後，加入200μL的胰蛋白酶溶液於每孔中，並至於暗室反應5分鐘。最後，加入6mL的新鮮培養基以終止反應。
收集每組的懸浮細胞與培養基於離心管內，並以400g離心5分鐘使細胞沉澱。移除上清液，再將各組離心收集到的沉澱細胞以PBS溶液清洗後離心，重複此步驟兩次，以去除管內殘餘的培養基。接著，於暗室加入1mL之PBS溶液讓細胞懸浮，以得到各組的待測樣本。
使用流式細胞儀偵測各組的待測樣本中DCFH-DA的螢光信號。所設定的激發波長為450nm至490nm，接收波長為510nm至550nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH(二氯二氫螢光素)，再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF(二氯螢光素)。因此，經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。
以控制組所測得數字作為100%之活性氧物質相對生成量，分別將對照組、實驗組所測數值換算為活性氧物質相對生成量(%)。所得結果再以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定進行統計分析，其結果如圖13所示。圖13中每個數值為取自三次重複實驗的平均值±標準差。與對照組數值相比，計算出每組的p值。圖中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
當蛋白質經醣化反應後將生成多種醣化終產物(Advanced glycation end products,AGEs)，其為不可還原之物質。通常人體可透過使抗氧化物與酵素進行反應，代謝掉此些AGEs。而若身體產生過多的AGEs，或由外部攝取而在身體中累積過多的AGEs，則會造成體內累
積過多這類有毒物質並改變及影響蛋白質的正常功能，進而引起氧化壓力上升及發炎反應，甚至誘發老化或使慢性疾病惡化。
請參閱圖13，對照組之活性氧物質之相對生成量為824.7%；實驗組1之活性氧物質之相對生成量為687.6%；實驗組2之活性氧物質之相對生成量為551.5%；實驗組3之活性氧物質之相對生成量為400%；實驗組4之活性氧物質之相對生成量為684.5%。請參閱圖14，對照組之活性氧物質之相對生成量為402.9%；實驗組5之活性氧物質之相對生成量為329.2%；實驗組6之活性氧物質之相對生成量為306.3%；實驗組7之活性氧物質之相對生成量為323.7%；實驗組8之活性氧物質之相對生成量為288.6%。也就表示，相較於未經過醣化終產物處理之控制組，經過醣化終產物處理後，對照組之細胞內的活性氧物質之相對生成量會大幅增加，顯示醣化終產物會導致細胞內產生活性氧物質，進而對人類單核白血球細胞產生傷害。需特別說明的是，圖13與圖14中所使用的THP-1細胞二者在其代數之間相差12代，且圖14(亦即實驗組5至實驗組8)中所使用的THP-1細胞較為年輕。而本案所屬技術領域中具有通常知識者均可得知的是，較年輕的THP-1細胞中會含有較年老的THP-1細胞中更少的活性氧物質，因此，圖14中所示THP-1細胞(較年輕)的活性氧物質之相對生成量會相對低於圖13中所示THP-1細胞(較年老)的活性氧物質之相對生成量，而不會影響其實驗趨勢及比較結果。
另一方面，相較於經過醣化終產物處理之對照組，經過例2的化合物01至化合物08任一者處理後，實驗組1至實驗組8之細胞內的活性氧物質之相對生成量皆會降低。其中，又以經過化合物03和化合物
08(分別對應至實驗組3和實驗組8)處理所達到的抑制生活性氧物質生成效果較佳(具有統計上的顯著差異)。換言之，刺果番荔枝發酵液或其生物活性物質可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，刺果番荔枝發酵液或其生物活性物質可透過抑制醣化終產物所導致的活性氧物質生成以達到免疫細胞抗氧化能力。具體而言，此些生物活性物質為酪醇(即化合物01)、乳酸酪醇酯(即化合物02)、乙酸酪醇酯(即化合物03)、乳酸-2-苯乙醇酯(即化合物04)、3-(4-羥基苯基)乳酸(即化合物05)、對-羥基苯甲酸(即化合物06)、反式-香豆酸葡萄糖基酯(即化合物07)及順式-香豆酸葡萄糖基酯(即化合物08)。其中，又以乙酸酪醇酯(即化合物03)和順式-香豆酸葡萄糖基酯(即化合物08)具有較佳的免疫細胞抗氧化之效果。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (6)
- 一種生物活性物質用於製備提升人類單核白血球細胞抗氧化力之組合物之用途，其中該生物活性物質係從一刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液依序以乙酸乙酯及甲醇水溶液萃取後純化而得，該刺果番荔枝發酵液是藉由以下步驟而製得：a.以水萃取一刺果番荔枝原料而獲得一刺果番荔枝水萃取物；b.添加0.02wt%至0.5wt%的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，其寄存編號為ATCC26602)至該刺果番荔枝水萃取物然後進行發酵以獲得一第一中間發酵液；c.添加0.01wt%至0.25wt%的胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum，其寄存編號為DSM33108)至該第一中間發酵物然後進行發酵以獲得一第二中間發酵液；以及d.添加1wt%至10wt%的醋酸桿菌(Acetobacter aceti，其寄存編號為BCRC11688)至該第二中間發酵物然後進行發酵以獲得該刺果番荔枝發酵液；且該生物活性物質為式(II)至式(VIII)之化合物中的至少一者：
- 如請求項1所述之用途，其中該組合物係透過抑制醣化終產物所導致的活性氧物質生成以達到提升免疫細胞抗氧化力。
- 如請求項1所述之用途，其中該生物活性物質為乙酸酪醇酯或順式-香豆酸葡萄糖基酯。
- 一種生物活性物質用於製備抑制黑色素生成之組合物之用途，其中該生物活性物質係從一刺果番荔枝(Annona muricata)發酵液依序以乙酸乙酯及甲醇水溶液萃取後純化而得，該刺果番荔枝發酵液是藉由以下步驟而製得：a.以水萃取一刺果番荔枝原料而獲得一刺果番荔枝水萃取物；b.添加0.02wt%至0.5wt%的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，其寄存編號為ATCC26602)至該刺果番荔枝水萃取物然後進行發酵以獲得一第一中間發酵液；c.添加0.01wt%至0.25wt%的胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum，其寄存編號為DSM33108)至該第一中間發酵物然後進行發酵以獲得一第二中間發酵液；以及 d.添加1wt%至10wt%的醋酸桿菌(Acetobacter aceti，其寄存編號為BCRC11688)至該第二中間發酵物然後進行發酵以獲得該刺果番荔枝發酵液；且該生物活性物質為式(III)、式(V)、式(VI)、式(VII)及式(VIII)之化合物中的至少一者：
- 如請求項1或4所述之用途，其中該生物活性物質濃度為250μg/mL。
- 如請求項1或4所述之用途，其中該組合物為一醫藥組合物、一可食用組合物、或一保養品組合物。
Priority Applications (1)
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| TW111106654A TWI817363B (zh) | 2022-02-23 | 2022-02-23 | 刺果番荔枝（Ａｎｎｏｎａ ｍｕｒｉｃａｔａ）發酵液之生物活性物質用於製備抑制黑色素生成以及提升人類單核白血球細胞抗氧化力之組合物之用途 |
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| TW111106654A TWI817363B (zh) | 2022-02-23 | 2022-02-23 | 刺果番荔枝（Ａｎｎｏｎａ ｍｕｒｉｃａｔａ）發酵液之生物活性物質用於製備抑制黑色素生成以及提升人類單核白血球細胞抗氧化力之組合物之用途 |
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| TW202333760A TW202333760A (zh) | 2023-09-01 |
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ID=88927419
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| TW (1) | TWI817363B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW202108159A (zh) * | 2019-05-20 | 2021-03-01 | 大江生醫股份有限公司 | 刺果番荔枝發酵物於製備緊緻肌膚、抗醣化、及基因調節之組合物之用途 |
-
2022
- 2022-02-23 TW TW111106654A patent/TWI817363B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| TW202108159A (zh) * | 2019-05-20 | 2021-03-01 | 大江生醫股份有限公司 | 刺果番荔枝發酵物於製備緊緻肌膚、抗醣化、及基因調節之組合物之用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 網路文獻 en, K.C et al., Tyrosol and Its Analogues Inhibit Alpha-Melanocyte-Stimulating Hormone Induced Melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences, 2013. 14(12), 23420–23440. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24287915/ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202333760A (zh) | 2023-09-01 |
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