JP4942322B2

JP4942322B2 - 皮膚線維芽細胞増殖促進剤

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Publication number: JP4942322B2
Application number: JP2005287782A
Authority: JP
Inventors: 葉子藤原; 盛雄稲福; 直稲福; 哲也藤野; 恵与那覇; めぐみ比嘉; 洋右脊山; 由美青木
Original assignee: Ryukyu Bio Resource Development Co Ltd
Current assignee: Ryukyu Bio Resource Development Co Ltd
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2025-09-30
Also published as: JP2007099625A

Description

本発明は、月桃の発酵処理物を有効成分とする皮膚線維芽細胞増殖促進剤や、該皮膚線維芽細胞増殖促進剤を含有するスキンケア飲食品及びスキンケア化粧料に関する。

表皮を構成する基底層には、メラニン色素を合成するメラノサイト（色素細胞）が存在し、メラニンの合成はメラノサイト内にできるメラノソームと呼ばれる単位膜に囲まれた小顆粒中で合成される。その過程は、アミノ酸の１種であるチロシンを出発物質としてチロシナーゼという酵素によってドーパ、さらにドーパキノンへ酸化される反応によって合成が開始される。メラニン合成に関与する酵素は、他に２種のチロシナーゼ関連蛋白が知られている。この経路で合成されるメラニンは茶〜黒色のユーメラニンと呼ばれ、ヒトにおいては皮膚、粘膜、毛髪のメラノサイトで合成される（例えば、非特許文献１参照）。メラノサイトの数は個人差があり、同一人においては部位によって異なっており、概して被覆部は少なく、露出部は多い。紫外線の照射を受けると、チロシナーゼ活性の増加をはじめとするメラニン合成が高まるとともに、メラノサイトの数も増加する。メラニンの沈着によって生じる様々なタイプの色素班があり、しみ、ソバカス、老人性色素班が代表的なものである。これらはいずれも紫外線が直接の原因であったり、増悪因子となることから美白剤とともに紫外線防御が有効なスキンケアとなるといわれている（例えば、非特許文献２参照）。

従来より、上記機構によるメラニンの生成を防止するため、チロシナーゼの作用を阻害することができる種々の物質が化粧品や食品の分野で使われ、その代表的なものはアスコルビン酸、硫黄類、ハイドロキノン、コウジ酸、アルブチン、天然の植物抽出物等である。これまでにも幾つかの天然の植物抽出物が試みられた。例えば、グアバ（Psidium guajava L.）又はエリカ（Erica）を抽出処理して得られた抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤、これを含む美白化粧品（例えば、特許文献１参照）や、水及び/又は有機溶媒を使用して抽出したチロシナーゼの阻害活性を有する葡萄の種の抽出物、これを含む美白機能等を有する化粧品または食品（例えば、特許文献２参照）や、発芽玄米の、水及び／又は有機溶媒の抽出物を有効成分として含有してなるチロシナーゼ阻害剤、及び美白用機能性食品（例えば、特許文献３参照）や、チロシナーゼ抑制物質として甘草エキス、プラセンタエキス、麹酸等から選ばれる少なくとも１種と、白樺エキス及び還元物質を含有する美白組成物（例えば、特許文献４参照）や、Hibiscus syriacus L. 抽出物を含有するメラニン生成抑制剤、該抑制剤を化粧品や食品に配合して用いること（例えば、特許文献５参照）や、ヤナギタデ抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤、これを含有する美白剤及び美白用飲食品（例えば、特許文献６参照）が知られている。

他方、月桃（Alpinia Speciosa K. Schum）はショウガ科（Zingiberaceae）に属し、別名アルピニアといい、九州南部から中国南部〜熱帯アジアに分布し、葉に芳香があるので食物を包み，葉鞘は網や綱の原料として利用されている。月桃を利用したスキンケアに関連したものとしては、月桃に含まれるカワイン類、ポリフェノール（クエルセチン）類、葉緑素などが、活性酸素や紫外線などの皮膚への悪影響を抑制し、メラニン色素の沈着を抑える機能を発揮することによる優れた美白効果などを備え、かつ、防腐剤などを添加しなくても腐敗しにくい安全性の高いパック剤を提供するため、月桃の葉及び／又は茎を乾燥する乾燥工程と、乾燥した前記月桃の葉及び／又は茎を粉砕して、平均粒径が１０〜５０μmの月桃粉末とする粉砕工程と、粉砕された前記月桃粉末とジェル化剤とを混合してジェル化するジェル化工程とを具備することを特徴とするパック剤の製造方法（例えば、特許文献７参照）や、ローズマリー、またはペパーミント、またはカモミール、またはローズゼラニウム、またはラベンダー、またはレモングラス、または月桃類のハーブのうち、少なくとも一種類のハーブを灰にしたものが石けん素地に配合されることを特徴とする美容石けん（例えば、特許文献８参照）や、葉エキスと、鶏冠抽出物と、米抽出物と、ヘマトコッカス藻抽出物と、フェヌグリークエキスと、バラ花びらエキスと、黒こしょうエキスとを含有させたことを特徴とする美肌促進剤（例えば、特許文献９参照）が知られている。

さらに、グアバの葉や月桃，ヨモギ，茶葉等の植物資源を細かく粉砕し、これに培養基としてストレプトコッカッス・サーモフィラス、ラクトバチルス・プランタリウム及びバチルス・サブティリスの三種類の乳酸菌、及び酵母菌を加え、さらに糖蜜、水分を加えて数日間発酵して得られる、血圧上昇の抑制作用の向上が期待される、発酵食材（例えば、特許文献１０参照）が本出願人により提案されている。

また、皮膚線維芽細胞の増殖は種々の細胞成長因子によって複雑に制御されていることが知られている。その主要なものは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）などであり、これらの成長因子は、皮膚線維芽細胞の増殖制御以外にも多様な生理活性を有しており、創傷治癒や疾患の発生に関与している。例えば、ＰＤＧＦやＣＴＧＦは皮膚線維芽細胞の走化性を、ｂ−ＦＧＦは血管新生を、ＴＧＦ−βはマトリックスタンパクの合成を促進する。そして、皮膚線維芽細胞は、コラーゲンやエラスチンといった肌の保水性を保つために必要な成分を作り出しており、年とともに線維芽細胞の数が減ると保水性が保てずはりがなくなり、しわなどが増えてくるといわれている。ビタミンＣは、真皮層に浸透して線維芽細胞を活性化して、コラーゲンを生成し、しわ対策に有効で肌再生作用を有するといわれている。また、肌再生作用を有する女性ホルモンは、線維芽細胞に働きかけ、ヒアルロン酸やコラーゲンの合成を活性化し、同様にイソフラボンも真皮層のコラーゲンの代謝活性を向上して、肌に張りを持たせる作用が期待されている。

特開平６−３０５９７８号公報特開２０００−１５９６８１号公報特開２００１−２４０５５６号公報特開２００１−３３５４９８号公報特開２００３−１７１３００号公報特開２００４−８３４８８号公報特開２００５−６０２６０号公報特開２００３−５５６９７号公報特開２００５−４７８６０号公報特開２００２−３３０７２５号公報光井武夫編「新化粧品学」第１４〜１６頁、２００２年３月２５日、株式会社南山堂発行光井武夫編「新化粧品学」第２６〜２８頁、２００２年３月２５日、株式会社南山堂発行

スキンケアや皮膚の老化を考える上で、皮膚線維芽細胞の増殖制御は重要であるとされている。皮膚線維芽細胞の増殖や機能を制御することにより、皮膚の老化を防ぎ、何時までも若々しい皮膚を維持することができる可能性がある。本発明の課題は、美容上もっとも多い悩みとされるしわ対策に有用であり、保水性を高めて肌のはりや潤いを保つことが可能となる、安全な皮膚線維芽細胞増殖促進剤や、かかる皮膚線維芽細胞増殖促進剤を含有するスキンケア飲食品やスキンケア化粧料を提供することにある。

月桃は、沖縄等の亜熱帯に群生するショウガ科の多年草で、世界の芳香植物１６４種の一つに数えられ、沖縄では古くから月桃の葉の抗菌性を生かして餅を包んだり、まんじゅうを葉に載せて蒸すという習慣があり、また、紙やお茶や畳などの用途に使用されていたが、近年、その抗菌効果を利用して、防腐剤を使用しない肌に優しい天然化粧品として利用されるようになっている。そして、この月桃には、メラニン色素の沈着抑制作用があり、化粧品を使用すると、紫外線によるシミ、そばかすを防ぐ効果があるといわれている。本発明者らは、月桃についてさらに検討を進め、乳酸菌等を用いた月桃の発酵処理物に、未発酵月桃には見い出すことができない、安定した皮膚線維芽細胞増殖促進作用があることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）月桃を乳酸菌と枯草菌により発酵させて得られる発酵処理物を有効成分とすることを特徴とする皮膚線維芽細胞増殖促進剤や、（２）発酵処理物が、月桃の葉の発酵処理物であることを特徴とする上記（１）記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤や、（３）ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌による発酵処理物であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤に関する。

また本発明は、（４）発酵処理物が、抽出エキス又はその凍結乾燥物であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤に関する。

さらに本発明は、（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤を含有することを特徴とするスキンケア化粧料や、（６）さらに、シリマリン（Silymarin）、コラーゲンペプチド、及びヒアルロン酸から選ばれる１種以上の成分を含有することを特徴とする上記（５）記載のスキンケア化粧料に関する。

本発明によると、線維芽細胞増殖促進効果により、美容上もっとも多い悩みとされるしわ対策に有用であり、保水性を高めて肌のはりや潤いを保つことが可能となる、安全なスキンケア飲食品やスキンケア化粧料を提供することができる。また、本発明によると、保水性を高めて肌のはりや潤いを保つことに加えて、メラニンの生成を抑制し、シミ、ソバカス、斑点又は妊娠期過色素沈着（hyperpigmenntation）を防止することもできる。

本発明の皮膚線維芽細胞増殖促進剤としては、月桃を乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られる発酵処理物を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、月桃の使用部位は、根、根茎等の地下部や、茎、葉、花、果実等の地上部であってもよく、また、これらの二種以上の混合物であってもよいが、葉の使用が特に好ましい。

上記乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Storeptococcus）、ラクトバシルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）又はテトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）のいずれかに属する菌が好ましく、特にラクトバシルス属が好ましい。上記ストレプトコッカス属に属する菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィルスＩＦＯ１３９５７菌株を具体的に例示することができる。また、ラクトバシリルス属に属する菌としては、ラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum）、ラクトバシルス・デルブリッキ（L. delbruckii）、ラクトバシルス・ペントサス（L. pentosus）又はラクトバシルス・カセイ（L. casei）のいずれかに属する菌であることが好ましく、これらの菌のうち、特にラクトバシルス・プランタリムが好ましい。かかるラクトバシルス・プランタリムとしてＩＦＯ１４７１２菌株やＩＦＯ１４７１３菌株を、ラクトバシルス・デルブリッキとしてＩＦＯ１３９５３菌株を、ラクトバシルス・ペントサスとしてＩＦＯ１２０１１菌株を、ラクトバシルス・カセイとしてＩＦＯ１５８８３菌株を、それぞれ具体的に例示することができる。また、テトラジェノコッカス属に属する菌としては、テトラジェノ・ハロフィルス（T. halophilus）であることが好ましく、テトラジェノ・ハロフィルスＩＦＯ１２１７２菌株を具体的に例示することができる。これら乳酸菌は、月桃の葉の乾物１ｇあたり、通常１０^３〜１０^７個、特に１０^６〜１０^７個用いることが好ましい。

また、上記酵母としては、カンジダ属（Candida）又はサッカロマイセス属（Saccharomyces）に属する菌が好ましい。かかるカンジダ属に属する菌として、カンジダ・ビルサチルス（Candida versatilis）であることが好ましく、カンジダ・ビルサチルスとしてＩＦＯ１００３８菌株を具体的に例示することができる。サッカロマイセス属に属する菌として、サッカロマイセス・セレビシアエ（S. cerevisiae）であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシアエとしてＩＦＯ０５５５菌株を具体的に例示することができる。これら酵母菌は、主として香りの改善のために添加され、この場合、モモタマナの葉の乾物１ｇあたり、通常１０^３〜１０^７個、特に１０^６〜１０^７個用いることが好ましい。

また、上記枯草菌としては、バシルス・ズブチルス（B. subtilis）ＩＦＯ３０１３菌株を具体的に例示することができる。これら枯草菌は、月桃の葉の乾物１ｇあたり、通常１０^３〜１０^７個、特に１０^６〜１０^７個用いることが好ましい。

月桃の発酵処理において、好ましく用いられる微生物群としては、乳酸菌と枯草菌を含む微生物群が好ましく、これら微生物群の中でも、ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌であることが好ましく、これらは月桃の葉の乾物に対し、菌数として同数を使用することが好ましい。このような菌数の組合せにより、発酵時間の短縮を図り、ひいては雑菌の繁殖を抑制することができる。

上記月桃の発酵処理においては、月桃の葉の乾燥体を、３ｍｍ以下、好ましくは０．５〜１．０ｍｍの粒径まで粉砕する。３ｍｍ以下の粒径とすることにより、発酵菌との接触面積を十分に確保することができ、発酵を効果的に進行させることができ、０．５〜１．０ｍｍの範囲の粒径であれば、かかる効果がより顕著に得られる。このような植物の粉砕物に、発酵の進行を促進するため、乾物１重量部に対し、１〜１０重量部、特に４〜６重量部程度の水分を添加することが好ましい。かかる乾燥粉砕物に、上述の菌又は菌群を添加する。菌群は各々菌を培養後、培地へ添加する前に予め混合し、乾燥体である場合の植物の重量に対して、１〜１０重量％（培養物として）添加することが好ましい。発酵は、温度２０〜５０℃、中でも４０℃前後で行われることが好ましく、発酵時間は、ｐＨや、菌数等の条件による発酵の進行状況や、嗜好により適宜選択することができ、例えば、ｐＨ４〜５、菌数１０^６以上であれば、約７２時間とするのが好ましい。発酵処理時、必要に応じてエアレーションや脱酸素処理を行うことができるが、脱酸素処理後に静置培養において発酵させることができる。発酵形式は、液体培養でなく固体培養が好ましい。

かかる発酵処理において、発酵菌の資化剤として炭水化物や蛋白質を添加することができる。資化剤としての炭水化物は市販のブドウ糖、蔗糖、廃糖蜜等の糖が好ましく、これらの添加量としては培地当たり１〜１０重量％が好ましく、特に３重量％前後が適当である。資化剤としての蛋白質は米糠、ふすま等が好ましく、これらの添加量としては培地当たり１〜５重量％が好ましい。これらの資化剤は１種を単独で、又は２種以上を混合して用いてもよい。

本発明の皮膚線維芽細胞増殖促進剤の有効成分としての発酵処理物としては、発酵した物や、発酵した物に乾燥処理、滅菌処理、抽出処理、酵素処理等の１又は２以上の処理を施した処理物を挙げることができる。例えば、発酵終了後、乾燥処理により水分値が１０重量％以下となるように乾燥することもできる。乾燥方法としては、加熱乾燥や凍結乾燥によることができ、加熱乾燥の場合は、品温が１００℃以下で行われることが、生理活性成分の失活を防止することができるため好ましい。また、乾燥後、必要に応じて加熱等公知の方法により滅菌処理を行うこともできる。本発明の皮膚線維芽細胞増殖促進剤の有効成分としての発酵処理物としては、月桃を発酵後乾燥して抽出した抽出エキスを特に好適に例示することができる。かかる抽出処理に使用する溶媒としては、例えば、水（熱水）、メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコールや、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、ヘキサン等の非極性溶媒の一種又は二種以上を挙げることができる。好ましい抽出方法としては、例えば、７０〜９０℃の水での１０〜６０分の熱水抽出、好ましくは８０℃の水での２０分間の熱水抽出した後濾過する方法や、濃度８０容量％のエチルアルコールを用い、室温で２４時間抽出した後濾過する方法等を挙げることができる。更に、熱水抽出物を凍結乾燥した凍結乾燥処理物や、アルコール等の溶媒抽出処理物の溶媒を除去した後凍結乾燥した凍結乾燥処理物を有利に使用することができ、また、必要に応じてこれらの抽出物を溶媒と混合し混合液としたものも使用することができる。

上記抽出液、抽出液から溶媒を留去して得られる抽出物、あるいはこれら抽出物のスプレードライ品や凍結乾燥品は、そのままでも皮膚線維芽細胞増殖促進剤として使用可能であるが、これらの作用に影響しない範囲で、脱臭、脱色等のための精製処理を施してもよい。さらに、液液分配抽出、各種クロマトグラフィー、イオン交換、膜分離等の分離精製処理を施して、活性の強い皮膚線維芽細胞増殖促進剤として使用することができる。

上記のようにして得られた月桃の発酵処理物を有効成分とする皮膚線維芽細胞増殖促進剤は、それ自体でまたは薬学的に許容される結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤などと混合して液体、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤等として用いることができる他、食品・食品素材に添加・配合して本発明のスキンケア飲食品としたり、化粧料・化粧料素材に添加・配合して本発明のスキンケア化粧料とすることができる。本発明のスキンケア飲食品やスキンケア化粧料には、公知のスキンケア成分と併用することもできる。かかるスキンケア成分としては、シリマリン（Silymarin）、コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸、コエンザイムＱ_１０、グルコサミン、ビタミンＣ等を挙げることができ、これらは１種又は２種以上併用することができる。

上記シリマリンは、キク科マリアアザミから抽出されるフラボノリグナンの総称であり、確認されている主要成分はシリビン、シリジアニン、シリクリスチン、イソシリビンなどがあり、前記キク科マリアアザミの植物の種実からエタノール抽出し、スプレードライにより乾燥粉末として得られるエキス原料として市販されている。本発明に使用するシリマリンは市販されているシリマリンをそのまま用いることもでき、また、上記コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸、コエンザイムＱ_１０、グルコサミン、ビタミンＣ等は、いずれも市販されているものを使用することができる。例えば、発酵月桃抽出エキス（凍結乾燥品）、シリマリン、コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸からなるしわ予防用組成物の場合、発酵月桃抽出エキス（凍結乾燥品）１５〜２５重量％、シリマリン０．１〜１．０重量％、コラーゲンペプチド７０〜８０重量％、ヒアルロン酸０．１〜０．２重量％の配合品を好適に例示することができる。

上記本発明のスキンケア飲食品の種類・形態としては、例えば、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、ゼリー、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜や、蜂蜜、ローヤルゼリー、栄養補助食品、老人・病人・乳幼児食、非常食、ダイエット食などを挙げることができ、通常、パッケージングや説明書等に、美容上もっとも多い悩みとされるしわ対策に有用であり、保水性を高めて肌のはりや潤いを保つことができる旨が表示されて販売される。

また、上記本発明のスキンケア化粧料の種類・形態としては、例えば、ローション、乳液、クリーム、ファンデーション、下地料、白粉、頬紅、日焼け止め料などを挙げることができ、通常、パッケージングや説明書等に、美容上もっとも多い悩みとされるしわ対策に有用であり、保水性を高めて肌のはりや潤いを保つことができる旨が表示されて販売される。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（発酵月桃の熱水抽出物の調製）
乾燥した月桃の葉３０ｇを０．１〜３ｍｍの粒径に粉砕し容器に入れた。粉砕月桃を入れた容器に水３０ｇ、糖蜜０．９ｇを添加した。これとは別に、ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの各菌をそれぞれ培養後、菌数１：１：１の割合で混合し、月桃の重量に対し、１０重量％を添加し、容器を密閉し、静置培養により発酵を行った。発酵温度は４０℃、発酵時間は７２時間とした。その後、乾燥機により水分値が１０重量％以下になるまで６０℃で乾燥した後、滅菌処理（１３０℃蒸気、５〜１５秒）を行い、発酵月桃３０ｇを得た（以下「発酵月桃茶」という場合がある）。その後、発酵月桃茶１ｇに対して１０ｍＬの割合になるように水を加え、８０℃で２０分間熱水抽出し、上澄みをプールし、沈殿１ｇに対して１０ｍＬの割合になるように再度、水を加え、８０℃で２０分間熱水抽出し、前述の上澄みと合わせて熱水抽出エキスを得た。また、この熱水抽出エキスを凍結乾燥して得られる発酵月桃凍結乾燥物（熱水抽出物）（収率９．１２％）を調製した。

（発酵月桃のアルコール抽出物の調製）
実施例１と同様にして調製した発酵月桃茶１ｇに対して１０ｍＬの割合になるように８０％エタノールを加え、室温で２４時間抽出し、この抽出液を濃縮、乾固し、濃度２０ｍｇ／ｍｌになるようにＤＭＳＯを加え再溶解して、抽出物を調製した。

（皮膚線維芽細胞増殖試験：熱水抽出液の使用）
皮膚線維芽細胞（ヒト新生児由来、大日本製薬株式会社より購入、１×１０^６）を、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地を用いて、２５ｃｍ^２フラスコ中で４日間培養した。その後トリプシン処理して細胞を回収し、７×１０^３cell／ｍＬで２４穴プレートに移し５％ＦＢＳを含むα−MEM培地で１２時間培養した。次に、サンプルである発酵月桃の熱水抽出液を原液又は５倍希釈したもの５μＬを皮膚線維芽細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて３日間培養した。コントロールとして抽出物無添加を、また、月桃の葉の無醗酵乾燥物も、同様に上記の条件で培養したものを用いた。比色法の一つであるＭＴＴ法にて細胞生存率を測定し、細胞増殖率を細胞増殖率（％）＝［（Ａ−Ｃ）−（Ｂ−Ｄ）／（Ｂ−Ｄ）］×１００により求めた。式中、Ａ：ＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）添加、熱水抽出液添加、Ｂ：ＭＴＴ添加、熱水抽出液無添加、Ｃ：ＭＴＴ無添加、熱水抽出液添加、Ｄ：ＭＴＴ無添加、熱水抽出液無添加、をそれぞれ示す。結果を図１に示す。図１より、本発明の月桃発酵処理物の熱水抽出液を添加したものは、細胞増殖率は、コントロールに比べて約１２〜１７％高く、月桃を醗酵しないものと比べると約９〜１１％高いことがわかった。なお、５倍希釈の方が原液より細胞増殖率がよいがその理由は不明である。

（皮膚線維芽細胞増殖試験：８０％エタノール抽出物の使用）
実施例２で調製した８０％エタノール抽出物をＤＭＳＯに溶解し、最終濃度１０μｇ／ｍＬ、又は４μｇ／ｍＬとなるように用いて、実施例３と同様に細胞増殖率を求めた。結果を図２に示す。図２より、エタノール抽出物を添加した場合の細胞増殖率は、コントロールに比べて、１０μｇ／ｍＬでは約５％、４μｇ／ｍＬでは約１８％高いことがわかった。また、月桃を醗酵しないものと比べると、１０μｇ／ｍＬでは約６１％、４μｇ／ｍＬでは約１８％高いことがわかった。なお、この実験でも４μｇ／ｍＬの方が、１０μｇ／ｍＬより細胞増殖率がよいがその理由は不明である。

（発酵月桃茶のモニターテスト）
２０代〜５０代の女性２０名を対象として、発酵月桃茶のアンケート調査を行った。実施例１で得られた発酵月桃茶２ｇを１リットルの水に入れ火にかけ、沸騰後５分間煮出した。この煮出液を１日５００ｍＬ以上毎日摂取してもらい、８週間後に「肌のはり」、「肌の潤い」及び「肌のつや」についてアンケート調査を行った。アンケートは５段階評価（改善、やや改善、不変、やや悪化、悪化）にて実施した。肌のはりについてのアンケート結果を表１に、肌の潤いについてのアンケート結果を表２に、肌のつやについてのアンケート結果を表３に、それぞれ示す。

肌のはりについてのアンケート結果（表１）によると、２１名中１２名（５７％）の方が改善又はやや改善したと回答しており、肌の潤いについてのアンケート結果（表２）によると、２１名中１０名（４７％）の方が改善又はやや改善したと回答しており、肌のつやについてのアンケート結果（表３）によると２１名中９名が改善又はやや改善したと回答していることからも明らかなように、本発明の皮膚線維芽細胞増殖促進剤には、「肌のはり」、「肌の潤い」及び「肌のつや」について効果を奏することがわかった。

（発酵月桃エキス粒のモニターテスト）
２０代〜４０代の女性６名を対象として、５５日間モニターテストを実施してもらった。モニターを実施する前の肌状態を皮膚粘弾性測定装置ＣＵＴＯＭＥＴＥＲＭＰＡ５８０で肌（頬）のエリスマ（赤み）および弾力の測定を行った。発酵月桃エキス粒（実施例１における発酵月桃熱水抽出物の凍結乾燥物の粒剤；２００ｍｇ×４粒）を就寝前（２０時〜２２時）にモニター期間中毎日服用してもらい、モニター開始から５５日目に、同様に肌のエリスマおよび弾力の測定を行った。測定方法として、エリスマについてはプローブを各部位に直接当てプログラム上でデータ処理し、弾力に関しては、測定部位にプローブを当て吸引後、圧解除し、時間に対する変位を測定し、その波形から弾力を計算によって算出し評価した。測定環境は、温度２５±１℃、湿度５３〜６３％であった。その結果を、エリスマ赤み（頬）については、個人別データを図３に、平均をとり統計処理（ｔ検定）を行った結果を図４に示す。図３および図４より、どの被験者も減少傾向にあり、統計処理の結果から摂取前と比較して摂取後は有意に減少した。

弾力の測定試験の結果を、波形モデルについては図５に、弾力個人別データは図６に、平均値は図７に示す。図５の波形モデルで示すように吸引時の引っ張りの最大値から圧解除時の最小値を差し引いた値を吸引時の最大値で割った値を弾力と評価する。一人の被験者を除き、どの被験者も弾力が増加傾向にあった。グラフの縦軸は上記波形モデルで示したＲ２の値であるが、１に近づけば近づくほど完全弾性体に近く、弾力があると評価される。図６、図７より、平均をとり統計処理を行った結果、有意差はなかったものの摂取前と比較して摂取後は弾力に増加傾向が見られた。このように発酵月桃エキス粒の肌物性へ与える効果としては、肌の弾力の増加、エリスマ（赤み）の改善があることがわかった。
［参考例１］

（メラニン生成量の測定）
メラニン量、ＤＮＡ量を測定し、ＤＮＡ当たりのメラニン生成量を測定した。また、供試サンプルとして、実施例１における発酵月桃熱水抽出物の凍結乾燥物を、ビタミンＣとしてＬ（+）アスコルビン酸ナトリウム（Wako社製）をＰＢＳ（−）溶液に溶解したものを加え、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した液を用いた。サンプル溶液は細胞増殖に影響を与えないよう、培地に対して１％以下になるように調製した。
（１）測定試料の調製：細胞として、Ｂ１６メラノーマ細胞（理研セルバンクより購入、B16melanoma 4A5:Car No RCB0557）を１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ（ｐＨ７．４）培地で、所定濃度のサンプル溶液を添加して３７℃、５％ＣＯ_２にて３日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（−）溶液で細胞表面を２回洗浄し、その後５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を１ｍＬ加え、細胞をセルスクレイバー（Nunc社製）で集め、ソニケーター(Yamato powersonic社製 Model150）で破砕した。これを細胞破砕液とした。
（２）メラニン量の測定：（１）の細胞破砕液０．５ｍＬに２ＮＮａＯＨを０．５ｍＬ加え、８０℃で加温し、メラニンを溶解した。冷却後、４００ｎｍの吸光度を測定した。メラニン標準液を用いて検量線を作成し、メラニン量を算出した。
（３）ＤＮＡ量の測定：（１）の細胞破砕液８０μにＤＡＰＩ（４’，６−Diamidino-2-phenylindole(ＤＡＰＩ)［SIGMA］１ｍｇ／２０ｍＬ Tris-HCI buffer(pH7.5)をストック溶液として−２０℃で遮光保存。使用時にTris-HCI buffer（pH7.5）で５００倍に希釈した。）を４ｍＬ加えて混合し、暗所に３０分間置いた。励起波長（Ｅｘ）３５０ｎｍ、蛍光強度を測定した（Shimadzu spectofluorophotometer RF-540）。ＤＮＡ標準液を用いて検量線を作成し、ＤＮＡ量を算出した。

無醗酵の月桃と醗酵させた月桃（月桃茶）の濃度を、０（コントロール）、２５、５０、１００，１５０（μｇ／ｍＬｍｅｄｉｕｍ）としたものと、ビタミンＣ（比較例）を５０（μｇ／ｍＬｍｅｄｉｕｍ）用いた場合のＢ１６メラノーマ細胞のメラニン生成量に及ぼす影響（効果）を、前記（２）、（３）のメラニンの測定、ＤＮＡの測定量の方法を採用して行った。結果を図８に示す。図８より、コントロールに比べて、無醗酵の月桃と醗酵させた月桃（月桃茶）何れもメラニン生成に対する抑制の程度は高く、２５〜１００（μｇ／ｍＬｍｅｄｉｕｍ）の範囲では濃度が高くなるほど抑制力が比例して高いが、１５０（μｇ／ｍＬｍｅｄｉｕｍ）では、１００（μｇ／ｍＬｍｅｄｉｕｍ）よりは、いくらか劣っている。いずれの濃度の場合もビタミンＣよりメラニン生成量を抑えていることがわかった。しかし、無醗酵の月桃と醗酵させた月桃（月桃茶）の間にはほとんど差が見出せなかった。
［参考例２］

（細胞内におけるチロシナーゼ活性の測定）
細胞内におけるチロシナーゼ活性及びタンパク質量を測定し、タンパク質当たりの酵素活性を求めた。
（１）測定試料の調製：参考例１と同様の方法により培地に所定濃度のサンプルを添加し、Ｂ１６メラノーマ細胞を培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（−）溶液で細胞表面を２回洗浄し、その後０．５％ＤＯＣ（デオキシコルチコステロン）１ｍＬを加え、細胞をセルスクレイバーで集め、ソニケーターで破砕した。これを遠心分離（１１０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）し、その上清部を酵素溶液とした。
（２）チロシナーゼ活性測定：３７℃で１０分間プレインキュベートした０．０５％Ｌ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）／０．１Ｍリン酸緩衝溶液１ｍＬに、前記酵素溶液０．５ｍＬを加え、３７℃でインキュベートしながら４７５ｎｍの吸光度を経時的（１ｍｉｎ）に１０分間測定した。
Ｌ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）の自動酸化を測定するために、同時に、０．０５％Ｌ−ドーパ／０．１Ｍリン酸緩衝溶液１ｍＬに０．５％ＤＯＣ０．５ｍＬを加えたものの吸光度も経時的に測定し、ベースラインとした。横軸に反応時間（ｍｉｎ）、縦軸にタンパク質当たりの測定開始からのＯ．Ｄ．４７５ｎｍの変化量をとったグラフから、その反応開始後の傾きを求め、チロシナーゼ活性とした。コントロールにおけるチロシナーゼ活性を１００％として、各濃度で比較した。
（３）タンパク質量定量（Ｌｏｗｒｙ法）
試薬Ａ：２％Ｎａ_２ＣＯ_３−ｉｎ０．１ＮＮａＯＨ
試薬Ｂ：０．５％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ−１％酒石酸カリウムまたはナトリウム
試薬Ｃ：試薬Ａ／試薬Ｂ＝５０／１に混合。毎回新調
試薬Ｄ：フェノール試薬（市販品を使用時に蒸留水で２倍に希釈する）
タンパク質標準溶液：アルブミン標品約５ｍｇ／１０ｍＬ。正確に秤量する。
［操作］０．２ｍＬ中にタンパク質５〜１００μｇを含むサンプル溶液を試験管に取り、試薬Ｃを１ｍＬ添加、混合する。室温で１０分間以上放置した後、試薬Ｄ０．２ｍＬを加え、すばやく混合する。２０分以上２時間以内に吸光度７５０ｎｍで比色を行う。検量線は標準アルブミン溶液を希釈して、３０〜２００μｇ／ｍＬ用いて作成した。

無醗酵の月桃と醗酵させた月桃（月桃茶）の濃度を、０（コントロール）、２５、５０、１００，１５０（μｇ／ｍＬ medium）としたものと、ビタミンＣ（比較例）を５０（μｇ／ｍＬ medium）を用いた場合のＢ１６メラノーマのメラニン生成量に及ぼす影響（効果）を前記（２）、（３）のチロシナーゼ活性測定、蛋白質定量の方法を採用して行った。結果を図９に示す。図９より、対照に比べて、無醗酵の月桃と醗酵させた月桃（月桃茶）何れもチロシナーゼ活性は、共に濃度依存的に抑制しており、また、ビタミンＣに比べてもチロシナーゼ活性を抑えていることがわかった。しかし、無醗酵の月桃と醗酵させた月桃（月桃茶）の間にはほとんど差が見出せなかったばかりか、１００，１５０（μｇ／ｍＬ medium）では、無醗酵の月桃の方が醗酵月桃よりもチロシナーゼ抑制効果が優れていることがわかった。

（皮膚線維芽細胞増殖促進錠剤の調製）
実施例１における発酵月桃熱水抽出物の凍結乾燥物２０．４７重量％、コラーゲンペプチド（ゼライズ(株)社製）７５．０重量％、ヒアルロン酸０．１５重量％（(株)ホルス社製）、シリマリン（株式会社常盤植物化学研究所社製）０．５重量％の割合で混合し、粒状の錠剤を得た。

（皮膚線維芽細胞増殖促進剤を含有するスキンケア飲食品の調製）
実施例１における発酵月桃熱水抽出物の凍結乾燥物１００mgを５０ｍＬの水に添加し、ジュース原料のクエン酸、香料、ビタミンＣ、ブドウ糖、砂糖、異性化糖などを適宜添加し、混合撹拌して、ジュースを得た。

（皮膚線維芽細胞増殖促進剤を含有するスキンケア化粧料の調製）
実施例１における発酵月桃の熱水抽出エキス（発酵月桃エキス）、精製水、グリセリン、及び尿素を下記のような配合にて混合し、スキンケア化粧料を得た。
精製水９３％
グリセリン３％
尿素３％
発酵月桃エキス１％

本発明（醗酵月桃）の熱水抽出液を用いた皮膚線維芽細胞増殖測定結果をコントロール（無添加）、月桃（無醗酵）と共に示す図である。本発明（醗酵月桃）の８０％エタノール抽出凍結乾燥物を用いた皮膚線維芽細胞増殖測定結果をコントロール（無添加）、月桃（無醗酵）と共に示す図である。本発明（発酵月桃粒)服用のエリスマ（赤み）（頬）個人別データを示す図である。本発明（発酵月桃粒）服用のエリスマ（赤み）の平均値を示す図である。本発明（発酵月桃粒)服用の弾力（頬）の波形モデルを示す図である。本発明（発酵月桃粒）服用の弾力個人別データを示す図である。本発明（発酵月桃粒)服用の弾力についての平均値を示す図である。本発明（無醗酵月桃、醗酵月桃）のメラニン生成抑制効果をコントロール（無添加）、とビタミンＣと共に示す図である。本発明（無醗酵月桃、醗酵月桃）のチロシナーゼ活性の抑制効果をコントロール（無添加）、とビタミンＣと共に示す図である。

Claims

月桃を乳酸菌と枯草菌により発酵させて得られる発酵処理物を有効成分とすることを特徴とする皮膚線維芽細胞増殖促進剤。
発酵処理物が、月桃の葉の発酵処理物であることを特徴とする請求項１記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤。
ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌による発酵処理物であることを特徴とする請求項１又は２記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤。
発酵処理物が、抽出エキス又はその凍結乾燥物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤。
請求項１〜４のいずれか記載の皮膚線維芽細胞増殖促進剤を含有することを特徴とするスキンケア化粧料。
さらに、シリマリン（Silymarin）、コラーゲンペプチド、及びヒアルロン酸から選ばれる１種以上の成分を含有することを特徴とする請求項５記載のスキンケア化粧料。