TW202118502A

TW202118502A - 紅藜(Chenopodiumformosanum (Djulis))萃取物用於抗氧化及改善肌膚之用途

Info

Publication number: TW202118502A
Application number: TW109139603A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 李姿儀
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2021-05-16
Also published as: CN112843136A; US20230263722A1; US20210137826A1; TWI804771B; US20230240974A1; TW202118505A; CN112843097A; US12076435B2; TWI809328B; TW202118501A; TWI801770B; TW202118481A; TWI815058B; CN112843106A; CN112843139A

Abstract

一種紅藜萃取物之用途，其是用於製備抗氧化及改善肌膚之用途。其中，該紅藜萃取物是由含水之溶劑進行萃取。

Description

紅藜(Chenopodiumformosanum　(Djulis))萃取物用於抗氧化及改善肌膚之用途

本發明涉及一種紅藜萃取物的用途，特別是關於紅藜萃取物用於製備抗氧化，改善肌膚之用途。其中，該改善肌膚之用途包含肌膚保濕、肌膚美白、肌膚皺紋與紋理之撫平。

紅藜（學名：Chenopodium formosanum (Djulis) ）又稱為臺灣藜、赤藜、紫藜、彩虹米，是一種台灣特有植物，一年生大型草本植物，為藜麥的近親，屬於藜科（Chenopodiaceae ）藜屬（Chenopodium ）。分佈於台灣地區的中南部中低海拔山區，在原住民耕作史上有超過百年歷史，目前以東部的排灣族人保有最豐物的種原。紅藜可食用，其幼苗、嫩莖葉和花穗可加入料理炒食或煮湯，而種子與殼分離後磨成粉狀調水，可作為湯圓等食品的原料。

紅藜的蛋白質含量是稻米的兩倍。紅藜的果實通常被曬乾並去殼後與其他穀類混合成一般食用米，於食品加工上可利用不同加工方式（蒸煮、微波、烤、炸及膨發），製造成飯糰、餅乾、薯球、泡芙、麻糬、鬆餅及米香等具特色產品。紅藜可以增進食品的天然色澤，並且具有豐富的營養價值，逐漸受到愈來愈多消費者的喜愛。

有鑑於此，為了更積極提升紅藜其他層面的開發與應用，故而提出一種紅藜萃取物及改善肌膚之組合物，其可應用於製備抗氧化、肌膚美白及肌膚保濕之用途。

在一些實施例中，紅藜萃取物可以清除細胞中自由基，其中該紅藜萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。在一些實施例中，該細胞為皮膚細胞。

在一些實施例中，紅藜萃取物透過提升抗氧化基因相關基因之表現量以達到抗氧化之功效。

在一些實施例中，抗氧化相關基因包括SOD1基因、SOD2基因或CAT基因之其中至少一項。

在一些實施例中，紅藜萃取物係提升體內抗氧化酶之含量以達成該抗氧化之功效。

在一些實施例中，紅藜萃取物的白利糖度（Degrees Brix）值為7.0

5。

在一些實施例中，一種紅藜萃取物用於製備改善肌膚狀態的組合物之用途，其中紅藜萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，一種紅藜萃取物用於製備肌膚美白之組合物之用途，紅藜萃取物係以含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，紅藜萃取物係透過抑制酪胺酸酶活性及/或降低黑色素生成量以達到該肌膚美白功效。

在一些實施例中，一種紅藜萃取物用於製備肌膚保濕之組合物之用途，紅藜萃取物係以含水之溶劑進行萃取。

在一些實施例中，紅藜萃取物係透過提升肌膚保濕相關基因表現量之提升以達到該肌膚保濕之功效。

在一些實施例中，肌膚保濕相關基因包含TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因。

在一些實施例中，含水之溶劑係為純水或含有有機酸之水溶劑。在一些實施例中，有機酸之濃度為0.05%-1.00%。

在一些實施例中，紅藜萃取物是以含水之溶劑形成初萃液，初萃液經糖化酵素酵解而形成紅藜萃取物。

綜上所述，任一實施例的紅藜萃取物可用以製備抗氧化之組合物。任一實施例的紅藜萃取物可用以製備提高細胞中抗氧化相關基因（如，SOD1基因、SOD2基因或CAT基因）表現量的組合物。任一實施例的紅藜萃取物可用以製備提升體內抗氧化酶的組合物。任一實施例的紅藜萃取物可用以製備肌膚保濕的組合物。任一實施例的紅藜萃取物可用以製備提高細胞中保濕相關基因（如，TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因）表現量的組合物。任一實施例的紅藜萃取物可用以製備肌膚美白的組合物。任一實施例的紅藜萃取物可用以製備抑制酪胺酸表現量的組合物。任一實施例的紅藜萃取物可用以製備抑制黑色素形成的組合物。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t檢驗（student’s t-test）進行分析。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。

本文中之「wt%」係指重量百分比，而「vol%」係指體積百分比。

如本文中所使用，術語「萃取物」係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現。

如本文所用「紅藜原料」通常係指植物種子，其中種子可包含原始、經乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之種子，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之種子。

參考圖1。在一些實施例中，一種紅藜萃取物，其是由一種含水之溶劑對紅藜原料進行萃取。在一些實施例中，紅藜萃取物（Chenopodium formosanum (Djulis) extract）係將紅藜原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S04、及濃縮程序S06後得到。

在一些實施例中，紅藜原料可以是去殼或含殼的紅藜種子。在一些實施例中，紅藜原料可以是新鮮或乾燥的紅藜種子。

在一些實施例中，粉碎程序S01是指將紅藜原料攪打至分裂為粉狀。舉例而言，粉碎可以採用果汁機、調理機或均質機。

在一些實施例中，加熱程序S02是指將粉狀的紅藜原料與含水之溶劑混合後加熱一段固定時間。在一些實施例中，加熱是指將紅藜原料與含水之溶劑的溫度提升到50℃~100℃。在一些實施例中，一段固定時間是指0.5小時到3小時。舉例而言，將紅藜原料與含水之溶劑的溫度提升到85℃進行提取1小時。

在一些實施例中，加熱程序S02中的重量比例（含水之溶劑：紅藜原料）為5：1~20：1。舉例而言，含水之溶劑：紅藜原料為10:1。

在一些實施例中，含水之溶劑可以是純水或含有有機酸之水溶劑。在一些實施例中，有機酸之濃度為0.05%到1.00%。在一些實施例中，有機酸可是可食用酸。在一些實施例中，可食用酸可以是檸檬酸（Citric Acid）、蘋果酸、酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、醋酸等，並不以此為限。

舉例而言，採用90公斤重的紅藜原料、900公斤重的水及0.63公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到100℃，並維持100℃持續0.5小時。舉例而言，採用90公斤重的紅藜原料、900公斤重的水及0.7公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到85℃，並維持85℃持續1小時。

在一些實施例中，過濾程序S04是指將加熱後（或降溫後）的紅藜原料及溶劑通過篩網以將溶劑內的固體濾除形成過濾液。舉例而言，篩網可以是400網目（mesh）的篩網。

參考圖2。在一些實施例中，加熱程序S02與過濾程序S04之間還包括降溫程序S03，降溫程序S03是指將加熱後的紅藜原料及溶劑靜置以自然降溫至室溫。

在一些實施例中，濃縮程序S06是指將過濾程序S04所得到的過濾液進行減壓濃縮（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100）以得到初萃液。在一些實施例中，濃縮程序S06所得的初萃液可即為紅藜萃取物。在濃縮程序S06的一些實施例中，在40℃~70℃之間進行減壓濃縮。舉例而言，紅藜萃取物是將紅藜原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S04及濃縮程序S06後得到。

在一些實施例中，過濾程序S04與濃縮程序S06之間可以更包括酵解程序S05。於此，酵解程序S05是指將過濾程序S04所得到的過濾液添加澱粉糖化酵素（Amylase）攪拌充分混合後，再並靜置1小時以上得到酵解液。藉由酵素的酵解作用進一步提升紅藜萃取物內有效成分的含量。在一些實施例中，澱粉糖化酵素可以是α-澱粉酶、β-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、異澱粉酶至少一或其混合。在一些實施例中，澱粉糖化酵素可以是葡萄糖澱粉酶（glucan 1,4-alpha-glucosidase）。在一些實施例中，澱粉糖化酵素的添加量為含水之溶劑的0.06%，在一些實施例中，該含水之溶劑可為水。在一些實施例中，酵解程序S05是指將過濾程序所得到的過濾液添加0.06%澱粉糖化酵素並加熱到55℃之後維持1小時以上得到酵解液。

在另一些實施例中，濃縮程序S06則是將酵解程序S05所得到的酵解液進行減壓濃縮以得到初萃液。

在一些實施例中，濃縮程序S06之後更包括再過濾程序S07是指將酵解液通過400網目（mesh）的篩網以將酵解液內的固形物濾除形成紅藜萃取物。舉例而言，紅藜萃取物是將紅藜原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S04、酵解程序S05、濃縮程序S06及再過濾程序S07後得到。

在一些實施例中，紅藜萃取物用於製備抗氧化組合物之用途，其中紅藜萃取物是透過提高細胞中抗氧化相關基因表現量達到抗氧化，且紅藜萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。在一些實施例中，前述之紅藜萃取物係透過提升體內抗氧化酶之含量以達到該抗氧化。

在一些實施例中，抗氧化係指減緩或防止氧化作用。而氧化係是一種使電子自物質轉移至氧化劑的化學反應，過程中可生成自由基，進而啟動鏈反應。當鏈反應發生於細胞中，細胞易受到破壞或凋亡。在一些實施例中，紅藜萃取物能去除自由基，終止連鎖反應並且抑制其它氧化反應。在一些實施例中，自由基之產生係因為光照、化學物質、或生物體自然衰老之過程中所產生。

在一些實施例中，抗氧化相關基因包括下列基因中的至少一者：SOD1基因（GeneID: 6647）、SOD2基因（GeneID: 6648）或CAT基因（GeneID: 847）。

如前所述，超氧化物（Superoxide Anion）與過氧化氫（Hydrogen Peroxide）等自由基會導致皮膚細胞受損。其中，SOD1與SOD2基因所轉錄出的蛋白質（超氧化物歧化酶）會將超氧化物分解為過氧化氫，而CAT基因所轉錄出的蛋白質（過氧化氫酶）則會將過氧化氫轉化為水和氧氣。此二基因所轉錄出的蛋白質對於清除氧化物與自由基相當重要。當細胞內此二基因之表現量愈高，細胞抗氧化能力愈好。

換言之，本發明之紅藜萃取物可藉由提高上述基因的表現量，有效提升細胞抗氧化，達到提升皮膚對於自由基之抵抗能力，進而達到保護皮膚細胞、改善肌膚之功能。

在一些實施例中，濃度為2 mg/mL以上的紅藜萃取物可提升氧化相關基因的表現量，藉以清除體內自由基，達到抗氧化之功效。

在一些實施例中，白利糖度（Degrees Brix）值為7.0以上的紅藜萃取物可提升氧化相關基因的表現量，藉以清除體內自由基，達到抗氧化之功效。

在一些實施例中，紅藜萃取物可以製備肌膚美白及/或提升肌膚光澤之組合物，其中紅藜萃取物是透過提高抑制黑色素生成及/或抑制酪胺酸生成以達到肌膚美白及/或提升肌膚光澤，且紅藜萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。

肌膚之所以會呈現較深的顏色係因黑色素之生成，而在黑色素生成的過程中，酪胺酸酶（Tyrosinase）佔據舉足輕重之地位。酪胺酸酶是一種氧化酶，係調控黑色素生成的限速酶。具體而言，酪胺酸酶參與了黑色素合成的兩個反應：（1）將單酚羥基化為二酚，（2）將鄰二酚氧化為鄰二醌。酪胺酸酶係存在於皮膚黑色素細胞中，係由TYR基因轉錄所形成。

在一些實施例中，紅藜萃取物可以透過抑制酪胺酸酶之形成以達到抑制、預防或減緩肌膚黑色素之形成，進而達到肌膚美白及/或提升肌膚光澤之功效。

在一些實施例中，濃度為1 mg/mL以上的紅藜萃取物可以用於提升肌膚光澤及/或提升肌膚之白皙程度。

在一些實施例中，白利糖度（Degrees Brix）值為7.0以上的紅藜萃取物可以用於提升肌膚光澤及/或提升肌膚之白皙程度。

在一些實施例中，紅藜萃取物可以製備用於肌膚保濕組合物之用途，其中該紅藜萃取物係以含水之相關溶劑進行萃取所得，且其中該紅藜萃取物係透過提升保濕相關基因之表現量以達到該肌膚保濕之效果。

在日常活動中，肌膚容易因為天氣、外在環境、甚或自身自然衰老的情況下，造成肌膚之水分散失。而此散失會因肌膚表皮細胞間之縫隙較大而加速，進而造成肌膚光澤降低、肌膚保濕度下降等。

在一些實施例中，保濕相關基因包含TGM1基因（GeneID: 7051）、KRT1基因（GeneID: 3848）、KRT10基因（GeneID: 3858）以及KRT14基因（GeneID: 3861）。

其中，KRT1基因（GeneID: 3848）、KRT10基因（GeneID: 3858）以及KRT14基因（GeneID: 3861）所轉錄出之蛋白質有助於維持角質結構緊密完善、及/或能達到保護肌膚之能力。

具體而言，KRT1基因及KRT10基因分別承載製備角蛋白1、角蛋白10及角蛋白14的資訊。角蛋白是一種纖維狀蛋白質，其組成了角質細胞（keratinocytes）之主要架構。角蛋白1、角蛋白10及角蛋白14相互結合形成角蛋白中間纖維（intermediate filaments），而這些中間纖維所形成的堅固網絡，可為皮膚提供強度和彈性，並保護其免受摩擦和其他日常物理性的損害，其亦可使皮膚表皮細胞較緊密排列，減少水分經由皮膚細胞間之縫隙散失之比例，進而達到肌膚保濕之功效。

換言之，紅藜萃取物可藉由提高上述基因表現量，提升肌膚保濕相關基因之表現量以達到改善皮膚狀態之功效。

在一些實施例中，濃度為2 mg/mL以上的紅藜萃取物可以提升肌膚之保濕能力。

在一些實施例中，白利糖度（Degrees Brix）值為7.0以上的紅藜萃取物可以提升肌膚之保濕能力。

在一些實施例中，紅藜萃取物可以用於製備撫平皺紋及/或改善肌膚紋理之組合物之用途。

在一些實施例中，濃度為10%以上的紅藜萃取物可以撫平皺紋及/或改善肌膚紋理。

在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有有效含量的紅藜萃取物。換言之，此醫藥品包含有有效含量的紅藜萃取物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）以及類似之物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。

在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。

在一些實施例中，前述之組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物（food additive），意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。

在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。

範例一：紅藜萃取物的製備

粉碎程序中將含殼的乾燥紅藜作為紅藜原料並進行粉碎。於此，採用osterizer品牌的10 speed blender進行粉碎。接著，加熱程序中以水為溶劑，將粉碎後的紅藜原料與水以1:10的重量比例混合後在85±5℃下萃取60分鐘。於此，萃取可以是將紅藜原料浸泡在水中。後續，降溫程序將粉碎後的紅藜原料與水降溫到室溫（25℃）。此後，過濾程序將降溫後的紅藜原料及水通過400網目的篩網以形成過濾液。接著，於60℃下對過濾液進行減壓濃縮至Brix值為7.0

5而得本發明之紅藜萃取物。

在一些實施例中，於前述過濾程序與減壓濃縮之間增加一酵解程序，意即將過濾液添加0.06%的澱粉糖化酵素後，在55℃下進行酵解1小時得到酵解液。於此，採用市售AMG品牌的300L酵素。

在一些實施例中，前述之溶劑除水之外，另加一有機酸，而其中該有機酸為檸檬酸。其比例佔整體溶劑之0.05%。

範例二：紅藜萃取物總黃酮定量實驗

將範例一中所得到之紅藜萃取物以水，依其體積做10倍稀釋後，取200μL到試管中。於此試管內加入200μL 5 wt%亞硝酸鈉（購自Sigma，商品編號31443）水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。

接著，加入200μL 10 wt%硝酸鋁（購自Alfa Aesar，商品編號12360）水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2 mL 4 wt%氫氧化鈉水溶液（氫氧化鈉購自Macron，產品編號7708-10），使其混合均勻。最後再加入1.4 mL的水於試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以分光光度計（Jasco，型號V-730）於500 nm的波長下偵測吸光值。

接著配製標準品以製作檢量線。本案以芸香素（rutin，購自ChromaDex，商品編號ASB-00018440）當量作為總黃酮相對含量的表示。先配製200μg/mL之芸香素甲醇溶液，作為芸香素標準液。取該芸香素標準液0μL、200μL、400μL、600μL、800μL及1000μL分別加入至不同試管中，再於該些試管中加入水，使其各試管內之總體積為1200μL。接著，針對每一試管，從試管中分別取200μL之芸香素標準溶液至另一新試管，再於此試管內加入200μL 5 wt%亞硝酸鈉水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。接著加入200μL 10 wt%硝酸鋁水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2 mL 4 wt%氫氧化鈉水溶液，使其混合均勻。最後再加入1.4 mL的水於此試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以分光光度計於500 nm的波長下偵測吸光值。將六種不同濃度的芸香素溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成檢量線。

接著，利用檢量線將稀釋後的紅藜萃取物的吸光值換算成總黃酮含量。於此，可推算出稀釋前的紅藜萃取物（即範例一中所得到之紅藜萃取物）的總黃酮含量為1000 ppm。

已知黃酮並非為本案所述改善肌膚狀態、抗氧化、或美白的活性成分，但由於已知黃酮可具有其他例如預防心血管疾病等之用途，而由本案萃取方式所得之紅藜萃取物具有高總黃酮含量，故本案之紅藜萃取物可具有多種複合用途。此外，在一些實施例中，此總黃酮含量亦可作為濃縮終點的判斷基準。

範例三 ：紅藜萃取物總多酚含量

將範例一中所得到之紅藜萃取物以水，依其體積做10倍稀釋後，取100μL到試管中。而後，於此試管內添加500μL的佛蕭酚試劑（Folin-Ciocalteu’s phenol reagent，購自Merck，貨號1.09001.0100），混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5 wt%碳酸鈉（購自Sigma，商品編號31432）水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。再經由振盪（vortex）確保溶液中無氣泡後，取其中之200μL溶液於750 nm的波長下測量吸光值。

接著，配製標準品以製作檢量線。本案以沒食子酸（Gallic acid）當量作為總多酚相對含量的表示。於此，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL之沒食子酸（沒食子酸購自Sigma，產品編號G7384）的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至不同試管中。針對各試管，於其中添加500μL的佛蕭酚試劑，混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5 wt%碳酸鈉水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。再經由振盪（vortex）確保溶液中無氣泡後，取其中之200μL溶液於750 nm的波長下測量吸光值。將六種不同濃度的沒食子酸標準溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成檢量線。

接著，利用檢量線將稀釋後的紅藜萃取物的吸光值換算成總多酚含量。於此，可推算出稀釋前的紅藜萃取物（即範例一中所得到之紅藜萃取物）的總多酚含量為400 ppm。

已知多酚並非為本案所述改善肌膚狀態、抗氧化、或美白的活性成分的活性成分，但由於已知多酚可具有其他例如預防心血管疾病等之用途，由本案萃取方式所得之紅藜萃取物有高的總多酚含量，故本案之紅藜萃取物可具有多種複合用途。此外，在一些實施例中，此總多酚含量亦可作為濃縮終點的判斷基準。

範例四：紅藜萃取物抑制酪胺酸之形成

酪胺酸酶是生物體內黑色素合成的關鍵，酪胺酸酶會催化酪胺酸轉變為L-Dopa，接著產生Dopaquinone進而形成黑色素。於此，藉由檢測酪胺酸酶活性來了解黑色素細胞產生黑色素的能力，當酪胺酸酶活性低時，黑色素細胞產生黑色素的能力就會相對降低。

材料與儀器 1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自美國典型培養物保存中心（American Type CμLture Collection，ATCC^® ，No.6475），以下簡稱B16F10細胞。 2. 培養基：含有10 vol% FBS（fetal bovine serum，購自Gibco）之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco）所配製而成。 3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。 4. 麴酸（Kojic acid）：購自Sigma-Aldrich，產品編號K3125-5G。 5. 全稱放射免疫沉澱法緩衝液蛋白質裂解液（RIPA Lysis Buffer （PMSF））：購自Sigma-Aldrich，產品編號10837091001。 6. Bio-rad Protein Assay，購自Biotek，產品編號Epoch。 7. 10 mM L-多巴（L-Dopa）：將 9.8 mg 的 L-多巴（購自Sigma-Aldrich，產品編號D9628-5G。）溶於 5mL的0.1mM，pH值7.0的PBS溶液中。 8. 胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。 9. 紅藜萃取物：以範例一之方式製備而成。

實驗步驟：

準備一6孔盤，於每一孔中種入2mL含B16F10細胞的培養基，使每孔具有 1.5 x 10⁵ 個細胞，於37°C下，培養24小時。

之後，小心移除培養液而不要干擾到貼附之細胞。本實驗分為控制組、實驗組A及實驗組B。其中，控制組（其中兩孔）加入2mL的新鮮DMEM培養液，反應48小時。而實驗組A（另兩孔）則加入2 mL濃度為1 mg/mL之紅藜萃取物樣品，反應48小時。實驗組B（最後兩孔）則加入2 mL濃度為0.5 mg/mL之紅藜萃取物樣品，反應48小時。前述A、B組之「紅藜萃取物樣品」係分別取28.6μL與14.3μL以範例一之方式所製備之紅藜萃取物加入2mL之培養基，以配製成每毫升含1 毫克及0.5毫克之紅藜萃取物之溶液。

接著，將培養液移除後，以1x PBS （Gibco）清洗兩次。再加入胰蛋白酶-EDTA對細胞作用3分鐘，回收懸浮的細胞於15 mL離心管，以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。

而後，再將沉澱細胞以1x PBS清洗兩次後，以200 μL細胞裂解液讓細胞懸浮，震盪混合後以12,000 xg離心20分鐘。

將上清液後取出至1.5 mL離心管中，進行蛋白質濃度的檢測：

先將Bio-rad染劑與去離子水混合（體積比為1:4），分裝500 μL至微量離心管中。而後，分別於前述微量離心管中，加入10、8、6、4、2、1與0 μL 2mg/mL的BSA以製備標準濃度蛋白質。再加入2 μL測試樣本進行檢測。取出前述反應後之測試樣本200 μL於96孔盤中，以ELISA讀取儀（BioTek）測定595 nm的吸光值。

接著，於每孔中加入400 μg蛋白質，再加入90 μL細胞裂解液，包括控制組。在避光環境下，在37°C下加入10 μL 10M的 L-Dopa，每10分鐘觀察一次，直到懸浮液變黑。之後再測定405 nm的吸光值。

酪胺酸酶含量的分析公式為：酪胺酸酶抑制性（%）=（樣本吸光值/控制組吸光值）×100%。所得數值再以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定進行統計分析，其結果如圖3所示。

由圖3之結果可知，在含有本發明實施例之紅藜取物的情況下，酪胺酸酶抑制性提高，且隨著紅藜萃取物的濃度增高而提升。具體而言，實驗組B（紅藜萃取物濃度為0.5 mg/mL之組別）之酪胺酸酶抑制性與控制組相比高了30.4%，而實驗組A（紅藜萃取物濃度為1 mg/mL之組別）之酪胺酸酶抑制性與控制組相比高了42.6%。由此可見，藉由本發明實施例所製備之紅藜萃取物，確實可降低酪胺酸酶活性，進而可減少黑色素的生成，因而可應用於減少皮膚黑斑、提升肌膚光澤、白皙度肌膚美白的相關組合物的成分中。

範例五：紅藜萃取物 降低黑色素生成

於此，以ELISA讀盤機（enzyme-linked immunosorbent assay reader）測定黑色素瘤細胞株B16F10經紅藜萃取物處理後，其黑色素含量的變化。

材料與儀器 1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自美國典型培養物保存中心（American Type CμLture Collection，ATCC®，No.6475），以下簡稱B16F10細胞。 2. 培養基：含有10 vol% FBS（fetal bovine serum，購自Gibco）之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco）所配製而成。 3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。 4. 以二次蒸餾水配製1N NaOH（購自Sigma，產品編號221465）溶液。 5. ELISA reader（BioTek，FLx 800） 7. 藍光箱（波長：400nm-500nm） 6. 紅藜萃取物：範例一之方式製備而成。

實驗步驟

實驗將會分為實驗組以及控制組（未添加紅藜萃取物的組別）兩組進行，各組分別進行三重複試驗： 1. 將B16F10細胞以每孔1.5×10⁵ 個的方式，接種於每孔含2mL培養基之6孔培養盤中。 2. 將培養盤置於5％CO₂ 、37℃環境下，培養24小時。 3. 而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之培養基。 4. 實驗組：於每孔中加入紅藜萃取物樣品2 mL後，於37℃下培養24小時。其中，紅藜萃取物樣品係將以範例一之方式所製備之紅藜萃取物與培養基配製成每毫升培養基含0.5毫克紅藜萃取物的溶液（即取14.3μL以範例一之方式所製備之紅藜萃取物加入2mL之培養基，以配製成每毫升含0.5毫克之紅藜萃取物之溶液。）。控制組：在37℃下，添加2 mL的培養基至每孔中，使其於37℃下培養24小時。 5.實驗組：將經過培養基溶液處理步驟的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫（25±5℃）下接受藍光照射3小時。控制組：將6孔培養盤移至暗室中，使其在室溫下靜置3小時。 6. 反應後，將細胞於37℃下培養48小時。 7. 而後，移除培養基，並以PBS溶液清洗細胞2次。 8. 將200μl胰蛋白酶（Trypsin-EDTA （10X），購自Gibco；產品編號15400-054）加至每孔中反應3分鐘。反應後，添加6 mL培養基溶液終止反應。而後收集各孔中之懸浮細胞與培養基至對應的15ml離心試管內，將各離心試管以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。 9. 以PBS溶液清洗沉澱細胞二次後，再以200μL PBS溶液重新懸浮細胞。 10. 將細胞懸浮液以液態氮冷凍10分鐘，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。 11. 完全解凍後，將試管以12,000g離心3分鐘。 12. 移除上清液，再以120μL 1N氫氧化鈉溶液重新懸浮細胞沉澱後，使試管於60℃乾浴1小時，以獲得待檢測樣本。 13. 將100μL待檢測樣本移入一96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在450nm的光密度值（optical density，OD450），作為吸光度。

實驗結果

實驗組以及控制組的黑色素相對表現量係依下列公式計算：黑色素相對表現量（%）=（各組OD₄₅₀ 值/空白控制組OD₄₅₀ 值）×100%。因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖4。

如圖4所示，由實驗組以及控制組的結果可知，當細胞經過紅藜萃取物處理後，其黑色素含量將低於未經過紅藜萃取物處理的控制組（降低約29.7%），顯示紅藜萃取物可有效減少黑色素細胞所生成之黑色素。

範例六：抗氧化相關基因試驗

此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經本發明之紅藜萃取物處理後，細胞中抗氧化相關基因的變化。

材料與儀器 1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（BCRC No. 60153）。 2. 細胞培養基：含有10 vol% FBS（購自Gibco）之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco）所配製而成。 3. RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）。 4. 反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase）（Invitrogen公司，美國，編號18080-051）。 5. 測量標的基因引子，其中包含SOD2基因，另包括內部控制組（GAPDH基因）。 6. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）。 7. ABI StepOnePlusTM即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。 8. 紅藜萃取物：由本案範例一所述之製備方式所得之紅藜萃取物。

實驗步驟細胞培養的實驗流程如下： 1. 首先以每孔1×10⁵ 個細胞量培養於含有2 mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37 ℃下培養16小時，然後將CCD-966sk細胞分為實驗組與控制組。 2. 實驗組：每毫升培養液含有28.6 μL範例一之方式製備而成之紅藜萃取物萃取物的比例（即，濃度為1mg/mL）製得含萃取物的培養液，將CCD-966sk細胞更換為含萃取物的培養液中繼續培養。 3. 控制組：不做任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的CCD-966sk細胞的培養液中。 4. 實驗組與控制組於培養6小時後，將培養後的實驗組與控制組細胞以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。聚合酶連鎖反應的實驗流程如下： 1. 使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。 2. 接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶以表2中之引子（primer）黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。 3. 後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST將二組反轉錄後產物分別以表2之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察實驗組和控制組的CCD-966sk細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95 °C反應1秒，60 °C反應20秒，總共40個迴圈。 4. 爾後，使用2^-ΔΔCt 方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之一目標基因相對於控制組或對照組之同一基因的RNA表現量倍數變化。該方法以GADPH基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化： △Ct = Ct_{實驗組之目標基因} _/ _{控制組或對照組之目標基因} - Ct _TBP △△Ct= △Ct_{實驗組之目標基因} - △Ct_{控制組之目標基因} 倍數變化 = 2^-ΔΔCt ^平均值 5. 最終，利用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾Student t-test分析是否具有統計上顯著差異（*p值＜0.05; **p值＜0.01; ***p值＜0.001）。其中，SOD2基因對應的引子對為SOD2-F與SOD2-R，而TBP基因對應的引子對為TBP-F與TBP-R。

表1

引子名稱	序列編號	序列
SOD2-F	SEQ ID NO:1	AGAGTGGACCAACTGAAGAGT
SOD2-R	SEQ ID NO:2	ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT
GADPH-F	SEQ ID NO:3	TCCTACTTGGACAAAGTTCGGG
GADPH-R	SEQ ID NO:4	CCCCTGATGTGAGTTGCCA

實驗結果

參照圖5，其為經本發明紅藜萃取物處理之實驗組與未經本發明紅藜萃取物處理之控制組之抗氧化相關基因相對表現量之長條圖。（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。

由該圖可知，實驗組之SOD2基因相對表現量約為2725%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的皮膚纖維母細胞中的抗氧化相關基因SOD2基因提升2625%，達統計學上之顯著差異。由此可知，本案之紅藜萃取物有清除自由基，進而達到抗氧化之功能。

範例七：保濕相關基因試驗

此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類表皮角質細胞HPEK-50經本發明之紅藜萃取物處理後，細胞中保濕相關基因的變化。

材料與儀器 1. 角質細胞專用之無血清培養基（Keratinocyte-SFM；購自Thermo，產品編號17005042）。 2. 人類表皮角質細胞（以下簡稱HPEK-50細胞或角質細胞；購自CELLnTEC）。 3. RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）。 4. 反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase）（Invitrogen公司，美國，編號18080-051）。 5. 測量標的基因引子，其中包含TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因，另包括內部控制組（TBP基因）。 6. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）。 7. ABI StepOnePlusTM即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。 8. 紅藜萃取物：由本案範例一所述之製備方式所得之紅藜萃取物。

實驗步驟細胞培養的實驗流程如下： 1. 於此，培養基採用角質細胞專用之無血清培養基。 2. 首先以每孔1×10⁵ 個細胞量培養於含有2 mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37 ℃下培養16小時，然後將HPEK-50細胞分為實驗組與控制組。 3. 實驗組：每毫升培養液含有57.2μL範例一之方式製備而成之紅藜萃取物萃取物的比例（即，濃度為2mg/mL）製得含萃取物的培養液，將HPEK-50細胞更換為含萃取物的培養液中繼續培養。 4. 控制組：不做任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的HPEK-50細胞的培養液中。 5. 實驗組與控制組於培養6小時後，將培養後的實驗組與控制組細胞以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。聚合酶連鎖反應的實驗流程如下： 1. 使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。 2. 接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶以表2中之引子（primer）黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。 3. 後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST將二組反轉錄後產物分別以表2之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察實驗組和控制組的HPEK-50細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95 ℃反應1秒，60 ℃反應20秒，總共40個迴圈。 4. 爾後，使用2^-ΔΔCt 方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之一目標基因相對於控制組或對照組之同一基因的RNA表現量倍數變化。該方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化： △Ct = Ct_{實驗組之目標基因} _/ _{控制組或對照組之目標基因} - Ct _TBP △△Ct= △Ct_{實驗組之目標基因} - △Ct_{控制組之目標基因} 倍數變化 = 2^-ΔΔCt ^平均值 5. 最終，利用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾Student t-test分析是否具有統計上顯著差異（*p值＜0.05; **p值＜0.01; ***p值＜0.001）。其中，TGM1基因對應的引子對為TGM1-F與TGM1-R，KRT1基因對應的引子對為KRT1-F與KRT1-R，KRT10基因對應的引子對為KRT10-F與KRT10-R，TBP基因對應的引子對為TBP-F與TBP-R。

表2

引子名稱	序列編號	序列
TGM1-F	SEQ ID NO:5	GATCGCATCACCCTTGAGTTAC
TGM1-R	SEQ ID NO:6	GCAGGTTCAGATTCTGCCC
KRT1-F	SEQ ID NO:7	AGAGTGGACCAACTGAAGAGT
KRT1-R	SEQ ID NO:8	ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT
KRT10-F	SEQ ID NO:9	TCCTACTTGGACAAAGTTCGGG
KRT10-R	SEQ ID NO:10	CCCCTGATGTGAGTTGCCA
TBP-F	SEQ ID NO:11	TATAATCCCAAGCGGTTTGC
TBP-R	SEQ ID NO:12	GCTGGAAAACCCAACTTCTG

實驗結果

參照圖6，其為經本發明紅藜萃取物處理之實驗組與未經本發明紅藜萃取物處理之控制組之保濕相關基因相對表現量之長條圖。（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。

由該圖可知，當控制組之TGM1基因、KRT1基因及KRT10基因表現量為100%時，實驗組之TGM1基因、KRT1基因及KRT10基因表現量分別約為234%、432%及435%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的角質細胞中的保濕相關基因TGM1基因、KRT1基因與KRT10基因分別提升134%、332%與335%，且均達統計學上之顯著差異。由此可知，本案之紅藜萃取物有防止肌膚水分過度散失，增強保濕度，進而改善肌膚外觀之功能。

範例八：人體試驗 - 抗氧化及改善肌膚狀態

於此，令受試者飲用含本發明之紅藜萃取物之飲品，探討以內服之方式使用本發明之紅藜萃取之抗氧化及肌膚改善效果。

使用樣品：含本發明之紅藜萃取物之飲品50g/瓶，其中包含：紅藜萃取10wt%、蘋果濃縮果汁 6wt%、果糖 6wt%、柑橘果膠0.4wt%、檸檬酸0.2wt%、蘋果液態香料0.24wt%、水77.16wt%。在另一些其他的實施例中，每人一日可攝取紅藜萃取物至多10g。其中，此紅藜萃取物係由範例一之方法所製備而成。其中蘋果濃縮果汁6wt%、果糖6wt%、柑橘果膠0.4wt%、檸檬酸0.2wt%、蘋果液態香料0.24wt%、水77.16wt%為增添風味、提升飲品保存期限用。

受試者人數：30位30-55歲之受試者。

實驗方式 1. 收集30位受試者，於使用受試者飲用含本發明之紅藜萃取物之飲品前（臉部已清潔，第0週），依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值，並蒐集受試者之血液（空腹）以測量體內抗氧化酶之含量。 2. 接著，隨機挑選15位受試者作為安慰劑組，其餘15位作為實驗組。其中，實驗組每日飲用一瓶含本發明之紅藜萃取物之飲品（每瓶含有5g本發明之紅藜萃取物），共飲用56日（即8週）。而安慰劑組則每日飲用一瓶安慰劑飲品（飲品內除以相同水量取代本發明之紅藜萃取物之外，其餘內容物均與實驗組所飲用之飲品相同）。 3. 安慰劑組與實驗組之受試者分別飲用安慰劑飲品與含本發明之紅藜萃取物之飲品28日與56日後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚之數值，並蒐集受試者之血液（空腹）以測量體內抗氧化酶之含量。（於飲用前、後進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，且於進行試驗期間，受試者之飲食習慣與生活作息均未改變，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響以及其餘因子造成體內抗氧化含量之影響）。

檢測項目將分別進行1.肌膚含水量、2.肌膚色澤、3.肌膚紋理、4.魚尾紋以及5.血液生化數值（體內抗氧化酶含量）之檢測。

1.肌膚含水量

使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚含水量檢測探頭Corneometer^® CM825 (C+K MμLti Probe Adapter System, Germany)對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。該檢測探頭係基於電容的原理進行測量。當水分含量發生變化時，皮膚的電容值亦發生變化，故可通過測定皮膚電容值，分析皮膚表面的含水量。

2.肌膚色澤

使用愛爾蘭公司Miravex的Antera 3D分析肌膚實證鏡頭對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。該儀器係對肌膚以不同角度發射不同波段的LED (light emitting diodes)，透過感應器收集其反射後以電腦協作重組肌膚表面。肌膚膚色係以其Colorimeter色度分析功能，分析肌膚的L *a *b *顏色數值，其中L *代表亮度，a *和b *表示顏色對立維度。就兩色(

)與(

)之膚色差異(

)係以以下公式計算：

因本實施例主要測量為美白程度之變化，因此主要觀測L * 值，當L * 值愈高，代表膚色亮度愈高，肌膚愈白。

3.肌膚紋理

使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測，其原理乃以可見光拍攝高解析度之肌膚影像，並以內建軟體根據皮膚的凹陷與凸起進行粗糙度分析。測量數值越高，說明皮膚越越粗糙。

4.魚尾紋測量

使用舒特皮膚檢測儀（Soft Plus, Callegari 1930）於眼尾進行測量，其係藉由標準白光偵測皮膚陰影變化，以量化眼尾紋深度。

5.血液生化數值檢測-抗氧化酶

首先，將蒐集到的血液移至離心管中，並於4℃以700-1000 xg之轉速離心10分鐘。於離心後，移除上層血漿，取2mL之膚色血球層（即，buffy coat）置於另一離心管中，再加入2mL之PBS均勻混和，以提供經稀釋的buffy coat。

將經稀釋的buffy coat緩慢加入至內有3mL之Ficoll-Plague Plus溶液（購自Sigma）的另一離心管中，然後以400g之轉速離心40分鐘。於離心後，移除上層液體後，取出約2mL-3mL之中間層（即，單核細胞層）置於新的離心管中。

將離心管中的單核細胞以PBS清洗3至5次後，再以300g之轉速離心10分鐘。於離心後，取上清液作為後續實驗養品。

接著，參照Cayman Catalase Assay Kit，No.707002內所提供之實驗步驟進行過氧化氫酶分析，相關流程簡述如下（詳見：https://www.caymanchem.com/pdfs/707002.pdf）：

取10 μL之過氧化氫酶甲醛標準溶液（Cayman，No.707014）與9.99mL的緩衝溶液配成4.25mM的甲醛溶液。取7支試管，將其標為A至G，並以下表之方式配置標準溶液：

表3

試管	甲醛 (μL)	緩衝溶液 (μL)	最終甲醛濃度(μM)
A	0	1000	0
B	10	990	5
C	30	970	15
D	60	940	30
E	90	910	45
F	120	880	60
G	150	850	75

本實驗分為三組：甲醛標準組、正控制組及實驗組，且均於Catalase Assay Kit中提供。其中甲醛標準組有7孔，各孔係由係由100μL緩衝溶液、30μL甲醇以及20μL之標準溶液（試管A至G）所組成；正控制組有兩孔，包含100μL緩衝溶液、30μL甲醇以及20μL之稀釋之抗氧化酶所組成；而實驗組之各孔由100μL緩衝溶液、30μL甲醇以及20μL之實驗樣品所組成。

透過加入20μL之過氧化氫於各孔將反應啟動，並將孔蓋蓋上後於室溫搖晃10分鐘。

接著，加入30μL的氫氧化鉀以終止反應，並加30μL的呈色劑（Catalase Purpald，購自Cayman No.707017）至各孔，並將孔蓋蓋上後於室溫搖晃10分鐘。

而後，加入10μL的Catalase Potassium Periodate（購自Cayman No.707017）並將孔蓋蓋上後於室溫搖晃5分鐘。

最後，讀取540 nm 的吸光值。

過氧化氫酶的計算方式如下：

先將各樣品之吸光值減去標準溶液A之吸光值，並以該些值作圖。其中y軸為吸光值（540nm），x軸為甲醛之濃度（μM）。接著計算實驗組之甲醛濃度：

藉此以計算過氧氫酶之活性：

獲取結果後係將未使用本發明之紅藜萃取物時基本血液數值以100.0%呈現，比較使用產品後血液中過氧化氫酶含量。

請參閱圖7。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之紅藜萃取物之飲品後之肌膚含水量之平均改善百分比，而飲用第4週及第8週之改善之人數比例均佔達受試人數之93%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚含水量為100%時，飲用4週後之平均肌膚含水量為109.3%，飲用8週後之平均為113.9%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之紅藜萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚含水量分別提升9.3%與13.9%，均達統計上之顯著（「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001），且分別較安慰劑組改善情形高5.1%與6.6%。由此可見，本發明之紅藜萃取物具有提升肌膚含水量，鎖住肌膚水分，以及提升肌膚保濕效果之功能。

請參閱圖8。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之紅藜萃取物之飲品後之肌膚色澤之平均改善百分比，而於飲用第4週與第8週改善之人數比例分別佔達受試人數之93%與100%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚色澤為100%時，飲用4週後之平均肌膚色澤為103.0%，飲用8週後之平均為103.8%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之紅藜萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚色澤分別提升3.0%與3.8%，均達統計上之顯著（「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001），且分別較安慰劑組改善情形高3.6%與4.1%，均達統計上之顯著差異（「###」符號代表與安慰劑相比p值小於0.001）。由此可見，本發明之紅藜萃取物具有肌膚美白，改善肌膚色澤與光澤之功能。

請參閱圖9。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之紅藜萃取物之飲品後之肌膚紋理之平均改善百分比，而於飲用第4週與第8週改善之人數比例分別佔達受試人數之80%與73%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均肌膚紋理為100%時，飲用4週後之平均肌膚紋理為91.1%，飲用8週後之平均為90.2%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之紅藜萃取物之飲品4週與8週後，平均肌膚紋理分別減少8.9%與9.8%，且分別較安慰劑組減少10.6%與18.1%。由此可見，本發明之紅藜萃取物具有撫平肌膚皺紋，改善肌膚紋理與降低肌膚粗糙程度之功能。

請參閱圖10。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之紅藜萃取物之飲品後之魚尾紋之平均改善百分比，而於飲用第4週與第8週改善之人數比例均佔達受試人數之100%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均魚尾紋百分比為100%時，飲用4週後之平均肌膚色澤為81.5%，飲用8週後之平均為78.5%，均達統計上之顯著差異（「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001）。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之紅藜萃取物之飲品4週與8週後，平均魚尾紋比例降低18.5%與21.5%，且分別較安慰劑組改善情形高9.9%與8.9%，均達統計上之顯著差異（「###」符號代表與安慰劑相比p值小於0.001）。由此可見，本發明之紅藜萃取物具有減少魚尾紋之功效。

請參閱圖11。該圖係安慰劑組受試者與實驗組受試者在分別飲用安慰劑飲品與含本發明之紅藜萃取物之飲品後之體內抗氧化酶（Catalase）之百分比，而於飲用第8週改善之人數比例均佔達受試人數之100%。其中，當實驗組受試者於飲用前之平均體內抗氧化酶含量為100%時，飲用8週後之平均為302.1%。換言之，實驗組之受試者飲用含本發明之紅藜萃取物之飲品8週後，平均體內抗氧化酶含量分別提升202.1%，達統計上顯著差異（「***」符號代表與飲用前相比p值小於0.001）且分別較安慰劑組改善情形高183.7%，均達統計上之顯著差異（「###」符號代表與飲用前相比p值小於0.001）。由此可見，本發明之紅藜萃取物具有提升體內抗氧化酶含量，進而達到抗氧化、清除體內自由基之功能。

雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

無

圖1是一實施例的紅藜萃取物製備方法流程圖。圖2是另一實施例的紅藜萃取物製備方法流程圖。圖3是範例四中實驗組及控制組的酪胺酸抑制性比例圖。圖4是範例五中實驗組及控制組的黑色素生成比例圖。圖5是範例六中實驗組及控制組的抗氧化相關基因表現量比例圖。圖6是範例七中實驗組及控制組的保濕相關基因表現量比例圖。圖7是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚含水量比較圖。圖8是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚白皙度/色澤比較圖。圖9是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之肌膚紋理比例比較圖。圖10是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之魚尾紋比例比較圖。圖11是範例八中實驗組與安慰劑組於第4週及第8週之體內抗氧化酶含量比例比較圖。

Claims

一種紅藜（Chenopodium formosanum (Djulis) ）萃取物用於製備一肌膚美白組合物之用途，其中該紅藜萃取物係以一含水之溶劑對一紅藜進行萃取。
如請求項1所述之用途，其中該紅藜萃取物係透過減少或抑制皮膚黑色素形成以達到該肌膚美白。
一種紅藜（Chenopodium formosanum (Djulis) ）萃取物用於製備一肌膚保濕組合物之用途，其中該紅藜萃取物係以一含水之溶劑對一紅藜進行萃取。
如請求項3所述之用途，其中該紅藜萃取物係透過強化皮膚細胞排列以達到該肌膚保濕。
如請求項3或4其中任一項所述之用途，其中該紅藜萃取物係透過提升肌膚保濕相關基因之表現量以達到該肌膚保濕。
一種紅藜（Chenopodium formosanum (Djulis) ）萃取物用於製備一清除細胞內自由基之組合物的用途，其中該紅藜萃取物係以一含水之溶劑對一紅藜進行萃取。
3或6其中任一項所述之用途，其中該紅藜萃取物之總黃酮量大於1000 ppm。
3或6其中任一項所述之用途，其中該紅藜萃取物之總多酚量大於400 ppm。
3或6其中任一項所述之用途，其中該紅藜萃取物的濃度為0.5mg/mL以上。
3或6其中任一項所述的用途，其中該組合物為一醫藥組合物、一保健食品組合物、一食品組合物、或一保養品組合物。