CN112843139A

CN112843139A - 咖啡樱桃汁液用于改善肌肤的用途

Info

Publication number: CN112843139A
Application number: CN202011261214.6A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 李姿仪
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2021-05-28
Also published as: CN112843106A; US20230263722A1; TWI815058B; TW202118502A; TW202118505A; TWI801770B; US20230240974A1; CN112843136A; US20210137826A1; TWI809328B; TWI804771B; TW202118501A; TW202118481A; CN112843097A

Abstract

本发明公开一种咖啡樱桃汁液的用途，其是用于制备改善肌肤的用途。其中，该咖啡樱桃汁液是由含水的溶剂进行提取。

Description

咖啡樱桃汁液用于改善肌肤的用途

技术领域

本发明涉及一种咖啡樱桃汁液的用途，特别是关于咖啡樱桃汁液用于制备改善肌肤的用途。其中，该改善肌肤的用途包含肌肤抗氧化能力的提升、抗醣化能力的提升、肌肤紧致的提升、肌肤保湿、肌肤玻尿酸分泌量的提升、肌肤弹性、肌肤胶原蛋白密度的提升、肌肤弹性、淡化肌肤斑点、紧致肌肤毛孔、肌肤美白、肌肤皱纹与纹理的抚平。

背景技术

咖啡樱桃为小果咖啡(学名：Coffea arabica)的果实。小果咖啡又称为阿拉伯咖啡、阿拉比卡咖啡，属大灌木或小乔木，为茜草科(Rubiaceae)咖啡属的一个物种，原产于东非。因于公元15世纪以前，咖啡长期被阿拉伯世界所垄断，因此被欧洲人称为「阿拉伯咖啡」。

小果咖啡所结的果实成熟后为红色，因为其外观类似樱桃，因而有「咖啡樱桃」的称呼。而小果咖啡中最有经济价值的部位为其果实内的种子。在去除果皮、果肉等外部构造，进行各式各样特殊发酵处理与烘干，干燥后的咖啡豆就是人们称的「咖啡生豆」。目前小果咖啡仍然是最主要的咖啡品种，约占世界咖啡总产量的60％。

发明内容

被去除的咖啡樱桃果皮及果肉时常被咖啡产业业者当作废弃物丢去，相当可惜。因此，为了更积极提升咖啡樱桃的开发与应用，故而提出一种咖啡樱桃汁液及改善肌肤的组合物，其可应用于制备肌肤抗氧化能力的提升、抗醣化能力的提升、肌肤紧致的提升、肌肤保湿、肌肤玻尿酸分泌量的提升、肌肤弹性、肌肤胶原蛋白密度的提升、肌肤弹性、淡化肌肤斑点、紧致肌肤毛孔、肌肤美白、肌肤皱纹与纹理的抚平的组合物的用途。

当人体摄取过多的糖分，体内多余的糖份增加，并与血液中蛋白质结合产生促进皮肤老化的物质——醣化终产物(Adavanced Glycation Endproducts, AGEs)。随年龄增长及饮食习惯，醣化终产物会于体内长期累积，造成胶原蛋白及蛋白质受损，导致胶原蛋白硬化，进而产生肌肤斑点、造成肌肤松弛、降低肌肤机能。一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以抑制最终醣化蛋白(Adavanced Glycation Endproducts,AGEs)的生成。在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以提升肌肤的抗醣化能力。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可透过提升肌肤的抗醣化能力以达到维持皮肤紧致功效。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以维持肌肤紧致，且其中该咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以清除细胞中自由基，其中该咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。在一些实施例中，该细胞为皮肤细胞。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以降低自由基对肌肤细胞的破坏，以达到提升肌肤抗氧化能力的用途。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以抑制、减缓或降低细胞内自由基或过氧化物的形成。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以促进肌肤内生性玻尿酸的分泌。在一些实施例中，其中该内生性玻尿酸的分泌可维持肌肤弹性及肌肤保湿。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液是通过保湿相关基因表现量的提升以达到促进肌肤内生性玻尿酸的分泌。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液是通过保湿相关基因表现量的提升以达到肌肤保湿的功效。

在一些实施例中，保湿相关基因包含HAS2基因(Gene ID:3037)、HAS3 基因(GeneID:3038)、KRT1基因(Gene ID:3848)、KRT14基因(Gene ID: 3861)、AQP3基因(Gene ID:360)、GBA基因(Gene ID:2629)及FLG基因(Gene ID:2312)。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液是通过维持角质细胞排列以抵抗肌肤水分流失，进而达到肌肤保湿的效果。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可用于制备提升肌肤含水量的组合物的用途，其中该咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液的浓度为0.25mg/mL上。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液的白利糖度(Degrees Brix)值为10以上。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备改善肌肤状态的组合物的用途，其中咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备增加肌肤胶原蛋白密度的组合物的用途，其中咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备增加肌肤弹性的组合物的用途，其中咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备减少肌肤皱纹的组合物的用途，其中咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备改善肌肤纹理的组合物的用途，其中咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备淡化肌肤斑点的组合物的用途，其中咖啡樱桃汁液是以一种含水的溶剂进行提取。在一些实施例中，该肌肤斑点包含UV斑点。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备肌肤美白的组合物的用途，咖啡樱桃汁液是以含水的溶剂进行提取。

在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液用于制备紧致肌肤毛孔的组合物的用途，咖啡樱桃汁液是以含水的溶剂进行提取。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1是一实施例的咖啡樱桃汁液制备方法流程图。

图2是范例四中实验组与控制组的最终醣化蛋白相对生成量比例图。

图3是范例五中实验组及控制组受最终醣化蛋白刺激后抑制自由基生成量图。

图4是范例六中实验组及控制组受最终醣化蛋白刺激后抑制肌肤紧致度下降的比例图。

图5是范例七中实验组及控制组的HAS2基因与HAS3基因表现量比例图。

图6是范例七中实验组及控制组的KRT1基因与KRT14基因表现量比例图。

图7是范例七中实验组及控制组的APQ3基因表现量比例图。

图8是范例七中实验组及控制组的GBA基因表现量比例图。

图9是范例七中实验组及控制组的FLG基因表现量比例图。

图10是范例八中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤含水量比例图。

图11是范例八中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤胶原蛋白密度比例图。

图12是范例八中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤弹性比例图。

图13是范例八中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤皱纹比例图。

图14是范例八中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤纹理比例图。

图15是范例八中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤斑点比例图。

图16是范例八中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤白皙度比例图。

图17是范例九中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤含水量比例图。

图18是范例九中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤弹力比例图。

图19是范例九中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤毛孔比较比例图。

图20是范例九中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤斑点比较比例图。

图21是范例九中实验组与安慰剂组于第4周及第8周的肌肤UV斑比较比例图。

具体实施方式

以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。

本案使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student’s t-test)进行分析。图式中「*」代表p 值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着。

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。

本文中之「wt％」是指重量百分比，而「vol％」是指体积百分比。

如本文中所使用，术语「汁液」是指藉由提取作用所制备之产物。该汁液可以溶于溶剂中之溶液形式呈现，或汁液可为不含或大体上不含溶剂之浓缩物或精华呈现。

如本文所用「咖啡樱桃原料」通常是指指植物种子、含皮之种子或种皮，其中种子可包含原始、经干燥或以其他物理方式加工以利于处理之种子，其可进一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式经加工以影响原物料之大小及实体完整性之种子。

参考图1。在一些实施例中，一种咖啡樱桃汁液，其是由一种含水之溶剂对咖啡樱桃原料进行提取。在一些实施例中，咖啡樱桃汁液(coffee cherry extract)是将咖啡樱桃原料依序进行粉碎程序S01、加热程序S02、过滤程序 S04、及浓缩程序S05后得到。

在一些实施例中，咖啡樱桃原料可以是去皮或含皮的咖啡樱桃种子。在一些实施例中，咖啡樱桃原料可以是小果咖啡之果皮。在一些实施例中，咖啡樱桃原料可以是新鲜或干燥的咖啡樱桃种子。

在一些实施例中，粉碎程序S01是指将咖啡樱桃原料搅打至分裂为粉状。举例而言，粉碎可以采用果汁机、调理机或均质机。

在一些实施例中，加热程序S02是指将粉状的咖啡樱桃原料与含水之溶剂混合后加热一段固定时间。在一些实施例中，加热是指将咖啡樱桃原料与含水之溶剂的温度提升到50℃～100℃。在一些实施例中，一段固定时间是指0.5小时到3小时。举例而言，将咖啡樱桃原料与含水之溶剂的温度提升到85℃进行提取1小时。

在一些实施例中，加热程序S02中的重量比例(含水之溶剂：咖啡樱桃原料)为5：1～20：1。举例而言，含水之溶剂：咖啡樱桃原料为10:1。

举例而言，采用90公斤重的咖啡樱桃原料、900公斤重的水及0.63公斤重的柠檬酸混合后持续加热到100℃，并维持100℃持续0.5小时。举例而言，采用90公斤重的咖啡樱桃原料、900公斤重的水及0.7公斤重的柠檬酸混合后持续加热到85℃，并维持85℃持续1小时。

在一些实施例中，过滤程序S04是指将加热后(或降温后)的咖啡樱桃原料及溶剂通过筛网以将溶剂内的固体滤除形成过滤液。举例而言，筛网可以是 400网目(mesh)的筛网。

在一些实施例中，加热程序S02与过滤程序S04之间还包括降温程序S03，降温程序S03是指将加热后的咖啡樱桃原料及溶剂静置以自然降温至室温。

在一些实施例中，浓缩程序S05是指将过滤程序S04所得到的过滤液进行减压浓缩(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)以得到初萃液。在一些实施例中，浓缩程序S05所得的初萃液可即为咖啡樱桃汁液。在浓缩程序S05的一些实施例中，在40℃～70℃之间进行减压浓缩。举例而言，咖啡樱桃汁液是将咖啡樱桃原料依序进行粉碎程序S01、加热程序S02、过滤程序S04及浓缩程序S05后得到。

在一些实施例，咖啡樱桃汁液用于制备抗醣化组合物之用途，且咖啡樱桃汁液是以一种含水之溶剂进行提取。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液用于制备抗氧化组合物之用途，且咖啡樱桃汁液是以一种含水之溶剂进行提取。

在一些实施例中，抗氧化是指减缓或防止氧化作用。而氧化是一种使电子自物质转移至氧化剂的化学反应，过程中可生成自由基，进而启动链反应。当链反应发生于细胞中，细胞易受到破坏或凋亡。在一些实施例中，咖啡樱桃汁液能去除自由基，终止连锁反应并且抑制其它氧化反应。在一些实施例中，自由基之产生系因为光照、化学物质、或生物体自然衰老之过程中所产生。在一些实施例中，前述化学物质包含醣化终产物。

如前所述，超氧化物(Superoxide Anion)与过氧化氢(Hydrogen Peroxide) 等自由基会导致皮肤细胞受损。其中，咖啡樱桃汁液能降低去除自由基，举例而言，其可促进SOD相关基因之表现，提升其所转录出的蛋白质(超氧化物歧化酶)，进而增加超氧化物分解为过氧化氢的量。

在一些实施例中，0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可提升氧化相关基因的表现量，藉以清除体内自由基，达到抗氧化之功效。

在一些实施例中，白利糖度(Degrees Brix)值为10以上的咖啡樱桃汁液可提升氧化相关基因的表现量，藉以清除体内自由基，达到抗氧化之功效。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以制备肌肤美白及/或提升肌肤光泽之组合物。

肌肤之所以会呈现较深的颜色系因黑色素之生成，而在黑色素生成的过程中，酪胺酸酶(Tyrosinase)占据举足轻重之地位。酪胺酸酶是一种氧化酶，系调控黑色素生成的限速酶。具体而言，酪胺酸酶参与了黑色素合成的两个反应： (1)将单酚羟基化为二酚，(2)将邻二酚氧化为邻二醌。酪胺酸酶系存在于皮肤黑色素细胞中，系由TYR基因转录所形成。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以透过抑制酪胺酸酶之形成以达到抑制、预防或减缓肌肤黑色素之形成，进而达到肌肤美白及/或提升肌肤光泽之功效。

在一些实施例中，浓度为0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可以用于提升肌肤光泽及/或提升肌肤之白皙程度。

在一些实施例中，浓度为0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可以用于淡化肌肤斑点。在一些实施例中，该肌肤斑点为紫外线所造成之斑点。在一些实施例中，该肌肤斑点包含肌肤表层之斑点以及肌肤深层之斑点。

在一些实施例中，白利糖度(Degrees Brix)值为10以上的咖啡樱桃汁液可以用于提升肌肤光泽及/或提升肌肤之白皙程度。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以制备用于肌肤保湿组合物之用途，其中该咖啡樱桃汁液系以含水之相关溶剂进行提取所得，且其中该咖啡樱桃汁液是通过提升保湿相关基因之表现量以达到该肌肤保湿之效果。

在日常活动中，肌肤容易因为天气、外在环境、甚或自身自然衰老的情况下，造成肌肤之水分散失。而此散失会因肌肤表皮细胞间之缝隙较大而加速，进而造成肌肤光泽降低、肌肤保湿度下降等。

在一些实施例中，保湿相关基因包含TGM1基因(GeneID:7051)、KRT1 基因(GeneID:3848)、KRT14基因(GeneID:3861)、AQP3基因(GeneID: 360)、GBA基因(GeneID:2629)、FLG基因(GeneID:2312)、HAS2基因(GeneID:3037)、HAS3基因(GeneID:3038)。

换言之，咖啡樱桃汁液可藉由提高上述基因表现量，提升肌肤保湿相关基因之表现量以达到改善皮肤状态之功效。

在一些实施例中，浓度为0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可以提升肌肤之保湿能力。

在一些实施例中，白利糖度(Degrees Brix)值为10以上的咖啡樱桃汁液可以提升肌肤之保湿能力。

在一些实施例中，咖啡樱桃汁液可以用于制备抚平皱纹及/或改善肌肤纹理之组合物之用途。

在一些实施例中，浓度为0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可以抚平皱纹及 /或改善肌肤纹理。

在一些实施例中，浓度为0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可以紧致肌肤毛孔。

在一些实施例中，白利糖度(Degrees Brix)值为10以上的咖啡樱桃汁液可以提升肌肤分泌玻尿酸之能力。

玻尿酸(hyaluronic acid,HA)存在于人体的结缔组织及真皮层中，是一种透明的胶状物质，负责结合及保留肌肤中的水分子。而皮肤中的玻尿酸占超过 50％的人体玻尿酸，且其为细胞外间质的主要成分，可维持皮肤本身的弹性。随着年龄的增长，人体内的玻尿酸会逐渐流失，30岁时皮肤中的玻尿酸含量会剩下不到六成的含量。而此造成皮肤产生空隙，进而逐渐失去弹力而老化。

在一些实施例中，浓度为0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可以提升肌肤之胶原蛋白密度。

在一些实施例中，浓度为0.25mg/mL以上的咖啡樱桃汁液可以提升肌肤弹性。

在一些实施例中，前述之组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有有效含量的咖啡樱桃汁液。换言之，此医药品包含有有效含量的咖啡樱桃汁液。

在一些实施例中，前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于经肠道或口服的投药剂型。这些投药剂型包括，但不限于：锭剂 (tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。

在一些实施例中，前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这些投药剂型包括，但不限于：注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)以及类似之物。在一些实施例中，该医药品可以一选自于由下列所构成之群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，医药品可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列的试剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂 (wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。

在一些实施例中，医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成之群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

在一些实施例中，前述之组合物可为可食用组合物。在一些实施例中，此可食用组合物可以制成食品产品或可为食品添加物(food additive)，意即藉由习知方法于食材制备时添加而制得食品产品，或是于食品产品的制作过程中添加。于此，食品产品可以是与可食性材料配制成供人类或动物摄食的产品。

在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods) 以及膳食补充品(dietary supplements)。

在一些实施例中，前述组合物可为保养品组合物。在一些实施例中，此保养品组合物可为但不限于化妆水、凝胶、精华液、乳液、乳霜、洗脸或沐浴产品、防晒产品、美白产品、香膏、软膏、面膜。

范例一：本发明之制备-咖啡樱桃汁液的制备

粉碎程序中将咖啡樱桃之果皮作为咖啡樱桃原料并进行粉碎。于此，采用osterizer品牌的10 speed blender进行粉碎。接着，加热程序中以水为溶剂，将粉碎后的咖啡樱桃原料与水以1:15的重量比例混合后在85±℃下提取60分钟。于此，提取可以是将咖啡樱桃原料浸泡在水中。后续，降温程序将粉碎后的咖啡樱桃原料与水降温到室温(25℃)。此后，过滤程序将降温后的咖啡樱桃原料及水通过400网目的筛网以形成过滤液。接着，于60℃下对过滤液进行减压浓缩而得本发明之咖啡樱桃汁液。

范例二：定量实验-咖啡樱桃汁液总黄酮定量实验

将范例一中所得到之咖啡樱桃汁液以水，依其体积做10倍稀释后，取 200μL到试管中。于此试管内加入200μL 5wt％亚硝酸钠(购自Sigma，商品编号31443)水溶液，混合均匀后静置反应6分钟。

接着，加入200μL 10wt％硝酸铝(购自Alfa Aesar，商品编号12360)水溶液，混合均匀后静置反应6分钟，再加入2mL 4wt％氢氧化钠水溶液(氢氧化钠购自Macron，产品编号7708-10)，使其混合均匀。最后再加入1.4mL的水于试管中并混合均匀得到反应液，取试管中200μL反应液至96孔反应盘中，以分光亮度计(Jasco，型号V-730)于500nm的波长下侦测吸光值。

接着配制标准品以制作检量线。本案以芸香素(rutin，购自ChromaDex，商品编号ASB-00018440)当量作为总黄酮相对含量的表示。先配制200μg/mL 之芸香素甲醇溶液，作为芸香素标准液。取该芸香素标准液0μL、200μL、400μL、 600μL、800μL及1000μL分别加入至不同试管中，再于该些试管中加入水，使其各试管内之总体积为1200μL。接着，针对每一试管，从试管中分别取200μL 之芸香素标准溶液至另一新试管，再于此试管内加入200μL5wt％亚硝酸钠水溶液，混合均匀后静置反应6分钟。接着加入200μL 10wt％硝酸铝水溶液，混合均匀后静置反应6分钟，再加入2mL 4wt％氢氧化钠水溶液，使其混合均匀。最后再加入1.4mL的水于此试管中并混合均匀得到反应液，取试管中200μL 反应液至96孔反应盘中，以分光亮度计于500nm的波长下侦测吸光值。将六种不同浓度的芸香素溶液依相同方式所测得之吸光值，绘制成检量线。

接着，利用检量线将稀释后的咖啡樱桃汁液的吸光值换算成总黄酮含量。于此，可推算出稀释前的咖啡樱桃汁液(即例1中所得到之咖啡樱桃汁液)的总黄酮含量为2000ppm。

已知黄酮并非为本案所述改善肌肤状态、抗氧化、或美白的活性成分，但由于已知黄酮可具有其他例如预防心血管疾病等之用途，而由本案提取方式所得之咖啡樱桃汁液具有高总黄酮含量，故本案之咖啡樱桃汁液可具有多种复合用途。此外，在一些实施例中，此总黄酮含量亦可作为浓缩终点的判断基准。

范例三：定量实验-咖啡樱桃汁液总多酚含量

将范例一中所得到之咖啡樱桃汁液以水，依其体积做10倍稀释后，取 100μL到试管中。而后，于此试管内添加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent，购自Merck，货号1.09001.0100)，混合均匀并静置3分钟，接着添加400μL的7.5wt％碳酸钠(购自Sigma，商品编号31432)水溶液于试管中，使其混合均匀并反应30分钟。再经由振荡(vortex)确保溶液中无气泡后，取其中之200μL溶液于750nm的波长下测量吸光值。

接着，配制标准品以制作检量线。本案以没食子酸(Gallic acid)当量作为总多酚相对含量的表示。于此，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、 80μL/mL、及100μL/mL之没食子酸(没食子酸购自Sigma，产品编号G7384) 的标准溶液，并分别取100μL之各浓度的标准溶液至不同试管中。针对各试管，于其中添加500μL的佛萧酚试剂，混合均匀并静置3分钟，接着添加400μL的 7.5wt％碳酸钠水溶液于试管中，使其混合均匀并反应30分钟。再经由振荡 (vortex)确保溶液中无气泡后，取其中之200μL溶液于750nm的波长下测量吸光值。将六种不同浓度的没食子酸标准溶液依相同方式所测得之吸光值，绘制成检量线。

接着，利用检量线将稀释后的咖啡樱桃汁液的吸光值换算成总多酚含量。于此，可推算出稀释前的咖啡樱桃汁液(即范例1中所得到之咖啡樱桃汁液) 的总多酚含量为1000ppm。

已知多酚并非为本案所述改善肌肤状态、抗氧化、或美白的活性成分的活性成分，但由于已知多酚可具有其他例如预防心血管疾病等之用途，由本案提取方式所得之咖啡樱桃汁液有高的总多酚含量，故本案之咖啡樱桃汁液可具有多种复合用途。此外，在一些实施例中，此总多酚含量亦可作为浓缩终点的判断基准。

范例四：试管实验-抗醣化试验

当蛋白质经醣化反应后将生成多种醣化终产物(Advanced glycation endproducts，AGEs)，其为不可还原之物质，并改变及影响蛋白质的正常功能，导致胶原蛋白硬化、产生斑点、造成肌肤松弛、肌肤机能降低。因此，若能抑止胶原蛋白醣化则可防止胶原蛋白链断裂，并降低胶原蛋白的流失速度、推迟肌肤老化与松弛。而为确认咖啡樱桃汁液是否具有抑止胶原蛋白醣化的功效，进行胶原蛋白醣化量测试如下。

药品配制：

使用前方范例一中所制得之咖啡樱桃汁液，以浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate-Buffered Saline，PBS，系以NaH₂PO₃(Honeywell，#04269)、 Na₂HPO₄(Sigma，#V900061)与水配制而成，其pH值为7.4)作为溶剂，配制出浓度为10mg/mL的咖啡樱桃汁液溶液。

使用前述浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水以及胶原蛋白粉末(胶原蛋白购自Rousselot，型号#P2000HD)，配制浓度为60mg/mL的胶原蛋白溶液。另加入迭氮化钠于胶原蛋白溶液中，使胶原蛋白溶液中含有0.06wt％的迭氮化钠。(迭氮化钠购自Sigma，#S2002)

使用前述浓度200mM的磷酸盐缓冲生理盐水与果糖(果糖购自Sigma， #F0127)，配制浓度为1.5M的果糖溶液。

胶原蛋白醣化测试：

将前述的咖啡樱桃汁液溶液0.2mL，与0.2mL前述胶原蛋白溶液以及0.2 mL前述果糖溶液进行混合，配制出样品溶液。

将0.2mL的去离子水与0.2mL前述胶原蛋白溶液以及0.2mL前述果糖溶液进行混合，配制出空白溶液作为控制组。

将样品溶液以及空白溶液于进行胶原蛋白醣化反应前，使用分光荧光计(spectrofluorometer，厂商/型号：BioTek FLx 800)测量其荧光强度(激发波长360nm，放射波长460nm)。

将样品溶液以及空白溶液置于50℃反应24小时，使各溶液进行胶原蛋白醣化反应。

将反应后的样品溶液以及空白溶液，同样以分光荧光计测量其荧光强度(激发波长360nm，放射波长460nm)。

依下列公式计算蛋白质醣化终产物相对生成率：

[(样品荧光强度_反应后-样品荧光强度_反应前)/(控制组荧光强度_反应后-控制组荧光强度_反应前)]×100％

样品相对于控制组的蛋白质醣化终产物相对生成率显示于图2。

如图2所示，在经本发明之咖啡樱桃汁液处理后，醣化终产物之生成率降低，显示本发明之咖啡樱桃汁液具有抑止胶原蛋白的醣化终产物产生的效果。其中，样品溶液中的蛋白质醣化终产物相对生成率仅为控制组的40％。显示本发明之咖啡樱桃汁液确实可抑止胶原蛋白的醣化反应，减少醣化终产物的生成，进而降低体内胶原蛋白的流失，达到减缓肌肤老化及肌肤机能丧失的功效。

范例五：细胞实验-抗氧化试验

于此，以荧光探针DCFH-DA配合流式细胞仪，测定人类皮肤纤维母细胞 CCD-966sk经本发明之咖啡樱桃汁液处理后，是否能提升抵抗醣化终产物之氧化压力。

材料与仪器

1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk，取自生物资源保存及研究中心(BCRC)；Cat.60153。

2.细胞培养基：含有10vol％FBS(购自Gibco)之基础培养基。其中，基础培养基是由Eagle’s最低限度基本培养基(Eagle’s minimum essential medium(MEM)，购自Gibco，产品编号15188-319)额外添加成分使其含有 1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Gibco)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate，购自Sigma，Cat.S5761-500G)及0.1mM非必需胺基酸 (non-essential amino acid solution，购自Gibco)所配制而成。

3.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco，产品编号10437-028。

4.DCFH-DA溶液：将二氯二氢荧光素二乙酸酯 (2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；产品编号SI-D6883，购自Sigma)溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，购自Sigma，产品编号SI-D6883-50MG)以配制成5mg/ml的DCFH-DA溶液。

5.流式细胞仪(Flow cytometry)，BD Accuri C6 Plus。

6.双氧水(H₂O₂)：购自Sigma-Aldrich，产品型号95299-1L。

7.葡萄糖(Glucose)：购自Sigma，产品型号50-99-7。

8.胎牛胶原蛋白(Bovine Collagen)：购自Sigma，产品型号C2124。

9.咖啡樱桃汁液：此实验中所使用的咖啡樱桃汁液，系以范例一之方式制备而成。

实验步骤

实验将会分为实验组、空白控制组(未添加咖啡樱桃汁液、亦无经过醣化终产物处理的组别)、以及对照组(未添加咖啡樱桃汁液，但经过醣化终产物处理的组别)三组进行，各组分别进行二重复试验：

1.醣化终产物制备：在1X PBS中配置50mg/ml的胎牛血清及0.5M的葡萄糖溶液在70℃烘箱反应四天。

2.将CCD966-sk细胞以每孔4×10⁴个的方式，接种于每孔含2ml培养基之 96孔培养盘中。

2.将培养盘置于5％CO₂、37℃下，培养24小时。

3.移除培养基。

4.加入2mL实验培养基至培养盘的各孔中，并于37℃下培养1小时。

实验组的实验培养基为添加有5μL的范例一得到的咖啡樱桃汁液之2mL 细胞培养基(即0.25mg/mL)。

控制组的实验培养基为单纯的2mL细胞培养基(即不含咖啡樱桃汁液)。

对照组的实验培养基为单纯的2mL细胞培养基(即不含咖啡樱桃汁液)。

5.添加步骤1.所配制之醣化终产物于各组之孔中，培养3小时。

6.添加浓度为5μg/mL的DCFH-DA溶液2μL于每孔中的细胞培养基，使 DCFH-DA处理细胞30分钟。

7.于DCFH-DA处理后，将各孔中之细胞与细胞培养基收集并将含有细胞与培养基之离心管以400xg离心5分钟。

8.离心后，移除上清液，并以1X PBS溶液回溶细胞沉淀物。

9.再以400xg离心5分钟。

10.离心后，移除上清液，于暗处以以200μL的1X PBS溶液再次悬浮细胞，以得到待测细胞液。

11.使用流式细胞仪侦测各孔的待测细胞液中DCFH-DA的荧光信号。进行荧光侦测之激发波长为450-490nm，放射波长为510-550nm。由于DCFH-DA 进入细胞后会先被水解为DCFH(二氯二氢荧光素)，再被活性氧物质氧化为可发出绿色荧光的DCF(二氯荧光素)，经DCFH-DA处理之细胞的荧光强度可反映细胞内活性氧物质含量，并藉此得知细胞内活性氧物质高度表现的细胞数占原细胞数的比例。因实验系进行二重复，故将各组的二重复实验之量测结果平均以取得平均值，然后以控制组的平均值为100％之相对ROS的生成量，将对照组与实验组的平均值换算为相对ROS的生成量，如图3所示。

实验结果

如图3所示，由比较控制组、对照组的结果可知，在经过醣化终产物处理后，相对ROS的生成量(高荧光表现)会大幅增加；其显示醣化终产物处理确实会导致细胞内产生活性氧物质，进而对人类单核球细胞产生后续伤害。另一方面，根据比较对照组以及实验组的结果可知，当细胞经过咖啡樱桃汁液处理后，相对ROS的生成量明显减少约44％；其显示咖啡樱桃汁液可有效减少醣化终产物造成的氧化压力及活性氧物质在细胞内的产生或累积。换言之，咖啡樱桃汁液具抵抗活性氧物质之能力。亦即，咖啡樱桃汁液可抵抗细胞内活性氧物质含量，减少细胞受到活性氧物质等所导致的氧化伤害。

范例六：细胞实验-皮肤紧致实验

为了解咖啡樱桃汁液是否具有提升皮肤紧致度的效果，系以MEM培养基培养人类皮肤纤维母细胞(CCD-996sk；购自BCRC，产品编号：60153)，历时24小时，其后进行以下处理：

A.控制组：

1.以500微升体积计，将0.66倍体积的细胞置于一灭菌管中，加入0.33 倍体积的3毫克/毫升之第一型胶原蛋白(Collagen I；购自Gibco公司，产品编号：A10483-01)溶液，接着快速加入适量的1莫耳浓度(M)的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液的量需至少为可将酚红指示剂(phenol red medium indicator)转为浅粉色所需的用量)，上下混合溶液三次，以提供一混合物；

2.取500微升上述步骤1提供之混合物置入一24孔培养盘中，于室温下静置20分钟，使其固化为一凝胶；以及

3.加入500微升的MEM培养基，并小心地将凝胶的周围与培养盘分离，使凝胶悬浮于MEM培养基中，再将培养盘置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，历时6小时。

B.AGEs组：

(1)以500微升(μL)体积计，将0.66倍体积的细胞置于一灭菌管中，加入0.33倍体积的3毫克/毫升之第一型胶原蛋白溶液，接着快速加入适量的 1莫耳浓度(M)的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液的量需至少为可将酚红指示剂(phenol red medium indicator)转为浅粉色所需的用量)，并添加[制备实施例E]提供之醣化胎牛血清白蛋白，上下混合溶液三次，以提供一混合物；

(2)取500微升上述步骤(1)提供之混合物置入一24孔培养盘中，于室温下静置20分钟，使其固化为一凝胶；以及

(3)加入500微升的MEM培养基，并小心地将凝胶的周围与培养盘分离，使凝胶悬浮于MEM培养基中，再将培养盘置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，历时6小时。

C.汁液组：比照「AGEs组」的步骤进行配制，但于步骤(3)中进一步添加 [制备实施例A]提供之咖啡樱桃提取原液，使其于所加入的MEM培养基中的浓度达到0.25毫克/毫升，最后，每隔3小时观察凝胶的轮廓变化，并以数字相机拍摄凝胶，持续观察6小时。其后，将第6小时所拍摄之图像以Image J 软件进行分析，记录各组凝胶的轮廓并计算其表面积(凝胶的表面积越小代表收缩能力越强)。最后，以学生t检验(Student t-test)进行统计分析，并以「控制组」之结果作为基准(即，将「控制组」设定为100％)计算「AGEs组」及「汁液组」的凝胶的收缩能力。

实验结果

如图4所示，由比较控制组、对照组的结果可知，在经过醣化终产物处理后，弹性能力会将低至73.19％；其显示醣化终产物处理确实会导致细胞之弹性能力会将低，进而对细胞产生后续伤害。另一方面，根据比较对照组以及实验组的结果可知，当细胞经过咖啡樱桃萃取物处理后，弹性能力明显恢复至 99.85％；其显示咖啡樱桃萃取物可有效减少醣化终产物造成的弹性能力的降低。换言之，咖啡樱桃萃取物具提升皮肤紧致之功能。

范例七：保湿相关基因试验

此范例以RNA提取套组、反转录酶、KAPA

FAST qPCR试剂组配合定量PCR仪，测定人类表皮角质细胞HPEK-50经本发明之咖啡樱桃汁液处理后，细胞中保湿相关基因的变化。

材料与仪器

角质细胞专用之无血清培养基(Keratinocyte-SFM；购自Thermo，产品编号17005042)。

人类表皮角质细胞(以下简称HPEK-50细胞或角质细胞；购自 CELLnTEC)。

RNA提取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)。

反转录酶(

III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美国，编号18080-051)。

测量目标基因引子，其中包含HAS2基因、HAS3基因、KRT1基因、KRT14 基因、AQP3基因、GBA基因及FLG基因，另包括内部控制组(TBP基因)。

KAPA

FAST qPCR试剂组(购自Sigma公司，美国，编号 38220000000)。

ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))。

咖啡樱桃汁液：由本案范例一所述之制备方式所得之咖啡樱桃汁液。

实验步骤

细胞培养的实验流程如下：

于此，培养基采用角质细胞专用之无血清培养基。

首先以每孔1×10⁵个细胞量培养于含有2mL上述培养液之六孔培养盘中，并在37℃下培养16小时，然后将HPEK-50细胞分为实验组与控制组。

实验组：每毫升培养液含有0.25mg范例一之方式制备而成之咖啡樱桃汁液汁液的比例(即，浓度为0.25mg/mL)制得含汁液的培养液，将HPEK-50细胞更换为含汁液的培养液中继续培养。

控制组：不做任何处理，即不额外添加其他化合物至含有培养后的HPEK-50细胞的培养液中。

实验组与控制组于培养6小时后，将培养后的实验组与控制组细胞以RNA 提取试剂套组的细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。

聚合酶连锁反应的实验流程如下：

使用RNA提取试剂套组分别收集二组细胞溶液内之RNA。

接着，每组取2000奈克(ng)所提取出的RNA为模板，藉由

III反转录酶以表2中之引子(primer)黏合进行反转录作用产生相应之cDNA。

后续利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST将二组反转录后产物分别以表2之组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察实验组和控制组的HPEK-50细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。

尔后，使用2^-ΔΔCt方法测定目标基因的相对表现量。所谓相对表现量定义为实验组之一目标基因相对于控制组或对照组之同一基因的RNA表现量倍数变化。该方法以TBP基因的循环阈值作为内部对照之参考基因的循环阈值 (Ct)，按照以下公式计算倍数变化：

Ct＝Ct_{实验组之目标基因/控制组或对照组之目标基因}-Ct_TBP

△Ct＝△Ct_{实验组之目标基因}-△Ct_{控制组之目标基因}

倍数变化＝2^{-ΔΔCt平均值}

5.最终，利用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾Student t-test分析是否具有统计上显着差异(*p值<0.05；**p值<0.01； ***p值<0.001)。其中，HAS2基因对应的引子对为HAS2-F以及HAS2-R， HAS3基因对应的引子对为HAS3-F以及HAS3-R，KRT1基因对应的引子对为 KRT1-F以及KRT1-R，KRT14基因对应的引子对为KRT14-F以及KRT14-R， AQP3基因对应的引子对为AQP3-F以及AQP3-R，GBA基因对应的引子对为GBA-F以及GBA-R，FLG基因对应的引子对为FLG-F以及FLG-R。

表1

实验结果

参照图5-9。图5为经本发明咖啡樱桃汁液处理之实验组与未经本发明咖啡樱桃汁液处理之控制组之HAS2基因与HAS3基因之相对表现量之直方图；图6为经本发明咖啡樱桃汁液处理之实验组与未经本发明咖啡樱桃汁液处理之控制组之KRT1基因与KRT14基因之相对表现量之直方图。图7-9则分别为经本发明咖啡樱桃汁液处理之实验组与未经本发明咖啡樱桃汁液处理之控制组之 AQP3基因、GBA基因及FLG基因之相对表现量之直方图(图式中「*」代表 p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着)。

由图5可知，当控制组之HAS2基因与HAS3基因表现量为100％时，实验组之HAS2基因与HAS3基因分别约为120％、138％。换言之，与控制组相较之下，实验组的角质细胞中的之HAS2基因与HAS3基因分别提升20％与 38％，且均达统计学上之显着差异。

由图6可知，当控制组之KRT1基因与KRT14基因表现量为100％时，实验组之KRT1基因与KRT14基因分别约为276％与118％。换言之，与控制组相较之下，实验组的角质细胞中的之HAS2基因与HAS3基因之表现量分别提升176％与18％，且均达统计学上之显着差异。

由图7-9可知，当控制组之AQP3基因、GBA基因与FLG基因表现量为 100％时，实验组之AQP3基因、GBA基因与FLG基因表现量分别约为185％、 240％及147％。换言之，与控制组相较之下，实验组的角质细胞中的之AQP3 基因、GBA基因与FLG基因表现量分别提升85％、140％与47％，且均达统计学上之显着差异。

其中，HAS2基因所转录出之蛋白质能制造高分子玻尿酸——其具有黏性及支撑特性，且可用于支撑肌肤的结构、改善肌肤松弛。而HAS3基因所转录出之蛋白质可合成小分子玻尿酸——其具有保水特性，可维持肌肤的保水性，改善肌肤皱纹及细纹。

KRT1基因以及KRT14基因所转录出之蛋白质则有助于维持角质结构紧密完善、及/或能达到保护肌肤之能力。具体而言，KRT1基因及KRT14基因分别承载制备角蛋白1(keratin1)及角蛋白14(keratin14)的信息。角蛋白是一种纤维状蛋白质，其组成了角质细胞(keratinocytes)之主要架构。角蛋白1及角蛋白14相互结合形成角蛋白中间纤维(intermediate filaments)，而这些中间纤维所形成的坚固网络，可为皮肤提供强度和弹性，并保护其免受摩擦和其他日常物理性的损害，其亦可使皮肤表皮细胞较紧密排列，减少水分经由皮肤细胞间之缝隙散失之比例，进而达到肌肤保湿之功效。

APQ3基因与GBA基因所转录出的蛋白质则分别具维持表皮层甘油含量及调控神经酰胺(Ceramide)合成，其基因表现量之提升均有助于提升肌肤锁水能力。而FLG基因所转录出之蛋白质具有合成天然保湿因子之功能，有助于提升肌肤保湿之能力。

因此，由上述图及叙述可知，本案之咖啡樱桃汁液可透过提升HAS2基因、 HAS3基因、KRT1基因、KRT14基因、APQ3基因、GBA基因、FLG基因之表现量，达到支撑肌肤的结构、改善肌肤松弛、防止肌肤水分过度散失、促进皮肤表皮细胞紧密排列，减少水分经由皮肤细胞间之缝隙散失之比例、增强肌肤保湿度、维持表皮层甘油含量及调控神经酰胺合成，进而改善肌肤外观等功能。

范例八：人体试验-以口服方式使用咖啡樱桃汁液

于此，令受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品，探讨以内服之方式使用本发明之咖啡樱桃提取之肌肤改善效果。

使用样品：含本发明之咖啡樱桃提取之饮品50g/瓶，其中包含：咖啡樱桃提取14wt％、蔗糖素0.016wt％、柠檬酸0.2wt％、水85.784wt％…。在另一些其他的实施例中，每人一日可摄取咖啡樱桃汁液至多10g。其中，此咖啡樱桃汁液系由范例1之方法所制备而成。其他内容物为增添风味、提升饮品保存期限用，已知其并非具有本发明之肌肤外观改善、肌肤保湿等功效。

受试者人数：40位20岁以上之受试者。

实验方式

收集40位受试者，于使用受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品前(脸部已清洁，第0周)，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录脸部肌肤之数值。

接着，随机挑选20位受试者作为安慰剂组，其余20位作为实验组。其中，实验组每日饮用一瓶含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品(每瓶含有7mL本发明之咖啡樱桃汁液)，共饮用56日(即8周)。而安慰剂组则每日饮用一瓶安慰剂饮品(饮品内除以相同水量取代本发明之咖啡樱桃汁液之外，其余内容物均与实验组所饮用之饮品相同)。

安慰剂组与实验组之受试者分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品28日与56日后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录脸部肌肤之数值。(于饮用前、后进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，且于进行试验期间，受试者之饮食习惯与生活作息均未改变，以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)。

检测项目

将分别进行1.肌肤含水量、2.肌肤胶原蛋白密度、3.肌肤弹性、4.肌肤皱纹、 5.肌肤纹理、6.肌肤斑点、7.肌肤白皙度之检测。

1.肌肤含水量

使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司之肌肤含水量检测探头

CM825(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测。该检测探头系基于电容的原理进行测量。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量。

2.肌肤胶原蛋白密度

使用肌肤弹力检测探头

MPA580(C+K Multi Probe AdapterSystem,Germany)对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测。测试原理是基于吸力和拉伸原理，在被测试的皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进一个测试探头内，透过光学测试系统检测皮肤被吸进探头内的深度，并以软件分析计算皮肤弹性。

3.肌肤弹性

同样系使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司之肌肤弹力检测探头

MPA580(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测。测试原理是基于吸力和拉伸原理，在被测试的皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进一个测试探头内，透过光学测试系统检测皮肤被吸进探头内的深度，并以软件分析计算皮肤弹性与紧实度。

4.肌肤皱纹

使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率之相机镜头对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行拍摄，藉由标准白光照射、侦测皮肤阴影的变化，即可侦测纹理位置并得到一数值，可代表皮肤的平滑程度。

5.肌肤纹理

使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测，其原理乃以可见光拍摄高分辨率之肌肤影像，并以内建软件根据皮肤的凹陷与凸起进行粗糙度分析。测量数值越高，说明皮肤越越粗糙。

6.肌肤斑点

A.使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测。该仪器系以UV光进行脸部肌肤拍摄及RBX偏振光技术进行脸部肌肤拍摄。紫外线可被黑色素吸收，提高色素斑的显现度，侦测肉眼不可见的表皮层黑色素斑。测量数值越高，说明紫外线色斑越多。而RBX偏振光可侦测肉眼不可见的真皮层黑色素斑。测量数值越高，说明棕色斑越多。

7.肌肤色泽

使用爱尔兰公司Miravex的Antera 3D分析肌肤实证镜头对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测。该仪器系对肌肤以不同角度发射不同波段的LED(lightemitting diodes)，透过传感器收集其反射后以计算机协作重组肌肤表面。肌肤肤色系以其Colorimeter色度分析功能，分析肌肤的L*a*b*颜色数值，其中L*代表亮度，a*和b*表示颜色对立维度。就两色

与

之肤色差异

系以以下公式计算：

因本实施例主要测量为美白程度之变化，因此主要观测L*值，当L*值愈高，代表肤色亮度愈高，肌肤愈白。

请参阅图10。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品后之肌肤含水量之平均改善百分比，而饮用第4周及第8周之改善之人数比例分别占达受试人数之90％与95％。其中，当实验组受试者于饮用前之平均肌肤含水量为100％时，饮用4周后之平均肌肤含水量为104.3％，饮用8周后之平均为108.5％。换言之，实验组之受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品4周与8周后，平均肌肤含水量分别提升 4.3％与8.5％，均达统计上之显着(「**」符号代表与饮用前相比p值小于0.01；「***」符号代表与饮用前相比p值小于0.001)，且分别较安慰剂组改善情形高2.7％与6.0％(「#」符号代表与安慰剂组相比p值小于0.05；「###」符号代表与安慰剂组相比p值小于0.001)。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有提升肌肤含水量，锁住肌肤水分，以及提升肌肤保湿效果之功能。

请参阅图11。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品后之肌肤胶原蛋白密度之平均改善百分比，而饮用第4周及第8周之改善之人数比例均占达受试人数之100％。其中，当实验组受试者于饮用前之平均肌肤胶原蛋白密度为100％时，饮用4周后之平均肌肤胶原蛋白密度为107.5％，饮用8周后之平均为111.6％。换言之，实验组之受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品4周与8周后，平均肌肤胶原蛋白密度分别提升7.5％与11.6％，均达统计上之显着(「**」符号代表与饮用前相比p值小于0.01；「***」符号代表与饮用前相比p值小于0.001)，且分别较安慰剂组改善情形高5.5％与6.5％(「#」符号代表与安慰剂组相比p值小于0.05)。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有提升胶原蛋白分泌、增加肌肤胶原蛋白密度、维持肌肤机能之功能。

请参阅图12。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品后之肌肤弹性之平均改善百分比，而饮用第4周及第8周之改善之人数比例分别占达受试人数之90％与95％。其中，当实验组受试者于饮用前之平均肌肤弹性为100％时，饮用4周后之平均肌肤弹性为108.3％，饮用8周后之平均为114.5％。换言之，实验组之受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品4周与8周后，平均肌肤弹性分别提升8.3％与 14.5％，均达统计上之显着(「***」符号代表与饮用前相比p值小于0.001)，且分别较安慰剂组改善情形高5.6％与11.6％(「##」符号代表与安慰剂组相比 p值小于0.01；「###」符号代表与安慰剂组相比p值小于0.001)。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有提升肌肤弹性之功能。

请参阅图13。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品后之肌肤5皱纹之平均改善百分比，而于饮用第4周与第8周改善之人数比例分别占达受试人数之70％与50％。其中，当实验组受试者于饮用前之平均肌肤皱纹量为100％时，饮用4周后之平均肌肤皱纹量为97.7％，饮用8周后之平均为84.6％。换言之，实验组之受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品4周与8周后，平均肌肤5皱纹分别减少2.7％与15.4％，且分别较安慰剂组减少10.2％与44.3％。

请参阅图14。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品后之肌肤纹理之平均改善百分比，而于饮用第4周与第8周改善之人数比例分别占达受试人数之65％与70％。其中，当实验组受试者于饮用前之平均肌肤纹理为100％时，饮用4周后之平均肌肤纹理为93.0％，饮用8周后之平均为90.5％。换言之，实验组之受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品4周与8周后，平均肌肤纹理分别减少7.0％与9.5％，且分别较安慰剂组减少3.7％与6.4％。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有抚平肌肤皱纹，改善肌肤纹理与降低肌肤粗糙程度之功能。

请参阅图15。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品后之肌肤斑点之平均改善百分比，而于饮用第4周与第8周改善之人数比例分别占达受试人数之65％与70％。其中，当实验组受试者于饮用前之平均肌肤斑点数量为100％时，饮用4周后之平均肌肤斑点数量为94.4％，饮用8周后之平均为93.2％。换言之，实验组之受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品4周与8周后，平均肌肤斑点数量分别减少5.6％与6.8％，且分别较安慰剂组减少5.7％与5.5％。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有淡化肌肤斑点，改善肌肤外观之功能。

请参阅图16。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别饮用安慰剂饮品与含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品后之肌肤色泽之平均改善百分比，而于饮用第4周与第8周改善之人数比例分别占达受试人数之70％与75％。其中，当实验组受试者于饮用前之平均肌肤色泽为100％时，饮用4周后之平均肌肤色泽为100.6％，饮用8周后之平均为102.0％。换言之，实验组之受试者饮用含本发明之咖啡樱桃汁液之饮品4周与8周后，平均肌肤色泽分别提升0.6％与 2.0％，均达统计上之显着(「*」符号代表与饮用前相比p值小于0.05；「**」符号代表与饮用前相比p值小于0.01)，且分别较安慰剂组改善情形高0.2％与 2.0％。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有肌肤美白，改善肌肤色泽与光泽之功能。

范例九：人体试验-以外用方式使用咖啡樱桃汁液

于此，令受试者使用含本发明之咖啡樱桃汁液之精华液，探讨以外用之方式使用本发明之咖啡樱桃提取之肌肤改善效果。

使用样品：含咖啡樱桃汁液精华液以及安慰剂精华液(其中的咖啡樱桃汁液替换成等重的水，其余成分均相同)。于此实施例中，各精华液系含20mL 的对应精华液。

含有咖啡樱桃汁液的精华液成分：三仙胶0.2wt％、馨鲜酮0.6wt％、1,3- 丁二醇5wt％、三乙醇胺0.1wt％、己二醇0.6wt％、咖啡樱桃汁液2wt％、增稠剂U2 0.1wt％，其余为水。其中，此咖啡樱桃汁液系由范例1之制备方式而得。

受试者人数：40位20岁以上之受试者。

实验方式

收集40位受试者，于使用受试者使用含本发明之咖啡樱桃汁液精华液之前(脸部已清洁，第0周)，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录脸部肌肤之数值。

接着，随机挑选20位受试者作为安慰剂组，其余20位作为实验组。其中，实验组每日早晚于请洗脸部后，使用一次含本发明之咖啡樱桃汁液精华液，共使用28日(即4周)。而安慰剂组则每日早晚使用一次安慰剂精华液。

安慰剂组与实验组之受试者分别使用安慰剂精华液与含本发明之咖啡樱桃汁液精华液14日与28日后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录脸部肌肤之数值。(于使用前、后进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，且于进行试验期间，受试者之饮食习惯与生活作息均未改变，以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)。

检测项目

将分别进行1.肌肤含水量、2.肌肤弹性、3.毛孔状态、4.肌肤斑点、5.肌肤 UV斑。

其中进行1.肌肤含水量、2.肌肤弹性与4.肌肤斑点测试所使用的仪器及其原理与范例八同。

3.毛孔状态

使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率之相机镜头对同一受试者在使用精华液前与使用后的面部肌肤进行检测。藉由标准白光照射，造成毛孔凹陷处产生阴影，毛孔会比周围的肤色更黑，故可以此侦测毛孔，然后利用软件根据毛孔数目、面积分析得到一数值，而数值越高则显示其毛孔数量、面积较多。

5.肌肤UV斑

使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测。该仪器系以UV光进行脸部肌肤拍摄。紫外线可被黑色素吸收，提高色素斑的显现度，侦测肉眼不可见的表皮层黑色素斑。测量数值越高，说明紫外线色斑越多。

请参阅图17。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别使用安慰剂精华液与含本发明之咖啡樱桃汁液精华液后之肌肤含水量之平均改善百分比，而使用第2周及第4周之改善之人数比例均占达受试人数之80％。其中，当实验组受试者于使用前之平均肌肤含水量为100％时，使用2周后之平均肌肤含水量为101.3％，使用4周后之平均为111.3％。换言之，实验组之受试者使用含本发明之咖啡樱桃汁液精华液2周与4周后，平均肌肤含水量分别提升1.3％与 11.3％，且分别较安慰剂组改善情形高1.8％与7.2％。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有提升肌肤含水量，锁住肌肤水分，以及提升肌肤保湿效果之功能。

请参阅图18。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别使用安慰剂精华液与含本发明之咖啡樱桃汁液精华液后之肌肤弹性之平均改善百分比，而使用第2周及第4周之改善之人数比例分别占达受试人数之95％与100％。其中，当实验组受试者于使用前之平均肌肤弹性为100％时，使用2周后之平均肌肤弹性为104.6％，使用4周后之平均为107.6％。换言之，实验组之受试者使用含本发明之咖啡樱桃汁液精华液2周与4周后，平均肌肤弹性分别提升4.6％与 7.6％，均达统计上之显着(「**」符号代表与饮用前相比p值小于0.01；「***」符号代表与饮用前相比p值小于0.001)，且分别较安慰剂组改善情形高3.2％与5.6％(「#」符号代表与安慰剂组相比p值小于0.05；「###」符号代表与安慰剂组相比p值小于0.001)。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有提升肌肤弹性之功能。

请参阅图19。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别使用安慰剂精华液与含本发明之咖啡樱桃汁液精华液后之肌肤毛孔状态之平均改善百分比，而使用第2周及第4周之改善之人数比例均占达受试人数之75％。其中，当实验组受试者于使用前之平均肌肤毛孔数量为100％时，使用2周后之平均肌肤毛孔数量为95.0％，使用4周后之平均为93.3％。换言之，实验组之受试者使用含本发明之咖啡樱桃汁液精华液2周与4周后，平均肌肤毛孔量分别减少 5.0％与6.7％，且分别较安慰剂组降低7.0％与8.7％。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有紧致肌肤毛孔之功能。

请参阅图20。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别使用安慰剂精华液与含本发明之咖啡樱桃汁液精华液后之肌肤斑点状态之平均改善百分比，而使用第2周及第4周之改善之人数比例分别占达受试人数之60％及70％。其中，当实验组受试者于使用前之平均肌肤斑点量为100％时，使用2周后之平均肌肤斑点量为97.0％，使用4周后之平均为92.2％。换言之，实验组之受试者使用含本发明之咖啡樱桃汁液精华液2周与4周后，平均肌肤斑点量分别减少3.0％与7.8％，且分别较安慰剂组降低2.8％与4.7％。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有淡化肌肤斑点之功能。

请参阅图21。该图系安慰剂组受试者与实验组受试者在分别使用安慰剂精华液与含本发明之咖啡樱桃汁液精华液后之肌肤UV斑状态之平均改善百分比，而使用第2周及第4周之改善之人数比例分别占达受试人数之90％与95％。其中，当实验组受试者于使用前之平均肌肤UV斑量为100％时，使用2周后之平均肌肤UV斑量为91.4％，使用4周后之平均为89.6％。换言之，实验组之受试者使用含本发明之咖啡樱桃汁液精华液2周与4周后，平均肌肤UV斑量分别减少8.6％与10.4％，且分别较安慰剂组降低7.8％与4.8％。由此可见，本发明之咖啡樱桃汁液具有淡化肌肤UV斑之功能。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

序列表

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 咖啡樱桃汁液用于改善肌肤的用途

<130> N/A

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAS2-F

<400> 1

cggtgctcca aaaaggcaaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAS2-R

<400> 2

acacaatgag ttgggcgaga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAS3-F

<400> 3

cacccatggg ggcttaactt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAS3-R

<400> 4

ctgcaggtcc cagttcacat 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KRT1-F

<400> 5

agagtggacc aactgaagag t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KRT1-R

<400> 6

attctctgca tttgtccgct t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KRT14-F

<400> 7

ttctgaacga gatgcgtgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KRT14-R

<400> 8

gcagctcaat ctccaggttc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AQP3-F

<400> 9

ggggagatgc tccacatcc 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AQP3-R

<400> 10

aaaggccagg ttgatggtga g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GBA-F

<400> 11

tccagttgca caacttcagc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GBA-R

<400> 12

ttgtgctcag cataggcatc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FLG-F

<400> 13

ggcaaatcct gaagaatcca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FLG-R

<400> 14

tgctttctgt gcttgtgtcc 20

Claims

1.一种咖啡樱桃汁液用于制备一抵抗及/或减缓醣化终产物生成的组合物的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液的总黄酮量大于2000ppm。

2.一种咖啡樱桃汁液用于制备一抵抗及/或减缓醣化终产物生成的组合物的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液的总多酚量大于1000ppm。

3.一种咖啡樱桃汁液用于制备一肌肤保湿组合物的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液的总黄酮量大于2000ppm。

4.一种咖啡樱桃汁液用于制备一肌肤保湿组合物的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液的总多酚量大于1000ppm。

5.根据权利要求3或4其中任一项所述的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液是通过强化皮肤细胞排列以达到该肌肤保湿。

6.根据权利要求3或4其中任一项所述的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液是通过提升肌肤玻尿酸分泌以达到该肌肤保湿。

7.一种咖啡樱桃汁液用于制备一提升肌肤弹性的组合物的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液的总黄酮量大于2000ppm。

8.一种咖啡樱桃汁液用于制备一提升肌肤弹性的组合物的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液的总多酚量大于1000ppm。

9.根据权利要求1、2、3、4、7或8其中任一项所述的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液的白利糖度值为10以上。

10.根据权利要求1、2、3、4、7或8其中任一项所述的用途，其特征在于，该咖啡樱桃汁液是以一含水的溶剂对一咖啡樱桃进行提取。

11.根据权利要求1、2、3、4、7或8其中任一项所述的用途，其特征在于，该组合物为一医药组合物、一保健食品组合物、一食品组合物、或一保养品组合物。