TWI804771B

TWI804771B - 咖啡櫻桃萃取物用於抵抗及/或減緩膠原蛋白醣化終產物生成之用途

Info

Publication number: TWI804771B
Application number: TW109139602A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 李姿儀
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2023-06-11
Also published as: CN112843136A; US20230263722A1; US20210137826A1; US20230240974A1; TW202118505A; CN112843097A; US12076435B2; TWI809328B; TW202118501A; TWI801770B; TW202118481A; TWI815058B; TW202118502A; CN112843106A; CN112843139A

Abstract

一種咖啡櫻桃萃取物之用途，其是用於製備改善肌膚之用途。其中，該咖啡櫻桃萃取物是由含水之溶劑進行萃取。

Description

咖啡櫻桃萃取物用於抵抗及/或減緩膠原蛋白醣化終產物生成之用途

本發明涉及一種咖啡櫻桃萃取物的用途，特別是關於咖啡櫻桃萃取物用於製備改善肌膚之用途。其中，該改善肌膚之用途包含肌膚抗氧化能力之提升、抗醣化能力之提升、肌膚緊緻之提升、肌膚保濕、肌膚玻尿酸分泌量之提升、肌膚彈性、肌膚膠原蛋白密度之提升、肌膚彈性、淡化肌膚斑點、緊緻肌膚毛孔、肌膚美白、肌膚皺紋與紋理之撫平。

咖啡櫻桃為小果咖啡(學名：Coffea arabica)之果實。小果咖啡又稱為阿拉伯咖啡、阿拉比卡咖啡，屬大灌木或小喬木，為茜草科(Rubiaceae)咖啡屬的一個物種，原產於東非。因於西元15世紀以前，咖啡長期被阿拉伯世界所壟斷，因此被歐洲人稱為「阿拉伯咖啡」。

小果咖啡所結的果實成熟後為紅色，因為其外觀類似櫻桃，因而有「咖啡櫻桃」之稱呼。而小果咖啡中最有經濟價值的部位為其果實內的種子。在去除果皮、果肉等外部構造，進行各式各樣特殊發酵處理與烘乾，乾燥後的咖啡豆就是人們稱的「咖啡生豆」。目前小果咖啡仍然是最主要的咖啡品種，約占世界咖啡總產量的60%。

被去除的咖啡櫻桃果皮及果肉時常被咖啡產業業者當作廢棄物丟去，相當可惜。因此，為了更積極提升咖啡櫻桃的開發與應用，故而提出一種咖啡櫻桃萃取物及改善肌膚之組合物，其可應用於製備肌膚抗氧化能力之提升、抗醣化能力之提升、肌膚緊緻之提升、肌膚保濕、肌膚玻尿酸分泌量之提升、肌膚彈性、肌膚膠原蛋白密度之提升、肌膚彈性、淡化肌膚斑點、緊緻肌膚毛孔、肌膚美白、肌膚皺紋與紋理之撫平之組合物的用途。

當人體攝取過多的糖分，體內多餘的糖份增加，並與血液中蛋白質結合產生促進皮膚老化的物質--醣化終產物(Adavanced Glycation Endproducts,AGEs)。隨年齡增長及飲食習慣，醣化終產物會於體內長期累積，造成膠原蛋白及蛋白質受損，導致膠原蛋白硬化，進而產生肌膚斑點、造成肌膚鬆弛、降低肌膚機能。一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以抑制最終醣化蛋白(Adavanced Glycation Endproducts,AGEs)之生成。在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以提升肌膚之抗醣化能力。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可透過提升肌膚之抗醣化能力以達到維持皮膚緊緻功效。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以維持肌膚緊緻，且其中該咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以清除細胞中自由基，其中該咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。在一些實施例中，該細胞為皮膚細胞。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以降低自由基對肌膚細胞之破壞，以達到提升肌膚抗氧化能力之用途。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以抑制、減緩或降低細胞內自由基或過氧化物之形成。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以促進肌膚內生性玻尿酸之分泌。在一些實施例中，其中該內生性玻尿酸之分泌可維持肌膚彈性及肌膚保濕。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物係透過保濕相關基因表現量之提升以達到促進肌膚內生性玻尿酸之分泌。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物係透過保濕相關基因表現量之提升以達到肌膚保濕之功效。

在一些實施例中，保濕相關基因包含HAS2基因(Gene ID：3037)、HAS3基因(Gene ID：3038)、KRT1基因(Gene ID：3848)、KRT14基因(Gene ID：3861)、AQP3基因(Gene ID：360)、GBA基因(Gene ID：2629)及FLG基因(Gene ID：2312)。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物係透過維持角質細胞排列以抵抗肌膚水分流失，進而達到肌膚保濕之效果。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可用於製備提升肌膚含水量之組合物之用途，其中該咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物的濃度為0.25mg/mL上。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物的白利糖度(Degrees Brix)值為10以上。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備改善肌膚狀態的組合物之用途，其中咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備增加肌膚膠原蛋白密度之組合物之用途，其中咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備增加肌膚彈性之組合物之用途，其中咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備減少肌膚皺紋之組合物之用途，其中咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備改善肌膚紋理之組合物之用途，其中咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備淡化肌膚斑點之組合物之用途，其中咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。在一些實施例中，該肌膚斑點包含UV斑點。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備肌膚美白之組合物之用途，咖啡櫻桃萃取物係以含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物用於製備緊緻肌膚毛孔之組合物之用途，咖啡櫻桃萃取物係以含水之溶劑進行萃取。

圖1是一實施例的咖啡櫻桃萃取物製備方法流程圖。

圖2是範例四中實驗組與控制組之最終醣化蛋白相對生成量比例圖。

圖3是範例五中實驗組及控制組受最終醣化蛋白刺激後抑制自由基生成量圖。

圖4是範例六中實驗組及控制組受最終醣化蛋白刺激後抑制肌膚緊緻度下降之比例圖。

圖5是範例七中實驗組及控制組的HAS2基因與HAS3基因表現量比例圖。

圖6是範例七中實驗組及控制組的KRT1基因與KRT14基因表現量比例圖。

圖7是範例七中實驗組及控制組的APQ3基因表現量比例圖。

圖8是範例七中實驗組及控制組的GBA基因表現量比例圖。

圖9是範例七中實驗組及控制組的FLG基因表現量比例圖。

圖10是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚含水量比例圖。

圖11是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚膠原蛋白密度比例圖。

圖12是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚彈性比例圖。

圖13是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚皺紋比例圖。

圖14是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚紋理比例圖。

圖15是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚斑點比例圖。

圖16是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚白皙度比例圖。

圖17是範例九中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚含水量比例圖。

圖18是範例九中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚彈力比例圖。

圖19是範例九中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚毛孔比較比例圖。

圖20是範例九中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚斑點比較比例圖。

圖21是範例九中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚UV斑比較比例圖。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以學生t檢驗(student’s t-test)進行分析。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。

本文中之「wt%」係指重量百分比，而「vol%」係指體積百分比。

如本文中所使用，術語「萃取物」係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現。

如本文所用「咖啡櫻桃原料」通常係指植物種子、含皮之種子或種皮，其中種子可包含原始、經乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之種子，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之種子。

參考圖1。在一些實施例中，一種咖啡櫻桃萃取物，其是由一種含水之溶劑對咖啡櫻桃原料進行萃取。在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物(coffee cherry extract)係將咖啡櫻桃原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S04、及濃縮程序S05後得到。

在一些實施例中，咖啡櫻桃原料可以是去皮或含皮的小果咖啡果實。在一些實施例中，咖啡櫻桃原料可以是小果咖啡之果皮。在一些實施例中，咖啡櫻桃原料可以是新鮮或乾燥的小果咖啡果實。

在一些實施例中，粉碎程序S01是指將咖啡櫻桃原料攪打至分裂為粉狀。舉例而言，粉碎可以採用果汁機、調理機或均質機。

在一些實施例中，加熱程序S02是指將粉狀的咖啡櫻桃原料與含水之溶劑混合後加熱一段固定時間。在一些實施例中，加熱是指將咖啡櫻桃原料與含水之溶劑的溫度提升到50℃~100℃。在一些實施例中，一段固定時間是指0.5小時到3小時。舉例而言，將咖啡櫻桃原料與含水之溶劑的溫度提升到85℃進行提取1小時。

在一些實施例中，加熱程序S02中的重量比例(含水之溶劑：咖啡櫻桃原料)為5：1~20：1。舉例而言，含水之溶劑：咖啡櫻桃原料為10：1。

舉例而言，採用90公斤重的咖啡櫻桃原料、900公斤重的水及0.63公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到100℃，並維持100℃持續0.5小時。舉例而言，採用90公斤重的咖啡櫻桃原料、900公斤重的水及0.7公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到85℃，並維持85℃持續1小時。

在一些實施例中，過濾程序S04是指將加熱後(或降溫後)的咖啡櫻桃原料及溶劑通過篩網以將溶劑內的固體濾除形成過濾液。舉例而言，篩網可以是400網目(mesh)的篩網。

在一些實施例中，加熱程序S02與過濾程序S04之間還包括降溫程序S03，降溫程序S03是指將加熱後的咖啡櫻桃原料及溶劑靜置以自然降溫至室溫。

在一些實施例中，濃縮程序S05是指將過濾程序S04所得到的過濾液進行減壓濃縮(廠牌/型號：BUCHI-Rotavapor R-100)以得到初萃液。在一些實施例中，濃縮程序S05所得的初萃液可即為咖啡櫻桃萃取物。在濃縮程序S05的一些實施例中，在40℃~70℃之間進行減壓濃縮。舉例而言，咖啡櫻桃萃取物是將咖啡櫻桃原料依序進行粉碎程序 S01、加熱程序S02、過濾程序S04及濃縮程序S05後得到。

在一些實施例，咖啡櫻桃萃取物用於製備抗醣化組合物之用途，且咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物用於製備抗氧化組合物之用途，且咖啡櫻桃萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，抗氧化係指減緩或防止氧化作用。而氧化係是一種使電子自物質轉移至氧化劑的化學反應，過程中可生成自由基，進而啟動鏈反應。當鏈反應發生於細胞中，細胞易受到破壞或凋亡。在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物能去除自由基，終止連鎖反應並且抑制其它氧化反應。在一些實施例中，自由基之產生係因為光照、化學物質、或生物體自然衰老之過程中所產生。在一些實施例中，前述化學物質包含醣化終產物。

如前所述，超氧化物(Superoxide Anion)與過氧化氫(Hydrogen Peroxide)等自由基會導致皮膚細胞受損。其中，咖啡櫻桃萃取物能降低去除自由基，舉例而言，其可促進SOD相關基因之表現，提升其所轉錄出的蛋白質(超氧化物歧化酶)，進而增加超氧化物分解為過氧化氫的量。

在一些實施例中，0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可提升氧化相關基因的表現量，藉以清除體內自由基，達到抗氧化之功效。

在一些實施例中，白利糖度(Degrees Brix)值為10以上的咖啡櫻桃萃取物可提升氧化相關基因的表現量，藉以清除體內自由基，達到抗氧化之功效。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以製備肌膚美白及/或提升肌膚光澤之組合物。

肌膚之所以會呈現較深的顏色係因黑色素之生成，而在黑色素生成的過程中，酪胺酸酶(Tyrosinase)佔據舉足輕重之地位。酪胺酸酶是一種氧化酶，係調控黑色素生成的限速酶。具體而言，酪胺酸酶參與了黑色素合成的兩個反應：(1)將單酚羥基化為二酚，(2)將鄰二酚氧化為鄰二醌。酪胺酸酶係存在於皮膚黑色素細胞中，係由TYR基因轉錄所形成。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以透過抑制酪胺酸酶之形成以達到抑制、預防或減緩肌膚黑色素之形成，進而達到肌膚美白及/或提升肌膚光澤之功效。

在一些實施例中，濃度為0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可以用於提升肌膚光澤及/或提升肌膚之白皙程度。

在一些實施例中，濃度為0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可以用於淡化肌膚斑點。在一些實施例中，該肌膚斑點為紫外線所造成之斑點。在一些實施例中，該肌膚斑點包含肌膚表層之斑點以及肌膚深層之斑點。

在一些實施例中，白利糖度(Degrees Brix)值為10以上的咖啡櫻桃萃取物可以用於提升肌膚光澤及/或提升肌膚之白皙程度。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以製備用於肌膚保濕組合物之用途，其中該咖啡櫻桃萃取物係以含水之相關溶劑進行萃取所得，且其中該咖啡櫻桃萃取物係透過提升保濕相關基因之表現量以達到該肌膚保濕之效果。

在日常活動中，肌膚容易因為天氣、外在環境、甚或自身自然衰老的情況下，造成肌膚之水分散失。而此散失會因肌膚表皮細胞間之縫隙較大而加速，進而造成肌膚光澤降低、肌膚保濕度下降等。

在一些實施例中，保濕相關基因包含TGM1基因(GeneID：7051)、KRT1基因(GeneID：3848)、KRT14基因(GeneID：3861)、AQP3基因(GeneID：360)、GBA基因(GeneID：2629)、FLG基因(GeneID：2312)、HAS2基因(GeneID：3037)、HAS3基因(GeneID：3038)。

換言之，咖啡櫻桃萃取物可藉由提高上述基因表現量，提升肌膚保濕相關基因之表現量以達到改善皮膚狀態之功效。

在一些實施例中，濃度為0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可以提升肌膚之保濕能力。

在一些實施例中，白利糖度(Degrees Brix)值為10以上的咖啡櫻桃萃取物可以提升肌膚之保濕能力。

在一些實施例中，咖啡櫻桃萃取物可以用於製備撫平皺紋及/或改善肌膚紋理之組合物之用途。

在一些實施例中，濃度為0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可以撫平皺紋及/或改善肌膚紋理。

在一些實施例中，濃度為0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可以緊緻肌膚毛孔。

在一些實施例中，白利糖度(Degrees Brix)值為10以上的咖啡櫻桃萃取物可以提升肌膚分泌玻尿酸之能力。

玻尿酸(hyaluronic acid,HA)存在於人體的結締組織及真皮層中，是一種透明的膠狀物質，負責結合及保留肌膚中的水分子。而皮膚中的玻尿酸佔超過50%的人體玻尿酸，且其為細胞外間質的主要成分，可維持皮膚本身的彈性。隨著年齡的增長，人體內的玻尿酸會逐漸流失，30歲時皮膚中的玻尿酸含量會剩下不到六成的含量。而此造成皮膚產生空隙，進而逐漸失去彈力而老化。

在一些實施例中，濃度為0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可以提升肌膚之膠原蛋白密度。

在一些實施例中，濃度為0.25mg/mL以上的咖啡櫻桃萃取物可以提升肌膚彈性。

在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有有效含量的咖啡櫻桃萃取物。換言之，此醫藥品包含有有效含量的咖啡櫻桃萃取物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地 (topically)投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

在一些實施例中，前述之組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物(food additive)，意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。

在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

在一些實施例中，前述組合物可為保養品組合物。在一些實施例中，此保養品組合物可為但不限於化妝水、凝膠、精華液、乳液、乳霜、洗臉或沐浴產品、防曬產品、美白產品、香膏、軟膏、面膜。

範例一：本發明之製備-咖啡櫻桃萃取物的製備

粉碎程序中將咖啡櫻桃之果皮作為咖啡櫻桃原料並進行粉碎。於此，採用osterizer品牌的10speed blender進行粉碎。接著，加熱程序中以水為溶劑，將粉碎後的咖啡櫻桃原料與水以1：15的重量比例混合後在85±℃下萃取60分鐘。於此，萃取可以是將咖啡櫻桃原料浸泡在水中。後續，降溫程序將粉碎後的咖啡櫻桃原料與水降溫到室溫(25℃)。此後，過濾程序將降溫後的咖啡櫻桃原料及水通過400網目的篩網以形成過濾液。接著，於60℃下對過濾液進行減壓濃縮而得本發明之咖啡櫻桃萃取物。

範例二：定量實驗-咖啡櫻桃萃取物總黃酮定量實驗

將範例一中所得到之咖啡櫻桃萃取物以水，依其體積做10倍稀釋後，取200μL到試管中。於此試管內加入200μL 5wt%亞硝酸鈉(購自Sigma，商品編號31443)水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。

接著，加入200μL 10wt%硝酸鋁(購自Alfa Aesar，商品編號12360)水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2mL 4wt%氫氧化鈉水溶液(氫氧化鈉購自Macron，產品編號7708-10)，使其混合均勻。最後再加入1.4mL的水於試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以分光光度計(Jasco，型號V-730)於500nm的波長下偵測吸光值。

接著配製標準品以製作檢量線。本案以芸香素(rutin，購自ChromaDex，商品編號ASB-00018440)當量作為總黃酮相對含量的表示。先配製200μg/mL之芸香素甲醇溶液，作為芸香素標準液。取該芸香素標準液0μL、200μL、400μL、600μL、800μL及1000μL分別加入至不同試管中，再於該些試管中加入水，使其各試管內之總體積為1200μL。接著，針對每一試管，從試管中分別取200μL之芸香素標準溶液至另一新試管，再於此試管內加入200μL 5wt%亞硝酸鈉水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。接著加入200μL 10wt%硝酸鋁水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2mL 4wt%氫氧化鈉水溶液，使其混合均勻。最後再加入1.4mL的水於此試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以分光光度計於500nm的波長下偵測吸光值。將六種不同濃度的芸香素溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成檢量線。

接著，利用檢量線將稀釋後的咖啡櫻桃萃取物的吸光值換算成總黃酮含量。於此，可推算出稀釋前的咖啡櫻桃萃取物(即範例一中所得到之咖啡櫻桃萃取物)的總黃酮含量為2000ppm。

已知黃酮並非為本案所述改善肌膚狀態、抗氧化、或美白的活性成分，但由於已知黃酮可具有其他例如預防心血管疾病等之用途，而由本案萃取方式所得之咖啡櫻桃萃取物具有高總黃酮含量，故本案之咖啡櫻桃萃取物可具有多種複合用途。此外，在一些實施例中，此總黃酮含量亦可作為濃縮終點的判斷基準。

範例三：定量實驗-咖啡櫻桃萃取物總多酚含量

將範例一中所得到之咖啡櫻桃萃取物以水，依其體積做10倍稀釋後，取100μL到試管中。而後，於此試管內添加500μL的佛蕭酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent，購自Merck，貨號1.09001.0100)，混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5wt%碳酸鈉(購自Sigma，商品編號31432)水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。再經由振盪(vortex)確保溶液中無氣泡後，取其中之200μL溶液於750nm的波長下測量吸光值。

接著，配製標準品以製作檢量線。本案以沒食子酸(Gallic acid)當量作為總多酚相對含量的表示。於此，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL之沒食子酸(沒食子酸購自Sigma，產品編號G7384)的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至不同試管中。針對各試管，於其中添加500μL的佛蕭酚試劑，混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5wt%碳酸鈉水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。再經由振盪(vortex)確保溶液中無氣泡後，取其中之200μL溶液於750nm的波長下測量吸光值。將六種不同濃度的沒食子酸標準溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成檢量線。

接著，利用檢量線將稀釋後的咖啡櫻桃萃取物的吸光值換算成總多酚含量。於此，可推算出稀釋前的咖啡櫻桃萃取物(即範例一中所得到之咖啡櫻桃萃取物)的總多酚含量為1000ppm。

已知多酚並非為本案所述改善肌膚狀態、抗氧化、或美白的活性成分的活性成分，但由於已知多酚可具有其他例如預防心血管疾病等之用途，由本案萃取方式所得之咖啡櫻桃萃取物有高的總多酚含量，故本案之咖啡櫻桃萃取物可具有多種複合用途。此外，在一些實施例中，此總多酚含量亦可作為濃縮終點的判斷基準。

範例四：試管實驗-抗醣化試驗

當蛋白質經醣化反應後將生成多種醣化終產物(Advanced glycation end products，AGEs)，其為不可還原之物質，並改變及影響蛋白質的正常功能，導致膠原蛋白硬化、產生斑點、造成肌膚鬆弛、肌膚機能降低。因此，若能抑止膠原蛋白醣化則可防止膠原蛋白鏈斷裂，並降低膠原蛋白的流失速度、延緩肌膚老化與鬆弛。而為確認咖啡櫻桃萃取物是否具有抑止膠原蛋白醣化的功效，進行膠原蛋白醣化量測試如下。

藥品配製：

1.使用前方範例一中所製得之咖啡櫻桃萃取物，以濃度200mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate-Buffered Saline，PBS，係以NaH₂PO₃ (Honeywell，#04269)、Na₂HPO₄(Sigma，#V900061)與水配製而成，其pH值為7.4)作為溶劑，配製出濃度為10mg/mL的咖啡櫻桃萃取物溶液。

2.使用前述濃度200mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水以及膠原蛋白粉末(膠原蛋白購自Rousselot，型號#P2000HD)，配製濃度為60mg/mL的膠原蛋白溶液。另加入疊氮化鈉於膠原蛋白溶液中，使膠原蛋白溶液中含有0.06wt%的疊氮化鈉。(疊氮化鈉購自Sigma，#S2002)。

3.使用前述濃度200mM的磷酸鹽緩衝生理鹽水與果糖(果糖購自Sigma，#F0127)，配製濃度為1.5M的果糖溶液。

膠原蛋白醣化測試：

1.將前述的咖啡櫻桃萃取物溶液0.2mL，與0.2mL前述膠原蛋白溶液以及0.2mL前述果糖溶液進行混合，配製出樣品溶液。

2.將0.2mL的去離子水與0.2mL前述膠原蛋白溶液以及0.2mL前述果糖溶液進行混合，配製出空白溶液作為控制組。

3.將樣品溶液以及空白溶液於進行膠原蛋白醣化反應前，使用分光螢光計(spectrofluorometer，廠商/型號：BioTek FLx 800)測量其螢光強度(激發波長360nm，放射波長460nm)。

4.將樣品溶液以及空白溶液置於50℃反應24小時，使各溶液進行膠原蛋白醣化反應。

5.將反應後的樣品溶液以及空白溶液，同樣以分光螢光計測量其螢光強度(激發波長360nm，放射波長460nm)。

6.依下列公式計算蛋白質醣化終產物相對生成率： [(樣品螢光強度_反應後-樣品螢光強度_反應前)/(控制組螢光強度_反應後-控制組螢光強度_反應前)]×100%

樣品相對於控制組的蛋白質醣化終產物相對生成率顯示於圖2。

如圖2所示，在經本發明之咖啡櫻桃萃取物處理後，醣化終產物之生成率降低，顯示本發明之咖啡櫻桃萃取物具有抑止膠原蛋白的醣化終產物產生的效果。其中，樣品溶液中的蛋白質醣化終產物相對生成率僅為控制組的40%。顯示本發明之咖啡櫻桃萃取物確實可抑止膠原蛋白的醣化反應，減少醣化終產物的生成，進而降低體內膠原蛋白的流失，達到減緩肌膚老化及肌膚機能喪失的功效。

範例五：細胞實驗-抗氧化試驗

於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀，測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經本發明之咖啡櫻桃萃取物處理後，是否能提升抵抗醣化終產物之氧化壓力。

材料與儀器

1.細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk，取自生物資源保存及研究中心(BCRC)；Cat.60153。

2.細胞培養基：含有10vol% FBS(購自Gibco)之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基(Eagle’s minimum essential medium(MEM)，購自Gibco，產品編號15188-319)額外添加成分使其含有1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate，購自Gibco)、1.5g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate，購自Sigma，Cat.S5761-500G)及0.1mM非必需胺基酸(non-essential amino acid solution，購自Gibco) 所配製而成。

3.磷酸緩衝鹽溶液(PBS溶液)：購自Gibco，產品編號10437-028。

4.DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883，購自Sigma)溶於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，產品編號SI-D6883-50MG)以配製成5mg/ml的DCFH-DA溶液。

5.流式細胞儀(Flow cytometry)，BD Accuri C6 Plus。

6.雙氧水(H₂O₂)：購自Sigma-Aldrich，產品型號95299-1L。

7.葡萄糖(Glucose)：購自Sigma，產品型號50-99-7。

8.胎牛膠原蛋白(Bovine Collagen)：購自Sigma，產品型號C2124。

9.咖啡櫻桃萃取物：此實驗中所使用的咖啡櫻桃萃取物，係以範例一之方式製備而成。

實驗步驟

實驗將會分為實驗組、空白控制組(未添加咖啡櫻桃萃取物、亦無經過醣化終產物處理的組別)、以及對照組(未添加咖啡櫻桃萃取物，但經過醣化終產物處理的組別)三組進行，各組分別進行二重複試驗：

1.醣化終產物製備：在1X PBS中配置50mg/ml的胎牛血清及0.5M的葡萄糖溶液在70℃烘箱反應四天。

2.將CCD966-sk細胞以每孔4×10⁴個的方式，接種於每孔含2ml培養基之96孔培養盤中。

3.將培養盤置於5%CO₂、37℃下，培養24小時。

4.移除培養基。

5.加入2mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37℃下培養1小時。

實驗組的實驗培養基為添加有5μL的範例一得到的咖啡櫻桃萃取物之2mL細胞培養基(即0.25mg/mL)。

控制組的實驗培養基為單純的2mL細胞培養基(即不含咖啡櫻桃萃取物)。

對照組的實驗培養基為單純的2mL細胞培養基(即不含咖啡櫻桃萃取物)。

6.添加步驟1.所配製之醣化終產物於各組之孔中，培養3小時。

7.添加濃度為5μg/mL的DCFH-DA溶液2μL於每孔中的細胞培養基，使DCFH-DA處理細胞30分鐘。

8.於DCFH-DA處理後，將各孔中之細胞與細胞培養基收集並將含有細胞與培養基之離心管以400 xg離心5分鐘。

9.離心後，移除上清液，並以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物。

10.再以400 xg離心5分鐘。

11.離心後，移除上清液，於暗處以以200μL的1X PBS溶液再次懸浮細胞，以得到待測細胞液。

12.使用流式細胞儀偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490nm，放射波長為510-550nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH(二氯二氫螢光素)，再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF(二氯螢光素)，經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以取得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖3所示。

實驗結果

如圖3所示，由比較控制組、對照組的結果可知，在經過醣化終產物處理後，相對ROS的生成量(高螢光表現)會大幅增加；其顯示醣化終產物處理確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對人類單核球細胞產生後續傷害。另一方面，根據比較對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過咖啡櫻桃萃取物處理後，相對ROS的生成量明顯減少約44%；其顯示咖啡櫻桃萃取物可有效減少醣化終產物造成的氧化壓力及活性氧物質在細胞內的產生或累積。換言之，咖啡櫻桃萃取物具抵抗活性氧物質之能力。亦即，咖啡櫻桃萃取物可抵抗細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到活性氧物質等所導致的氧化傷害。

範例六：細胞實驗-皮膚緊緻實驗

為了解咖啡櫻桃萃取物是否具有提升皮膚緊緻度的效果，係以MEM培養基培養人類皮膚纖維母細胞(CCD-996sk；購自BCRC，產品編號：60153)，歷時24小時，其後進行以下處理：

A.控制組：

1.以500微升體積計，將0.66倍體積的細胞置於一滅菌管中，加入0.33倍體積的3毫克/毫升之第一型膠原蛋白(Collagen I；購自Gibco公司，產品編號：A10483-01)溶液，接著快速加入適量的1莫耳濃度(M)的氫氧化鈉溶液(該氫氧化鈉溶液的量需至少為可將酚紅指示劑(phenol red medium indicator)轉為淺粉色所需的用量)，上下混合溶液三次，以提供一混合物；2.取500微升上述步驟1提供之混合物置入一24孔培養盤中，於室溫下靜置20分鐘，使其固化為一凝膠；以及3.加入500微升的MEM培養基，並小心地將凝膠的周圍與培養盤分離，使凝膠懸浮於MEM培養基中，再將培養盤置於37℃、5% CO2的培養箱中培養，歷時6小時。

B.AGEs組：

(1)以500微升(μL)體積計，將0.66倍體積的細胞置於一滅菌管中，加入0.33倍體積的3毫克/毫升之第一型膠原蛋白溶液，接著快速加入適量的1莫耳濃度(M)的氫氧化鈉溶液(該氫氧化鈉溶液的量需至少為可將酚紅指示劑(phenol red medium indicator)轉為淺粉色所需的用量)，並添加[製備實施例E]提供之醣化胎牛血清白蛋白，上下混合溶液三次，以提供一混合物；(2)取500微升上述步驟(1)提供之混合物置入一24孔培養盤中，於室溫下靜置20分鐘，使其固化為一凝膠；以及(3)加入500微升的MEM培養基，並小心地將凝膠的周圍與培養盤分離，使凝膠懸浮於MEM培養基中，再將培養盤置於37℃、5% CO2的培養箱中培養，歷時6小時。

C.萃取物組：比照「AGEs組」的步驟進行配製，但於步驟(3)中進一步添加[製備實施例A]提供之咖啡櫻桃萃取原液，使其於所加入的MEM培養基中的濃度達到0.25毫克/毫升，最後，每隔3小時觀察凝膠的輪廓變化，並以數位相機拍攝凝膠，持續觀察6小時。其後，將第6小時所拍攝之圖像以Image J軟體進行分析，記錄各組凝膠的輪廓並計算其表面積(凝膠的表面積越小代表收縮能力越強)。最後，以學生t檢驗(Student t-test)進行統計分析，並以「控制組」之結果作為基準(即，將「控制組」設定為100%)計算「AGEs組」及「萃取物組」的凝膠的收縮能力。

實驗結果

如圖4所示，由比較控制組、對照組的結果可知，在經過醣化終產物處理後，彈性能力會將低至73.19%；其顯示醣化終產物處理確實會導致細胞之彈性能力會將低，進而對細胞產生後續傷害。另一方面，根據比較對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過咖啡櫻桃萃取物處理後，彈性能力明顯恢復至99.85%；其顯示咖啡櫻桃萃取物可有效減少醣化終產物造成的彈性能力的降低。換言之，咖啡櫻桃萃取物具提升皮膚緊緻之功能。

範例七：保濕相關基因試驗

此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類表皮角質細胞HPEK-50經本發明之咖啡櫻桃萃取物處理後，細胞中保濕相關基因的變化。

材料與儀器

1.角質細胞專用之無血清培養基(Keratinocyte-SFM；購自Thermo，產品編號17005042)。

2.人類表皮角質細胞(以下簡稱HPEK-50細胞或角質細胞；購自CELLnTEC)。

3.RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)。

4.反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美國，編號18080-051)。

5.測量標的基因引子，其中包含HAS2基因、HAS3基因、KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、GBA基因及FLG基因，另包括內部控制組(TBP基因)。

6.KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。

7.ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))。

8.咖啡櫻桃萃取物：由本案範例一所述之製備方式所得之咖啡櫻桃萃取物。

實驗步驟

細胞培養的實驗流程如下：

1.於此，培養基採用角質細胞專用之無血清培養基。

2.首先以每孔1×10⁵個細胞量培養於含有2mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37℃下培養16小時，然後將HPEK-50細胞分為實驗組與控制組。

3.實驗組：每毫升培養液含有0.25mg範例一之方式製備而成之咖啡櫻桃萃取物萃取物的比例(即，濃度為0.25mg/mL)製得含萃取物的培養液，將HPEK-50細胞更換為含萃取物的培養液中繼續培養。

4.控制組：不做任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的HPEK-50細胞的培養液中。

5.實驗組與控制組於培養6小時後，將培養後的實驗組與控制組細胞以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。

聚合酶連鎖反應的實驗流程如下：

1.使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。

2.接著，每組取2000奈克(ng)所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶以表2中之引子(primer)黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。

3.後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST將二組反轉錄後產物分別以表2之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以觀察實驗組和控制組的HPEK-50細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應1秒，60℃反應20秒，總共40個迴圈。

4.爾後，使用2^-ΔΔCt方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之一目標基因相對於控制組或對照組之同一基因的RNA表現量倍數變化。該方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值(Ct)，按照以下公式計算倍數變化：△Ct=Ct_{實驗組之目標基因/控制組或對照組之目標基因}-Ct_TBP

△△Ct=△Ct_{實驗組之目標基因}-△Ct_{控制組之目標基因}

倍數變化=2^{-ΔΔCt平均值}

5.最終，利用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾Student t-test分析是否具有統計上顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。其中，HAS2基因對應的引子對為HAS2-F以及HAS2-R，HAS3基因對應的引子對為HAS3-F以及HAS3-R，KRT1基因對應的引子對為KRT1-F以及KRT1-R，KRT14基因對應的引子對為KRT14-F以及KRT14-R，AQP3基因對應的引子對為AQP3-F以及AQP3-R，GBA基因對應的引子對為GBA-F以及GBA-R，FLG基因對應的引子對為FLG-F以及FLG-R。

實驗結果

參照圖5-9。圖5為經本發明咖啡櫻桃萃取物處理之實驗組與未經本發明咖啡櫻桃萃取物處理之控制組之HAS2基因與HAS3基因之相對表現量之長條圖；圖6為經本發明咖啡櫻桃萃取物處理之實驗組與未經本發明咖啡櫻桃萃取物處理之控制組之KRT1基因與KRT14基因之相對表現量之長條圖。圖7-9則分別為經本發明咖啡櫻桃萃取物處理之實驗組與未經本發明咖啡櫻桃萃取物處理之控制組之AQP3基因、GBA基因及FLG基因之相對表現量之長條圖(圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著)。

由圖5可知，當控制組之HAS2基因與HAS3基因表現量為 100%時，實驗組之HAS2基因與HAS3基因分別約為120%、138%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的角質細胞中的之HAS2基因與HAS3基因分別提升20%與38%，且均達統計學上之顯著差異。

由圖6可知，當控制組之KRT1基因與KRT14基因表現量為100%時，實驗組之KRT1基因與KRT14基因分別約為276%與118%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的角質細胞中的之HAS2基因與HAS3基因之表現量分別提升176%與18%，且均達統計學上之顯著差異。

由圖7-9可知，當控制組之AQP3基因、GBA基因與FLG基因表現量為100%時，實驗組之AQP3基因、GBA基因與FLG基因表現量分別約為185%、240%及147%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的角質細胞中的之AQP3基因、GBA基因與FLG基因表現量分別提升85%、140%與47%，且均達統計學上之顯著差異。

其中，HAS2基因所轉錄出之蛋白質能製造高分子玻尿酸--其具有黏性及支撐特性，且可用於支撐肌膚的結構、改善肌膚鬆弛。而HAS3基因所轉錄出之蛋白質可合成小分子玻尿酸--其具有保水特性，可維持肌膚的保水性，改善肌膚皺紋及細紋。

KRT1基因以及KRT14基因所轉錄出之蛋白質則有助於維持角質結構緊密完善、及/或能達到保護肌膚之能力。具體而言，KRT1基因及KRT14基因分別承載製備角蛋白1(keratin 1)及角蛋白14(keratin 14)的資訊。角蛋白是一種纖維狀蛋白質，其組成了角質細胞(keratinocytes)之主要架構。角蛋白1及角蛋白14相互結合形成角蛋白中間纖維(intermediate filaments)，而這些中間纖維所形成的堅固網絡，可為皮膚提供強度和彈性，並保護其免受摩擦和其他日常物理性的損害，其亦可使皮膚表皮細胞較緊密排列，減少水分經由皮膚細胞間之縫隙散失之比例，進而達到肌膚保濕之功效。

APQ3基因與GBA基因所轉錄出的蛋白質則分別具維持表皮層甘油含量及調控神經醯胺(Ceramide)合成，其基因表現量之提升均有助於提升肌膚鎖水能力。而FLG基因所轉錄出之蛋白質具有合成天然保濕因子之功能，有助於提升肌膚保濕之能力。

因此，由上述圖及敘述可知，本案之咖啡櫻桃萃取物可透過提升HAS2基因、HAS3基因、KRT1基因、KRT14基因、APQ3基因、GBA基因、FLG基因之表現量，達到支撐肌膚的結構、改善肌膚鬆弛、防止肌膚水分過度散失、促進皮膚表皮細胞緊密排列，減少水分經由皮膚細胞間之縫隙散失之比例、增強肌膚保濕度、維持表皮層甘油含量及調控神經醯胺合成，進而改善肌膚外觀等功能。

範例八：人體試驗-以內服方式使用咖啡櫻桃萃取物

於此，令受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品，探討以內服之方式使用本發明之咖啡櫻桃萃取之肌膚改善效果。

使用樣品：含本發明之咖啡櫻桃萃取之飲品50g/瓶，其中包含：咖啡櫻桃萃取14wt%、蔗糖素0.016wt%、檸檬酸0.2wt%、水85.784wt%...。在另一些其他的實施例中，每人一日可攝取咖啡櫻桃萃取物至多10g。其中，此咖啡櫻桃萃取物係由範例一之方法所製備而成。其他內容物為增添風味、提升飲品保存期限用，已知其並非具有本發明之肌膚外觀改善、肌膚保濕等功效。

受試者人數：40位20歲以上之受試者。

實驗方式

1.收集40位受試者，於使用受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品前(臉部已清潔，第0週)，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值。

2.接著，隨機挑選20位受試者作為安慰劑組，其餘20位作為實驗組。其中，實驗組每日飲用7ml含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品(每瓶含有7mL本發明之咖啡櫻桃萃取物)，共飲用56日(即8週)。而安慰劑組則每日飲用一瓶安慰劑飲品(飲品內除以相同水量取代本發明之咖啡櫻桃萃取物之外，其餘內容物均與實驗組所飲用之飲品相同)。

3.安慰劑組與實驗組之受試者分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品28日與56日後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值。(於飲用前、後進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，且於進行試驗期間，受試者之飲食習慣與生活作息均未改變，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響)。

檢測項目

將分別進行1.肌膚含水量、2.肌膚膠原蛋白密度、3.肌膚彈性、4.肌膚皺紋、5.肌膚紋理、6.肌膚斑點、7.肌膚白皙度之檢測。

1.肌膚含水量

使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚含水量檢測探頭Corneometer^® CM825(C+K Multi Probe Adapter System, Germany)對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。該檢測探頭係基於電容的原理進行測量。當水分含量發生變化時，皮膚的電容值亦發生變化，故可通過測定皮膚電容值，分析皮膚表面的含水量。

2.肌膚膠原蛋白密度

使用肌膚彈力檢測探頭Cutometer® MPA580(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。測試原理是基於吸力和拉伸原理，在被測試的皮膚表面產生一個負壓將皮膚吸進一個測試探頭內，透過光學測試系統檢測皮膚被吸進探頭內的深度，並以軟體分析計算皮膚彈性。

3.肌膚彈性

同樣係使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚彈力檢測探頭Cutometer® MPA580(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。測試原理是基於吸力和拉伸原理，在被測試的皮膚表面產生一個負壓將皮膚吸進一個測試探頭內，透過光學測試系統檢測皮膚被吸進探頭內的深度，並以軟體分析計算皮膚彈性與緊實度。

4.肌膚皺紋

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行拍攝，藉由標準白光照射、偵測皮膚陰影的變化，即可偵測紋理位置並得到一數值，可代表皮膚的平滑程度。

5.肌膚紋理

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測，其原理乃以可見光拍攝高解析度之肌膚影像，並以內建軟體根據皮膚的凹陷與凸起進行粗糙度分析。測量數值越高，說明皮膚越越粗糙。

6.肌膚斑點

A.使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。該儀器係以UV光進行臉部肌膚拍攝及RBX偏振光技術進行臉部肌膚拍攝。紫外線可被黑色素吸收，提高色素斑的顯現度，偵測肉眼不可見的表皮層黑色素斑。測量數值越高，說明紫外線色斑越多。而RBX偏振光可偵測肉眼不可見的真皮層黑色素斑。測量數值越高，說明棕色斑越多。

7.肌膚色澤

使用愛爾蘭公司Miravex的Antera 3D分析肌膚實證鏡頭對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。該儀器係對肌膚以不同角度發射不同波段的LED(light emitting diodes)，透過感應器收集其反射後以電腦協作重組肌膚表面。肌膚膚色係以其Colorimeter色度分析功能，分析肌膚的L*a*b*顏色數值，其中L*代表亮度，a*和b*表示顏色對立維度。就兩色

與

之膚色差異

係以以下公式計算：

因本實施例主要測量為美白程度之變化，因此主要觀測L*值，當L*值愈高，代表膚色亮度愈高，肌膚愈白。

請參閱圖10。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品後之肌膚含水量之平均改善百分比，而飲用第4週及第8週之改善之人數比例分別佔達受試人數之90%與95%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚含水量為100%時，飲用4週後之平均肌膚含水量為104.3%，飲用8週後之平均為108.5%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚含水量分別提升4.3%與8.5%，均達統計上之顯著(「**」符號代表與飲用前相比p值小於0.01；「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001)，且分別較安慰劑組改善情形高2.7%與6.0%(「#」符號代表與安慰劑組相比p值小於0.05；「###」符號代表與安慰劑組相比p值小於0.001)。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有提升肌膚含水量，鎖住肌膚水分，以及提升肌膚保濕效果之功能。

請參閱圖11。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品後之肌膚膠原蛋白密度之平均改善百分比，而飲用第4週及第8週之改善之人數比例均佔達受試人數之100%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚膠原蛋白密度為100%時，飲用4週後之平均肌膚膠原蛋白密度為107.5%，飲用8週後之平均為111.6%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚膠原蛋白密度分別提升7.5%與11.6%，均達統計上之顯著(「**」符號代表與飲用前相比p值小於0.01；「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001)，且分別較安慰劑組改善情形高5.5%與6.5%(「#」符號代表與安慰劑組相比p值小於 0.05)。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有提升膠原蛋白分泌、增加肌膚膠原蛋白密度、維持肌膚機能之功能。

請參閱圖12。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品後之肌膚彈性之平均改善百分比，而飲用第4週及第8週之改善之人數比例分別佔達受試人數之90%與95%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚彈性為100%時，飲用4週後之平均肌膚彈性為108.3%，飲用8週後之平均為114.5%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚彈性分別提升8.3%與14.5%，均達統計上之顯著(「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001)，且分別較安慰劑組改善情形高5.6%與11.6%(「##」符號代表與安慰劑組相比p值小於0.01；「###」符號代表與安慰劑組相比p值小於0.001)。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有提升肌膚彈性之功能。

請參閱圖13。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品後之肌膚5皺紋之平均改善百分比，而於飲用第4週與第8週改善之人數比例分別佔達受試人數之70%與50%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚皺紋量為100%時，飲用4週後之平均肌膚皺紋量為97.7%，飲用8週後之平均為84.6%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚5皺紋分別減少2.7%與15.4%，且分別較安慰劑組減少10.2%與44.3%。

請參閱圖14。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品後之肌膚紋理之平均改善百分比，而於飲用第4週與第8週改善之人數比例分別佔達受試人數之65%與70%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚紋理為100%時，飲用4週後之平均肌膚紋理為93.0%，飲用8週後之平均為90.5%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚紋理分別減少7.0%與9.5%，且分別較安慰劑組減少3.7%與6.4%。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有撫平肌膚皺紋，改善肌膚紋理與降低肌膚粗糙程度之功能。

請參閱圖15。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品後之肌膚斑點之平均改善百分比，而於飲用第4週與第8週改善之人數比例分別佔達受試人數之65%與70%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚斑點數量為100%時，飲用4週後之平均肌膚斑點數量為94.4%，飲用8週後之平均為93.2%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚斑點數量分別減少5.6%與6.8%，且分別較安慰劑組減少5.7%與5.5%。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有淡化肌膚斑點，改善肌膚外觀之功能。

請參閱圖16。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品後之肌膚色澤之平均改善百分比，而於飲用第4週與第8週改善之人數比例分別佔達受試人數之70%與75%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚色澤為100%時，飲用4週後之平均肌膚色澤為100.6%，飲用8週後之平均為 102.0%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚色澤分別提升0.6%與2.0%，均達統計上之顯著(「*」符號代表與飲用前相比p值小於0.05；「**」符號代表與飲用前相比p值小於0.01)，且分別較安慰劑組改善情形高0.2%與2.0%。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有肌膚美白，改善肌膚色澤與光澤之功能。

範例九：人體試驗-以外用方式使用咖啡櫻桃萃取物

於此，令受試者使用含本發明之咖啡櫻桃萃取物之精華液，探討以外用之方式使用本發明之咖啡櫻桃萃取之肌膚改善效果。

使用樣品：含咖啡櫻桃萃取物精華液以及安慰劑精華液(其中的咖啡櫻桃萃取物替換成等重的水，其餘成分均相同)。於此實施例中，各精華液係含20mL的對應精華液。

含有咖啡櫻桃萃取物的精華液成分：三仙膠0.2wt%、馨鮮酮0.6wt%、1,3-丁二醇5wt%、三乙醇胺0.1wt%、己二醇0.6wt%、咖啡櫻桃萃取物2wt%、增稠劑U2 0.1wt%，其餘為水。其中，此咖啡櫻桃萃取物係由範例一之製備方式而得。

受試者人數：40位20歲以上之受試者。

實驗方式

1.收集40位受試者，於使用受試者使用含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液之前(臉部已清潔，第0週)，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值。

2.接著，隨機挑選20位受試者作為安慰劑組，其餘20位作為實驗組。其中，實驗組每日早晚於請洗臉部後，使用一次含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液，共使用28日(即4週)。而安慰劑組則每日早晚使用一次安慰劑精華液。

3.安慰劑組與實驗組之受試者分別使用安慰劑精華液與含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液14日與28日後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值。(於使用前、後進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，且於進行試驗期間，受試者之飲食習慣與生活作息均未改變，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響)。

檢測項目

將分別進行1.肌膚含水量、2.肌膚彈性、3.毛孔狀態、4.肌膚斑點、5.肌膚UV斑。

其中進行1.肌膚含水量、2.肌膚彈性與4.肌膚斑點測試所使用的儀器及其原理與範例八同。

3.毛孔狀態

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對同一受試者在使用精華液前與使用後的面部肌膚進行檢測。藉由標準白光照射，造成毛孔凹陷處產生陰影，毛孔會比周圍的膚色更黑，故可以此偵測毛孔，然後利用軟體根據毛孔數目、面積分析得到一數值，而數值越高則顯示其毛孔數量、面積較多。

5.肌膚UV斑

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。該儀器係以UV光進行臉部肌膚拍攝。紫外線可被黑色素吸收，提高色素斑的顯現度，偵測肉眼不可見的表皮層黑色素斑。測量數值越高，說明紫外線色斑越多。

請參閱圖17。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別使用安慰劑精華液與含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液後之肌膚含水量之平均改善百分比，而使用第2週及第4週之改善之人數比例均佔達受試人數之80%。其中，當實驗組受試者於使用前之平均肌膚含水量為100%時，使用2週後之平均肌膚含水量為101.3%，使用4週後之平均為111.3%。換言之，實驗組之受試者使用含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液2週與4週後，平均肌膚含水量分別提升1.3%與11.3%，且分別較安慰劑組改善情形高1.8%與7.2%。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有提升肌膚含水量，鎖住肌膚水分，以及提升肌膚保濕效果之功能。

請參閱圖18。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別使用安慰劑精華液與含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液後之肌膚彈性之平均改善百分比，而使用第2週及第4週之改善之人數比例分別佔達受試人數之95%與100%。其中，當實驗組受試者於使用前之平均肌膚彈性為100%時，使用2週後之平均肌膚彈性為104.6%，使用4週後之平均為107.6%。換言之，實驗組之受試者使用含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液2週與4週後，平均肌膚彈性分別提升4.6%與7.6%，均達統計上之顯著(「**」符號代表與飲用前相比p值小於0.01；「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001)，且分別較安慰劑組改善情形高3.2%與5.6%(「#」符號代表與安慰劑組相比p值小於0.05；「###」符號代表與安慰劑組相比p值小於0.001)。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有提升肌膚彈性之功能。

請參閱圖19。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別使用安慰劑精華液與含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液後之肌膚毛孔狀態之平均改善百分比，而使用第2週及第4週之改善之人數比例均佔達受試人數之75%。其中，當實驗組受試者於使用前之平均肌膚毛孔數量為100%時，使用2週後之平均肌膚毛孔數量為95.0%，使用4週後之平均為93.3%。換言之，實驗組之受試者使用含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液2週與4週後，平均肌膚毛孔量分別減少5.0%與6.7%，且分別較安慰劑組降低7.0%與8.7%。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有緊緻肌膚毛孔之功能。

請參閱圖20。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別使用安慰劑精華液與含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液後之肌膚斑點狀態之平均改善百分比，而使用第2週及第4週之改善之人數比例分別佔達受試人數之60%及70%。其中，當實驗組受試者於使用前之平均肌膚斑點量為100%時，使用2週後之平均肌膚斑點量為97.0%，使用4週後之平均為92.2%。換言之，實驗組之受試者使用含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液2週與4週後，平均肌膚斑點量分別減少3.0%與7.8%，且分別較安慰劑組降低2.8%與4.7%。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有淡化肌膚斑點之功能。

請參閱圖21。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別使用安慰劑精華液與含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液後之肌膚UV 斑狀態之平均改善百分比，而使用第2週及第4週之改善之人數比例分別佔達受試人數之90%與95%。其中，當實驗組受試者於使用前之平均肌膚UV斑量為100%時，使用2週後之平均肌膚UV斑量為91.4%，使用4週後之平均為89.6%。換言之，實驗組之受試者使用含本發明之咖啡櫻桃萃取物精華液2週與4週後，平均肌膚UV斑量分別減少8.6%與10.4%，且分別較安慰劑組降低7.8%與4.8%。由此可見，本發明之咖啡櫻桃萃取物具有淡化肌膚UV斑之功能。

雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 大江生醫股份有限公司

<120> 咖啡櫻桃萃取物用於抵抗及/或減緩膠原蛋白醣化終產物生成之用途

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAS2-F

<400> 1

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> HAS2-R

<400> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KRT1-F

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<223> KRT14-F

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<212> DNA

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<223> AQP3-F

<400> 9

<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> FLG-F

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<223> FLG-R

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Claims

一種咖啡櫻桃萃取物用於製備一抵抗及/或減緩膠原蛋白醣化終產物生成的組合物之用途，其中該組合物係為一可食用組合物或一保養品組合物，該咖啡櫻桃萃取物是透過該抵抗及/或減緩膠原蛋白醣化終產物生成來維持皮膚緊緻，該咖啡櫻桃萃取物係藉由一製備方法製得，該製備方法包含：一粉碎步驟：將咖啡櫻桃(Coffea arabica)之果皮進行粉碎，以得到一咖啡櫻桃原料；一萃取步驟：以一萃取條件進行萃取，以得到一培養液，該萃取條件為以水為萃取溶劑，將該咖啡櫻桃原料與水以1：15的重量比例混合，並於85℃下萃取60分鐘，以得到一萃取液；一過濾步驟：利用一篩網過濾該萃取液，以得到一過濾液；以及一減壓濃縮步驟：對該過濾液進行減壓濃縮，以得到該咖啡櫻桃萃取物。
如請求項1所述的用途，其中該可食用組合物為一保健食品組合物或一食品組合物。