CN110037950A - 咖啡果肉萃取物的应用 - Google Patents
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Abstract
咖啡果肉萃取物的应用，包括使用咖啡果肉萃取物于美白、改善肤质、护肤、抗皮肤老化或制备一医药组合物的应用。该医药组合物可用以修复皮肤组织、预防皮肤疾病及／或治疗皮肤疾病。
Description
技术领域
本发明是关于咖啡果肉萃取物的应用，尤其是使用咖啡果肉萃取物于美白、改善肤质、护肤、抗皮肤老化、修复皮肤组织、预防皮肤疾病及/或治疗皮肤疾病。
背景技术
醣化反应(glycosylation)是指葡萄糖附着到蛋白质的化学反应过程，此反应会产生最终醣化终产物(advanced glycation end product，AGEs)。堆积于皮肤细胞中的最终醣化终产物不仅容易引起蛋白质的变性，导致皮肤皱纹产生、松弛等老化现象，也会引起活性氧化物的生成、造成氧化压力，致使皮肤细胞DNA损伤、影响皮肤细胞DNA正常功能，甚至诱发皮肤疾病。
咖啡是属于龙胆目茜草科(Rubiaceae,Gentianales)的一种，原产于非洲。咖啡树的每一个果实中有两颗咖啡豆，由羊皮层(Parchment；又称果壳、内果皮或豆荚)包裹着，该羊皮层经过干燥后外观极似羊皮纸，因而得名。在羊皮层之外的构造，由内而外依序为果胶层(Mucilage；又称黏膜或蜜)、果肉及外果皮(Outer Skin)。在咖啡的制造过程中，只取咖啡豆的部分进行烘培，剩余部分(例如果肉)通常被视为无用的废弃物而直接丢弃。
本申请发明人通过研究意外发现，咖啡果肉萃取物具有抵抗氧化压力以及提升皮肤保湿基因表现的效果，且通过人体试验发现，咖啡果肉萃取物具有减少皮肤黑色素、淡化皮肤斑点、增加皮肤光泽与含水量以及瞬效提升皮肤弹力的效果。前述发现，可将以往被视为废弃物的咖啡果肉，运用于美白、改善肤质、护肤、抗皮肤老化、修复皮肤组织、预防皮肤疾病及治疗皮肤疾病，深具经济价值。
发明内容
本发明的一个目的，在于提供一种使用咖啡果肉萃取物于以下的一种或多种的用途：美白、改善肤质、护肤及抗皮肤老化。较佳地，该萃取物是以一极性溶剂萃取咖啡果肉所提供，且该极性溶剂选自以下群组：水、C1-C4 醇类及前述的组合。较佳地，该萃取物是用于以下的一种或多种：保湿、紧致皮肤、减少皮肤细纹、改善皮肤干燥、提升皮肤光泽及帮助维持皮肤健康。较佳地，该萃取物以涂抹或口服的方式使用。
本发明的另一个目的，在于提供一种使用上述咖啡果肉萃取物于制备一医药组合物的用途，该医药组合物用于以下的一种或多种：修复皮肤组织、预防皮肤疾病及治疗皮肤疾病。较佳地，该医药组合物用于抑制皮肤细胞的蛋白质的醣化及/或降低氧化压力对皮肤细胞的伤害。较佳地，该皮肤疾病是皮肤干燥相关疾病(例如：鱼鳞癣)。较佳地，该医药组合物呈一适于口服、经皮投药或皮下注射的剂型。
本发明的再一个目的，在于提供一种使用上述咖啡果肉萃取物于制备一医药组合物的用途，该医药组合物用于提升以下基因的至少一种的表现： KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及HAS3基因。较佳地，该医药组合物呈一适于口服、经皮投药或皮下注射的剂型。
本发明的又一个目的，在于提供一种美白、改善肤质、护肤及/或抗皮肤老化的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的上述咖啡果肉萃取物。于根据本发明的方法中，该咖啡果肉萃取物可以一保养品、保健食品或美容饮品的形式投予至该有需要的个体。较佳地，该方法用于保湿、紧致皮肤、减少皮肤细纹、改善皮肤干燥、提升皮肤光泽及/或帮助维持皮肤健康。
本发明的又一个目的，在于提供一种修复皮肤组织、预防皮肤疾病及/ 或治疗皮肤疾病的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的上述咖啡果肉萃取物。于根据本发明的方法中，该咖啡果肉萃取物可以一医药组合物的形式投予至该有需要的个体。较佳地，该方法用于抑制皮肤细胞的蛋白质的醣化及/或降低氧化压力对皮肤细胞的伤害。举例言之，该方法可用于预防或治疗皮肤干燥相关疾病(例如：鱼鳞癣)。
本发明的又一个目的，在于提供一种KRT1基因、KRT14基因、AQP3 基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及/或HAS3基因表现的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的上述咖啡果肉萃取物。于根据本发明的方法中，该咖啡果肉萃取物可以一医药组合物的形式投予至该有需要的个体。
本发明的详细技术内容及部分具体实施方案，将描述于以下内容中，以供本发明所属技术领域中普通技术人员据以明了本发明的特征。
附图说明
图1显示在不同浓度之咖啡果肉萃取物存在的情形下，通过胶原蛋白醣化反应所产生的最终醣化终产物(AGEs)的量，结果说明本发明咖啡果肉萃取物具有抑制醣化反应(抗醣化)的效果；
图2显示本发明咖啡果肉萃取物于抑制氧化压力的效果，其中，“控制组”的细胞于不含咖啡果肉萃取物的培养基中培养24小时，“AGEs组”的细胞于不含咖啡果肉萃取物的培养基中培养24小时、再经醣化胎牛血清白蛋白处理3小时，“萃取物组”的细胞则于含咖啡果肉萃取物的培养基中培养24小时、再经醣化胎牛血清白蛋白处理3小时(***表示与“AGEs组”的结果有显著差异，p<0.001)；
图3A及图3B显示本发明咖啡果肉萃取物于提升皮肤紧致度的效果，其中，图3A显示“控制组”、“AGEs组”及“萃取物组”的凝胶悬浮于MEM 培养基中6小时后的外观，图3B显示“AGEs组”」“萃取物组”的凝胶的收缩能力，且其中，使用于“控制组”以制备凝胶的混合物并不含醣化胎牛血清白蛋白，且所获得的凝胶以不含咖啡果肉萃取物的培养基进行处理，使用于“AGEs组”以制备凝胶的混合物则含有醣化胎牛血清白蛋白，且所获得的凝胶也以不含咖啡果肉萃取物的培养基进行处理，使用于“萃取物组”以制备凝胶的混合物也含有醣化胎牛血清白蛋白，但所获得的凝胶以含有咖啡果肉萃取物的培养基进行处理(*表示与“AGEs组”的结果有显著差异， p<0.05)；
图4至图8显示本发明咖啡果肉萃取物于提升KRT1基因、KRT14基因、 AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及HAS3基因表现的效益，其中，图4显示各组细胞的KRT1基因及KRT14基因的表现量，图5显示各组细胞的AQP3基因表现量，图6显示各组细胞的GBA基因表现量，图 7显示各组细胞的FLG基因表现量，图8则显示各组细胞的HAS2基因及 HAS3基因的表现量，且其中，“控制组”的细胞于不含咖啡果肉萃取物的培养基中培养，“萃取物组”的细胞则于含有咖啡果肉萃取物的培养基中培养 (*表示与“控制组”的结果有显著差异，p<0.05；**表示与“控制组”的结果有显著差异，p<0.01；***表示与“控制组”的结果有显著差异，p<0.001)；
图9至图13分别显示以口服方式使用本发明咖啡果肉萃取物于降低皮肤黑色素、淡化皮肤褐斑、提升皮肤含水量、提升皮肤弹力及提升皮肤光泽度的效果(*表示与“第0周”的结果有显著差异，p<0.05)；以及
图14显示以涂抹方式使用本发明咖啡果肉萃取物于提升皮肤弹力的效果(*表示与“第0分钟”的结果有显著差异，p<0.05)。
具体实施方式
以下将描述根据本发明的部分具体实施方案；但是，在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的方案来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的内容。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中 (尤其是在权利要求书中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“治疗”，不应被解释为治疗一个体直至完全恢复，而应包括将一个体的疾病进展或症状维持在一实质上静态的程度、增加一个体的恢复速率、改善一具体病况的严重性或提高一患者的生命品质；所谓“预防”是指抑制或防止一具体病况的发作或维持敏感个体的良好健康状态或建立该个体对疾病的耐受性；所谓“个体”是指人类或非人的哺乳动物。
已知KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3等基因的表现量提升有助于维持细胞构造、帮助水分调节、促进保湿因子NMF生成、提升透明质酸合成量及提高细胞含水量。此外，前述基因表现低下或缺失则与皮肤老化及/或皮肤疾病(例如鱼鳞癣等皮肤干燥相关疾病)的发生有关，此可参见例如：A keratin scaffold regulates epidermal barrierformation, mitochondrial lipid composition,and activity.J.Cell Biol.211(5):1057-1075 (2015)、Hyaluronan Synthase 3Regulates Hyaluronan Synthesis inCultured Human Keratinocytes.The Journal of Investigative Dermatology.118:43-48 (2002)、Toll-like receptor 3activation is required for normal skin barrierrepair following UV damage.J Invest Dermatol.135(2):569-578(2015)、Expressionof differential genes involved in the maintenance of water balance in humanskin by Piptadenia colubrina extract.J Cosmet Dermatol.9(1):35-43(2010)、Newconcept of the pathogenesis of atopic dermatitis:Interplay among the barrier,allergy,and pruritus as a trinity.J Dermatol Sci.70(1):3-11(2013)、Thefilaggrin story:novel insights into skin-barrier function and disease.TrendsMol Med. 14(1):20-27(2008)及Filaggrin in the frontline:role in skin barrierfunction and disease.Journal of Cell Science.122(9):1285-1294(2009)，这些文献的全文并于此处以供参考。
因此，若可有效提升KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及/ 或HAS3基因的表现，即可达到帮助维持皮肤健康、保湿、紧致皮肤、减少皮肤细纹、抗皮肤老化、改善皮肤干燥、预防皮肤疾病及/或治疗皮肤疾病的效果。
本申请发明人研究发现，咖啡果肉萃取物具有抗醣化、抑制氧化压力以及提升皮肤保湿基因(例如KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及HAS3基因)表现的效果。且通过人体试验发现，咖啡果肉萃取物具有减少皮肤黑色素、淡化皮肤斑点、增加皮肤光泽与含水量以及瞬效提升皮肤弹力的效果。
因此，本发明是关于咖啡果肉萃取物的应用，尤其是使用咖啡果肉萃取物于美白、改善肤质、护肤及/或抗皮肤老化、使用咖啡果肉萃取物于制备一医药组合物以及对一有需要的个体投予一有效量的咖啡果萃取物的方法。其中，根据本发明所提供的咖啡果肉萃取物尤其可用于保湿、紧致皮肤、减少皮肤细纹、改善皮肤干燥、提升皮肤光泽、帮助维持皮肤健康；根据本发明所提供的医药组合物及方法可用于修复皮肤组织、预防皮肤疾病及/或治疗皮肤疾病。举例言之，该皮肤疾病是皮肤干燥相关疾病(例如：鱼鳞癣)。此外，根据本发明所提供的医药组合物及方法也可用于提升KRT1基因、 KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及/或HAS3 基因的表现。
本发明所采用的咖啡果肉萃取物是可通过以极性溶剂萃取咖啡果肉原料而提供，其中该极性溶剂可以为水、C1-C4醇类或其组合。其中，萃取溶剂的用量并无特殊限制，通常是采用可以分散原料的用量。举例言之，可于萃取步骤中采用极性溶剂：咖啡果肉＝1～30：1的重量比。于本发明一具体实施方案中，于容器中放入100克的咖啡果肉，再于其中加入2000毫升的水(此即，水与咖啡果肉的重量比为20：1)，以进行萃取。
于萃取步骤中，也可视所采用的极性溶剂来选用适宜的萃取时间。以采用水作为极性溶剂，且水：咖啡果肉的重量比为20：1为例，通常萃取历时 0.5至3小时。视需要地，可于进行萃取步骤时辅以例如加温、冷却、搅拌、超音波等其他操作，以提升萃取效果。举例言之，可于50至100℃的温度下进行该萃取步骤。于本发明一具体实施方案中，于85±5℃下进行萃取，历时1小时。此外，为尽可能达到最大的萃取效益，视需要地，可以相同或不同的极性溶剂对咖啡果肉原料进行重复萃取，并合并该多次萃取所得的萃取液。
于上述萃取步骤完成之后，可视需要进行例如固液分离(例如过滤、离心)、减压浓缩、干燥(例如：热风干燥、冷冻干燥、喷雾干燥)、稀释及灭菌等操作，以提升萃取液的使用便利性。
根据本发明所提供的咖啡果肉萃取物可以涂抹或口服的方式使用。举例言之，根据本发明所提供的咖啡果肉萃取物可以例如乳液、乳霜、凝胶(例如水凝胶)、溶液(例如精华液、化妆水)等保养品的形式使用，也可以例如保健食品、美容饮品等供吞食或饮用的形式使用，但不以此为限。此外，视使用形式及用途而定，可以一日一次、一日多次、或多日一次等不同频率使用根据本发明所提供的含有咖啡果肉萃取物的保养品、保健食品及美容饮品。也可针对特定族群的需要，调整前述保养品、保健食品及美容饮品中咖啡果肉萃取物的含量。
根据本发明所提供的医药组合物可通过全身或局部投药，且可通过各种药物传递系统(drug delivery system，DDS)进行传递，包括口服药物传递系统(oral drugdelivery system)、经皮药物传递系统(transdermal drug delivery system)、注射传递系统(injection delivery system)等。举例言之，但不以此为限，根据本发明所提供的医药组合物可以通过微脂体(liposome)、微胶囊(microcapsule)、奈米微粒(nanoparticle)、微针(microneedle)等系统进行传递，以达到提高生物利用率、控制药物释放速度、针对病灶精准投药、减少药物副作用等目的。
根据本发明所提供的医药组合物可呈任何适宜的型式，并无特殊限制，端视所欲的用途而呈对应的适宜剂型。举例言之，但不以此为限，该医药组合物可以口服或非经口服(例如：经皮投药、皮下注射)的投药方式施用至有需要的个体上。视使用形式及用途而定，可选用适宜的载剂以提供该医药组合物，其中，该载剂包括赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂等。
以适于口服的剂型为例，可于根据本发明所提供的医药组合物中含有任何不会不利影响活性成分(即，咖啡果肉萃取物)的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、油(例如橄榄油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油)、聚乙二醇、淀粉、高岭土(kaolinite)、膨润土(bentonite)、柠檬酸钠、明胶、琼脂、羧甲基纤维素、阿拉伯胶、海藻酸及其盐、单硬脂酸甘油酯(glycerylmonostearate)、硬脂酸钙(calcium stearate)及前述的组合。可利用任何适宜的方法，使该医药组合物以适于口服投药的剂型提供，例如：锭剂(例如糖衣锭)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、酊剂等。
以适于经皮投予的剂型为例，也可于根据本发明所提供的医药组合物中含有任何不会不利影响活性成分(即，咖啡果肉萃取物)的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：水、矿物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液体石蜡脂、去水山梨醇单硬脂酸酯及聚山梨醇酯60。可利用任何适宜的方法，使该医药组合物以适于经皮投药的剂型提供，例如供直接外用的贴布、乳液、乳霜、凝胶(例如水凝胶)、膏状物(例如分散膏、软膏)、喷雾剂或溶液(例如悬浮液)等形式，但不以此为限。
至于适于皮下注射的针剂或点滴剂型，则可于根据本发明所提供的医药组合物中含有一种或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂或干粉悬液注射剂等剂型提供该医药组合物。或者，将该医药组合物制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，以提供所欲的注射剂。
视需要地，可于根据本发明所提供的医药组合物中另外含有适宜用量的添加剂，例如可提高该医药组合物于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该医药组合物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。此外，该医药组合物可视需要另含一种或多种其他活性成分，以进一步加强该医药组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分(即，咖啡果肉萃取物)的效益没有不利的影响即可。
根据本发明的应用所提供的医药组合物可以一日一次、一日多次、或多日一次等不同频率施用，端视投予个体的需求、年龄、体重及健康状况而异。于根据本发明所提供的医药组合物中，可视实际应用需求，调整咖啡果肉萃取物于组合物中的含量。
本发明也提供一种美白、改善肤质、护肤及/或抗皮肤老化的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的咖啡果肉萃取物。前述该有需要的个体是指，需要改善肤质及/或皮肤状况或预防肤质及/或皮肤状况变差的个体；特定言之，该个体是一有皮肤角质增厚、皮肤皱纹产生、皮肤斑点产生、皮肤暗沉、皮肤干燥脱屑、皮肤松弛及/或皮肤老化或一长期于户外工作的个体，但不以此为限。于前述方法中，所采用的咖啡果肉萃取物可以一保养品、保健食品或美容饮品的形式投予至该有需要的个体。有关该保养品、保健食品、及美容饮品的投予形式、施用频率以及相关应用，如上述的说明。
本发明另外提供一种修复皮肤组织、预防皮肤疾病及/或治疗皮肤疾病的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的咖啡果肉萃取物。前述该有需要的个体是指，有皮肤病变现象者、患有皮肤疾病者及/或罹患皮肤疾病的高风险群；举例言之，该个体是一患有皮肤干燥相关疾病者及/或罹患皮肤干燥相关疾病的高风险群。于前述方法中，所采用的咖啡果肉萃取物可以一医药组合物的形式投予至该有需要的个体。有关该医药组合物的投予方案、投予途径、投予形式、施用频率以及相关应用，也如上述的说明。
本发明也关于一种用于提升KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG 基因、GBA基因、HAS2基因及/或HAS3基因表现的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的咖啡果肉萃取物。前述该有需要的个体是指， KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及/或HAS3基因有缺失、突变或表现低下的个体。于前述方法中，所采用的咖啡果肉萃取物可以一医药组合物的形式投予至该有需要的个体。有关该医药组合物的投予方案、投予途径、投予形式、施用频率以及相关应用，也如上述的说明。
现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围如权利要求书所示。
实施例
[制备实施例]
A.咖啡果肉萃取物的制备
将咖啡果实(阿拉比卡品种；提供自嘉义县大阿里山品咖啡生产合作社，中国台湾)，脱壳后，将咖啡果肉取下并搜集。接着，对咖啡果肉进行以下操作处理，以提供咖啡果肉萃取物：
于容器中放入100克的咖啡果肉，再于其中加入2000毫升的水，均匀混合，并将该混合物置于85±5℃下进行萃取，历时1小时，以提供一萃取液；
待该萃取液冷却至室温，以400网目的滤网进行过滤，以提供一滤液；以及
于45至70℃下，对该滤液进行减压浓缩，以提供一浓缩萃取液(即，本发明的咖啡果肉萃取物；下称为“咖啡果肉萃取原液”)。
以超高温商业灭菌法(ultra-high temperature processing，UHT)对该浓缩萃取液进行灭菌，其后进行喷雾干燥，以提供一干燥粉末(下称为“咖啡果肉萃取物粉末”)。
B.咖啡果肉萃取物的稀释
取[制备实施例A]提供的咖啡果肉萃取原液，分别进行2倍、10倍及100 倍的稀释，以分别提供50％、10％及1％浓度的咖啡果肉萃取稀释液。
C.胶原蛋白溶液与果糖溶液的制备
以200mM的磷酸缓冲液(pH为7.4)作为溶剂，分别配制浓度为60毫克/毫升(mg/mL)的胶原蛋白溶液(含有0.06％迭氮化钠(NaN3))以及浓度为1.5M的果糖溶液。
D.胺基胍(aminoguanidine，AG)溶液的制备
以200mM的磷酸缓冲液(pH为7.4)作为溶剂，配置一浓度为3mM的胺基胍(aminoguanidine，AG)溶液。
E.醣化胎牛血清白蛋白的制备
以PBS作为溶剂，将购自Sigma公司的葡萄糖配置成浓度为0.5M的葡萄糖溶液后，以该0.5M的葡萄糖溶液作为溶剂，将购自Bio Basic Inc.的胎牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA；产品编号：AD0023)配置成浓度为50毫克/毫升的胎牛血清白蛋白溶液，并将该50毫克/毫升的胎牛血清白蛋白溶液置于70℃的烘箱中反应四天，使胎牛血清白蛋白发生醣化反应，以获得醣化胎牛血清白蛋白。
实施例1：咖啡果肉萃取物于抑制醣化反应(抗醣化)的效益
为了解本发明咖啡果肉萃取物是否可抑制皮肤细胞中蛋白质的醣化反应，进行以下最终醣化终产物(advanced glycation end products，AGEs)的生成测试。
A.实验组：
I.取0.2毫升[制备实施例A]提供的咖啡果肉萃取原液、[制备实施例B] 提供的50％浓度的咖啡果肉萃取稀释液、[制备实施例B]提供的10％浓度的咖啡果肉萃取稀释液及[制备实施例B]提供的1％浓度的咖啡果肉萃取稀释液，分别与[制备实施例C]所提供的胶原蛋白溶液(0.2毫升)及果糖溶液(0.2 毫升)均匀混合，以提供五种混合溶液；
II.将步骤I提供的混合溶液置于50℃下反应24小时，使溶液中的胶原蛋白发生醣化反应，以提供五种醣化反应溶液；以及
Ⅲ.分别取步骤I及II提供的混合溶液及醣化反应溶液(各取0.1毫升)，并分别测量在激发光波长360nm、放射光波长460nm下的萤光值(其中，将混合溶液的萤光值称为“实验组0小时的萤光值”，醣化反应溶液的萤光值则称为“实验组24小时的萤光值”)。
B.控制组：
i.取0.2毫升的水，与[制备实施例C]提供的胶原蛋白溶液(0.2毫升) 及果糖溶液(0.2毫升)均匀混合，以提供一混合溶液；
ii.将步骤i提供的混合溶液置于50℃下反应24小时，使溶液中的胶原蛋白发生醣化反应，以提供一醣化反应溶液；以及
iii.取步骤i及ii提供的混合溶液及醣化反应溶液(各取0.1毫升)，测量在激发光波长360nm与放射光波长460nm下的萤光值(其中，混合溶液的萤光值称为“控制组0小时的萤光值”，醣化反应溶液的萤光值则称为“控制组24小时的萤光值”)。
C.正对照组：比照实验组进行，但以[制备实施例D]提供的胺基胍(AG) 溶液取代咖啡果肉萃取原液及咖啡果肉萃取稀释液。
其后，通过下式计算各实验组的AGEs生成量(％)，结果示于图1。
由图1可知，咖啡果肉萃取原液、50％浓度的咖啡果肉萃取稀释液及10％浓度的咖啡果肉萃取稀释液皆具有抑制AGEs生成的效果，此说明本发明咖啡果肉萃取物确实可有效抑制蛋白质的醣化反应(抗醣化)。
实施例2：咖啡果肉萃取物于抑制氧化压力的效益
进行以下试验以了解咖啡果肉萃取物是否具有抑制氧化压力的效果。首先，以MEM培养基(Minimum essential medium，购自Gibco，产品编号： 61100-061)培养人类皮肤纤维母细胞(CCD-966sk；购自BCRC，产品编号： 60153)，历时24小时，其后，将细胞分为三组，并进行以下处理：
(1)控制组：将细胞继续培养于MEM培养基中24小时。
(2)AGEs组：将细胞继续培养于MEM培养基中24小时后，于培养基中加入0.4毫升[制备实施例E]提供的醣化胎牛血清白蛋白，继续培养3 小时。
(3)萃取物组：将细胞培养于每毫升含有0.25毫克[制备实施例A]提供的咖啡果肉萃取原液的MEM培养基中，历时24小时，接着，于培养基中加入0.4毫升[制备实施例E]提供的醣化胎牛血清白蛋白，继续培养3小时。
其后，以DCFH-DA染剂(购自Sigma公司，产品编号：SI-D6883-50MG) 分别处理上述各组细胞15分钟，以PBS清洗细胞两次后，将细胞悬浮于PBS 中以提供一细胞溶液。接着，于前述细胞溶液中加入200微升(μL)的胰蛋白酶并置于避光的环境下反应5分钟后，将细胞溶液置于一15毫升(mL) 离心管中，并以400g的转速离心10分钟。移除上清液后，以PBS清洗细胞一次，再以400g的转速离心10分钟。最后，以PBS重新悬浮所得的细胞沉淀物，并以流式细胞仪侦测各组细胞于激发光波长450-490nm及放射光波长510-550nm下的萤光值。其中，由于ROS可将DCFH-DA(不具萤光) 转变为DCF(具有萤光)，故所测得的萤光值可代表细胞中的ROS含量，萤光值越高表示细胞中的ROS含量越高。最后，以Excel中的学生t检验 (Studentt-test)进行统计分析，并以控制组的结果为基准，计算其他各组细胞中的ROS含量。结果示于图2。
由图2可知，相较于“控制组”，“AGEs组”细胞的ROS含量显著增加。然而，相较于“AGEs组”，“萃取物组”的ROS含量则明显减少。前述结果显示，醣化反应会导致细胞内的氧化压力提高，而咖啡果肉萃取物可有效抑制醣化反应所导致的氧化压力，具有抗氧化的效果。
实施例3：咖啡果肉萃取物于提升皮肤紧致度的效果
为了解咖啡果肉萃取物是否具有提升皮肤紧致度的效果，以MEM培养基培养人类皮肤纤维母细胞(CCD-996sk；购自BCRC，产品编号：60153)，历时24小时，接着，将细胞分成三组，并进行以下处理：
A.控制组：
1.以500微升(μL)体积计，将0.66倍体积的细胞置于一灭菌管中，加入0.33倍体积的3毫克/毫升的第一型胶原蛋白(Collagen I；购自Gibco 公司，产品编号：A10483-01)溶液，接着快速加入适量的1莫耳浓度(M) 的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液的量需至少为可将酚红指示剂(phenol red medium indicator)转为浅粉色所需的用量)，上下混合溶液三次，以提供一混合物；
2.取500微升上述步骤1提供的混合物置入一24孔培养盘中，于室温下静置20分钟，使其固化为一凝胶；以及
3.加入500微升的MEM培养基，并小心地将凝胶的周围与培养盘分离，使凝胶悬浮于MEM培养基中，再将培养盘置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，历时6小时。
B.AGEs组：
(1)以500微升(μL)体积计，将0.66倍体积的细胞置于一灭菌管中，加入0.33倍体积的3毫克/毫升的第一型胶原蛋白溶液，接着快速加入适量的1莫耳浓度(M)的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液的量需至少为可将酚红指示剂(phenol red medium indicator)转为浅粉色所需的用量)，并添加[制备实施例E]提供的醣化胎牛血清白蛋白，上下混合溶液三次，以提供一混合物；
(2)取500微升上述步骤(1)提供的混合物置入一24孔培养盘中，于室温下静置20分钟，使其固化为一凝胶；以及
(3)加入500微升的MEM培养基，并小心地将凝胶的周围与培养盘分离，使凝胶悬浮于MEM培养基中，再将培养盘置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，历时6小时。
C.萃取物组：比照“AGEs组”的步骤进行配制，但于步骤(3)中，在将培养盘放置于培养箱之前，进一步添加[制备实施例A]提供的咖啡果肉萃取原液，使其于所加入的MEM培养基中的浓度达到0.25毫克/毫升。
最后，每隔3小时观察凝胶的轮廓变化，并以数位相机拍摄凝胶，持续观察6小时。其后，将第6小时所拍摄的图像以Image J软体进行分析，记录各组凝胶的轮廓并计算其表面积(凝胶的表面积越小代表收缩能力越强)。最后，以学生t检验(Student t-test)进行统计分析，并以“控制组”的结果作为基准(即，将“控制组”设定为100％)计算“AGEs组”及“萃取物组”的凝胶的收缩能力。结果示于图3A及图3B。
如图3A及图3B所示，相较于“控制组”，“AGEs组”的凝胶轮廓及表面积明显较大，此说明醣化胎牛血清白蛋白的刺激会使凝胶中胶原蛋白的硬化及断裂而导致松弛的现象。然而，相较于“AGEs组”，“萃取物组”的凝胶轮廓及表面积明显较小，甚至与“控制组”相当，前述结果显示咖啡果肉萃取物确实具有提升皮肤紧致度的效果，可用于紧致皮肤、减少皮肤细纹。
实施例4：咖啡果肉萃取物于提升KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及HAS3基因的表现的效益
如上述，若可提升皮肤细胞的KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、 HAS2及HAS3基因的表现，即可达到帮助维持皮肤健康、保湿、紧致皮肤、减少皮肤细纹、抗皮肤老化、改善皮肤干燥、预防皮肤疾病及/或治疗皮肤疾病的效果。为了解咖啡果肉萃取物是否具有提升皮肤细胞的KRT1、 KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3基因表现的效果，将人类表皮主要角质细胞(HPEK-50；购自CELLnTEC，产品编号：CNT-PR-3D)培养于角质细胞专用的无血清培养基(SFMmedium；购自Gibco，产品编号： 17005042)中，历时24小时，接着，将细胞分成两组，并进行以下处理：
(1)控制组：将细胞置于SFM培养基中培养6小时。
(2)萃取物组：将细胞置于每毫升含有0.25毫克[制备实施例A]提供的咖啡果肉萃取原液的SFM培养基中培养6小时。
其后，分别收集上述各组细胞，以RNA萃取套组(RNA Extraction Kit，购自Geneaid公司)进行RNA萃取，再以反转录酶(III Reverse Transcriptase，购自Invitrogrn公司)将该RNA反转录为cDNA。接着，使用ABI Step One Plus仪器及KAPASYBR FAST qPCR套组对前述的cDNA 进行qPCR，以检测各组细胞的KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2 及HAS3的基因表现量。最后，以Excel中的T.TEST进行单尾学生t检验 (single-tailed student-t-test)进行统计分析，并以“控制组”作为基准(即，将“控制组”的基因表现设定为1倍)计算其余各组的相对基因表现量。结果示于图4至图8。
由图4至图8可知，相较于“控制组”，“萃取物组”的细胞的KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、HAS2及HAS3基因表现量皆明显提升。前述结果显示，咖啡果肉萃取物确实可提升KRT1、KRT14、AQP3、FLG、GBA、 HAS2及HAS3基因的表现量，故可用于帮助维持细胞构造、帮助形成皮肤屏障、提升透明质酸合成量及提高细胞含水量，达到帮助维持皮肤健康、保湿、紧致皮肤、减少皮肤细纹、抗皮肤老化及改善皮肤干燥的目的，且可用预防皮肤干燥相关疾病及/或治疗皮肤干燥相关疾病。
实施例5：人体试验
(5-1)食用咖啡果肉萃取物的长期试验
本实验采自身对照方式进行，招集八位年龄介于30至55岁的受试者，每日饮用一瓶咖啡果肉饮料(以饮料的总重计，是含有0.14％[制备实施例 A]提供的咖啡果肉萃取原液)，持续4周。分别于第0周(饮用含有本发明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉饮料前)及第4周(饮用含有本发明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉饮料后)以VISIA Complexion AnalysisSystem检测仪(购自 Canfield公司,美国)进行皮肤褐斑测定并记录，并以C+Kdual MPA580多探头肤质分析仪(购自C+K electronic公司,德国)进行皮肤黑色素、皮肤含水量、皮肤弹力及皮肤光泽度测定并记录。另外，以高解析单眼相机搭配三种光源(全光域波长、紫外光及偏光波域的光源)，拍摄脸部皮肤，观察皮肤状况。接着，以学生t检验(Student t-test)进行统计分析，并以第0周的结果作为基准(即，将第0周设定为100％)计算饮用含有本发明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉饮料4周后的皮肤黑色素、皮肤褐斑、皮肤含水量、皮肤弹力及皮肤光泽度。结果示于图9至图13。
由图9至图13可知，在连续饮用含有本发明咖啡果肉萃取物的咖啡果肉饮料4周后，受试者的皮肤黑色素及皮肤褐斑明显减少，且皮肤含水量、皮肤弹力及皮肤光泽度明显提升。前述结果显示，本发明的咖啡果肉萃取物确实具有减少皮肤黑色素与淡化皮肤斑点、保湿及提升皮肤弹力与光泽的效果。
(5-2)使用咖啡果肉面膜的短期试验
本实验采自身对照方式进行，招集五位受试者以咖啡果肉面膜(以面膜中精华液的总重计，含有2％[制备实施例A]提供的咖啡果肉萃取原液)涂抹半脸，并以安慰剂面膜(与咖啡果肉面膜的差异仅在于不含本发明咖啡果肉萃取原液)涂抹另半脸，以指腹稍加按摩促进吸收，持续15分钟，并于第0 分钟(使用前)及第15分钟(使用后)，以C+Kdual MPA580 多探头肤质分析仪(购自C+K electronic公司,德国)进行皮肤弹力测定并记录。接着，以学生t检验(Student t-test)进行统计分析，并以第0分钟的结果作为基准(即，将第0分钟设定为100％)计算15分钟后的皮肤弹力。结果示于图14。
由图14可知，相较于使用安慰剂面膜，在使用咖啡果肉面膜15分钟后，受试者的皮肤弹力明显提升。前述结果显示，本发明的咖啡果肉萃取物具有在短时间内提升皮肤弹力的效果。
Claims (10)
1.一种使用咖啡果肉萃取物于美白、改善肤质、护肤及／或抗皮肤老化的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：该萃取物是以一极性溶剂萃取咖啡果肉所提供，该极性溶剂选自以下群组：水、C1-C4醇类及前述的组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：该萃取物是用于以下的一种或多种：保湿、紧致皮肤、减少皮肤细纹、改善皮肤干燥、提升皮肤光泽及帮助维持皮肤健康。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于：该萃取物以涂抹或口服的方式使用。
5.一种使用咖啡果肉萃取物于制备一医药组合物的用途，其特征在于：该医药组合物用于以下的一种或多种：修复皮肤组织、预防皮肤疾病及治疗皮肤疾病。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：该医药组合物用于抑制皮肤细胞的蛋白质的醣化及／或降低氧化压力对皮肤细胞的伤害。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于：该医药组合物用于预防或治疗皮肤干燥相关疾病。
8.如权利要求5至7中任一项所述的用途，其特征在于：该医药组合物呈一适于口服、经皮投药或皮下注射的剂型。
9.一种使用咖啡果肉萃取物于制备一医药组合物的用途，其特征在于：该医药组合物用于提升以下基因的至少一种的表现：KRT1基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、GBA基因、HAS2基因及HAS3基因。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：该医药组合物呈一适于口服、经皮投药或皮下注射的剂型。
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