TW202300031A - 李子萃取物用於製備提升身體機能組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

一種李子萃取物用於製備提升身體機能組合物的用途，其中李子萃取物提取自開花後2~3個月內未熟成的青色的李子。

Description

李子萃取物用於製備提升身體機能組合物的用途
本發明關於一種萃取物，特別是關於提取自開花後2~3個月內未熟成的青色的李子的李子萃取物用於製備提升身體機能組合物的用途。
李子是薔薇科（Rosaceae）植物李屬（Prunus）的果實，通常在七月到八月之間採收果實，可以鮮食也常被製成罐頭。李子自古被列為「五果」之首，也被本草綱目譽為能養顏美容的水果。
成熟的李子口感酸甜、果肉軟而果汁多，十分受到消費者的歡迎。李樹對氣候的適應力強，對土壤的要求也不嚴格，生長也迅速，也是農民喜愛的經濟農產物。
但是，未成熟的李子味道酸澀、果肉過硬，並無法食用。基此，本發明提供一種李子萃取物的用途，其是用於製備提升身體機能的組合物，且李子萃取物提取自開花後2~3個月內未熟成的青色的李子。將未熟成的青色李子果實進一步進行利用，提升其整體產業價值，解決產業生產過剩或疏果過程中疏落的未熟成的青色李子果實。
在一些實施例中，提升身體機能是指提升減脂相關基因表現量，其中上述減脂相關基因是指LIPE基因。
在一些實施例中，提升身體機能為抑制細胞內脂肪油滴堆積。
在一些實施例中，提升身體機能為提升新陳代謝效率。
在一些實施例中，提升新陳代謝效率是提升丙酮酸生成效率。
在一些實施例中，提升身體機能為減少體重及/或減少腰圍。
在一些實施例中，提升身體機能為改善腸胃道機能。在一些實施例中，改善腸胃道機能為改善腹脹、噁心、反胃等症狀其中之一。在一些實施例中，改善腸胃道機能為提升腸道蠕動、改善便秘、糞質軟化等症狀其中之一。
在一些實施例中，組合物為一食品組合物，且組合物內至少包含上述李子萃取物2克/日。意即，李子萃取物的有效用量為2克/日。
綜上所述，根據任一實施例的李子萃取物，其可以提升身體機能。根據任一實施例的李子萃取物，其可以提升減脂相關基因表現量，藉由提升LIPE基因表現量達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其可以抑制細胞內脂肪油滴堆積，藉由抑制細胞內脂肪油滴堆積達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其可以提升新陳代謝效率，藉由提升丙酮酸生成效率達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其藉由減少體重及/或減少腰圍達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其藉由改善腸胃道機能達到提升身體機能的用途。並且，根據任一實施例的李子萃取物，在每日服用李子萃取物2克的情況下即能有效達到提升身體機能的用途。
本發明提供一種李子萃取物的用途，其是用於製備提升身體機能的組合物，且李子萃取物提取自開花後2~3個月內未熟成的青色的李子。
在一些實施例中，李子萃取物是李子原料以溶劑經由萃取步驟而製得。
在一些實施例中，李子原料是指李樹（學名： Prunus sect. Prunus）自開花後2~3個月內未熟成的青色果實。在一些實施例中，李子原料是中國李（學名： Prunus salicina）所製得。在一些實施例中，李子原料是指整顆果實，果實包括果皮、果肉及果核。在一些實施例中，李子原料是指李子新鮮果實、乾燥果實、冷凍果實或以其他物理方式加工以利處理之果實。在一些實施例中，李子原料可以是完整果實、剁碎果實、切丁果實、碾磨果實、研磨果實或以其他方式經加工以處理原物料之大小及實體完整性之果實。舉例而言，將李子的青色果實設備以粗碎孔徑30mm進行粉碎後取得李子原料。
在一例實施例中，溶劑可以是純水。在一些實施例中，溶劑與李子原料的重量比例為5~20：1~5。在一些實施例中，溶劑與李子原料的重量比例為5：1。
在一些實施例中，萃取步驟是指溶劑和李子原料混合之後加熱到設定溫度後並維持溫度一段固定時間。在一些實施例中，設定溫度可以是85±5℃。在一些實施例中，固定時間可以是60分鐘~90分鐘。在另一些實施例中，萃取步驟是指溶劑和李子原料混合之後加熱到設定溫度後並維持溫度一段固定時間。若溶劑過少或固定時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若萃取時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。
在一些實施例中，萃取步驟之後還包括過濾步驟，過濾步驟是指將萃取步驟之後的李子原料及溶劑通過篩網以將溶劑內的固體濾除形成過濾液體。舉例而言，篩網可以是400網目（mesh）的篩網。在一些實施例中，過濾步驟是指將萃取步驟之後的李子原料及溶劑先進行離心並取得上清液之後，再將上清液通過篩網以將溶劑內的固體濾除形成過濾液體。
在一些實施例中，萃取步驟和過濾步驟之間還包括降溫步驟，降溫步驟是指將加熱後的李子原料及溶劑靜置以自然降溫至室溫（25℃-30℃）。
在一些實施例中，李子萃取物是李子原料以溶劑經由萃取步驟之後進行過濾步驟，最後再進行減壓濃縮而製得。
在一些實施例中，濃縮步驟是以減壓濃縮機在45℃-70℃下進行。在一些實施例中，濃縮步驟是以減壓濃縮機在60℃±5℃下進行。舉例而言可以採用廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100。在一些實施例中，濃縮步驟在將液體濃縮至白利糖度值（Degrees Brix）5.0±0.5時停止。在一些實施例中，減壓濃縮的壓力設定值為150巴（Bar）。於此，透過減壓濃縮能去液體內酒精成分，並且減少存放體積。
在一些實施例中，提升身體機能是指提升減脂相關基因表現量，其中上述減脂相關基因是指激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，LIPE，gene ID 3991）基因（後續簡稱LIPE基因）。LIPE基因會轉錄生成荷爾蒙敏感性脂解酶（Hormone-Sensitive Lipase，簡稱HSL）。而HSL則將雙酸甘油脂水解成單酸甘油脂，其於脂肪分解上扮演舉足輕重的角色。
在一些實施例中，提升身體機能為抑制細胞內脂肪油滴堆積。
在一些實施例中，提升身體機能為提升新陳代謝效率。在一些實施例中，提升新陳代謝效率是提升丙酮酸（Pyruvate）生成效率。
在一些實施例中，提升身體機能為減少體重及/或減少腰圍。
在一些實施例中，提升身體機能為改善腸胃道機能。在一些實施例中，改善腸胃道機能為改善腹脹、噁心、反胃等症狀其中之一。在一些實施例中，改善腸胃道機能為提升腸道蠕動、改善便秘、糞質軟化等症狀其中之一。
在一些實施例中，組合物為一食品組合物，且組合物內至少包含上述李子萃取物2克/日。意即，李子萃取物的有效用量為2克/日。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的李子萃取物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用產品（即食品組合物）。換言之，食用產品包含特定含量的李子萃取物。在一些實施例中，食用產品可為一般食品、保健食品、膳食補充品或食品添加物（food additive）。
在一些實施例中，前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。
在一些實施例中，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的李子萃取物（即作為食品添加物），或是於食品的製作過程中添加任一實施例的李子萃取物（即作為食品添加物），而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品。
例 1 ：樣本的製備
李子萃取物樣本一：將未熟成的青色李子果實（學名： Prunus salicina）粉碎後成為李子原料。於此，青色李子果實採用冷凍的整顆果實，意即含有果皮、果肉及果核。於此，採用osterizer品牌的10 speed blender粉碎機進行粉碎，並且設定孔徑為30mm。接著，以水為溶劑，將粉碎後的李子原料與溶劑以1:5的重量比例混合後在85℃下萃取1小時後，降溫到室溫（25℃）。然後，將降溫後的李子原料及溶劑進行離心取得上清液後，將上清液通過400網目的篩網以形成過濾液。於此，採用廠牌/型號：Thermo Scientific Heraeus Fresco 17進行離心。接著，於60℃下對過濾液進行減壓濃縮至白利糖度達到 5.0±0.5 Brix而製得李子萃取物樣本。於此，採用廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100進行減壓濃縮。
李子萃取物樣本二：採用95.79%的水，4%的李子萃取物樣本一，0.2%的檸檬酸及0.01%的蔗糖素混合製成。。
對照樣本A：以粉碎機將乾燥熟成的紅色李子果實（學名： Prunus salicina）以粗碎孔徑30mm進行粉碎後成為李子原料。於此，採用osterizer品牌的10 speed blender進行粉碎。接著，以水為溶劑，將粉碎後的李子原料與溶劑以1:5的重量比例混合後在85℃下萃取1小時後，降溫到室溫（25℃）。然後，將降溫後的李子原料及溶劑進行離心取得上清液後，將上清液通過400網目的篩網以形成過濾液。於此，採用廠牌/型號：Thermo Scientific Heraeus Fresco 17進行離心。接著，於60℃下對酵解液進行減壓濃縮至白利糖度達到5.0±0.5 Brix而製得對照樣本A。於此，採用廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100進行減壓濃縮。
對照樣本B：以粉碎機將另一品種的未熟成的青色李子果實（水李，也稱澳洲李、東方李，學名： Prunus salicina）粉碎後以10目數的篩網過篩之後成為李子原料。於此，採用osterizer品牌的10 speed blender進行粉碎。接著，以水為溶劑，將粉碎後的李子原料與溶劑以1:5的重量比例混合後在85℃下萃取1小時後，降溫到室溫（25℃）。然後，將降溫後的李子原料及溶劑進行離心取得上清液後，將上清液通過400網目的篩網以形成過濾液。於此，採用廠牌/型號：Thermo Scientific Heraeus Fresco 17進行離心。接著，於60℃下對酵解液進行減壓濃縮至白利糖度達到5.0±0.5 Brix而製得對照樣本B。於此，採用廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100進行減壓濃縮。
例 2 ：李子萃取物與熟成李提取物含量比較
2.1. 總黃酮含量測試
分別以前述例1所得的對照樣本A為對照組樣本及李子萃取物樣本一為實驗組樣本。將各樣本以水稀釋20倍至1200μL。接著，分別加入200μL的5%亞硝酸鈉並混合後靜置6分鐘後，再加入200μL的10%硝酸鋁並混合後靜置6分鐘，接著加入2ml的4%氧氧化鈉並混合，最後再加入1.4ml的水並混合以得到待測反應溶液。將待測反應溶液至96孔板中，並以分光光度計測量待測反應溶液在500nm下的吸光值。
並且，以芸香苷(rutin)作為標準品以製作標準曲線。於此，配置0μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、1000μg/mL及1200μg/mL之芸香苷的標準溶液。將各標準溶液分別加入200μL的5%亞硝酸鈉並混合後靜置6分鐘後，再加入200μL的10%硝酸鋁並混合後靜置6分鐘，接著加入2ml的4%氧氧化鈉並混合，最後再加入1.4ml的水並混合以得到待測標準品溶液。將200μL的待測標準品溶液移至96孔板中，並以分光光度計測量待測反應溶液在500nm下的吸光值分別為0μg/mL的吸光值為0.035、400μg/mL的吸光值為0.13、600μg/mL的吸光值為0.183、1000μg/mL的吸光值為0.273及1200μg/mL的吸光值為0.335，並以上述結果依線性回歸計算以獲得標準曲線。
接著，利用標準曲線將待測反應溶液的吸光值換算成總黃酮含量。於此，可得到對照樣本A(對照組)的總黃酮含量為2219µg/mL及李子萃取物樣本一(實驗組)的總黃酮含量2317µg/mL，如圖1所示。
實驗結果如圖1所示，本發明實施例的李子萃取物的總黃酮含量較所製得的對照組樣本A的總黃酮含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和熟成的紅色李子二者並不相同。
2.2. 丹寧含量測試
分別以前述例1所得的對照樣本A為對照組樣本及李子萃取物樣本一為實驗組樣本。將各樣本取1mL於25mL定量瓶，並以超純水定量。接著，將各樣品取10μL分別加入750μL超純水後混合均勻。再加入50μL的福林酚試劑(Folin & ciocalten’s phenol reagent )並混合後靜置8分鐘後，再加入100μL的飽合碳酸鈉溶液並混合後於室溫下反應2小時以得到待樣品溶液。將200μL的待測樣品溶液移至96孔板中，並以分光光度計測量待測樣品溶液在765nm下的吸光值。
並且，以單寧酸(Tannic acid)作為標準品以製作標準曲線。於此，配置0ppm、100ppm、200ppm、600ppm及800ppm之單寧酸的標準溶液。將各標準溶液取10μL分別加入750μL超純水後混合均勻。再加入50μL的福林酚試劑(Folin & ciocalten’s phenol reagent )並混合後靜置8分鐘後，再加入100μL的飽合碳酸鈉溶液並混合後於室溫下反應2小時以得到待測標準品溶液。將200μL的待測標準品溶液移至96孔板中，並以分光光度計測量待測反應溶液在765nm下的吸光值，並依據量測結果依線性回歸計算以獲得標準曲線。
接著，利用標準曲線將待測反應溶液的吸光值換算成單寧酸含量。於此，可得到對照樣本A(對照組)的丹寧含量為2039µg/ml及李子萃取物樣本一(實驗組)的丹寧含量3559µg/ml。
實驗結果如圖2所示，本發明實施例的李子萃取物的丹寧含量較所製得的對照組樣本A的丹寧含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和熟成的紅色李子二者並不相同。
例 3 ：李子萃取物與其他品種青果提取物含量比較
3.1. 總黃酮含量測試
分別以前述例1所得的對照樣本B為對照組樣本及李子萃取物樣本一為實驗組樣本。測試流程參考上述2.1，採用相同的實驗步驟與實驗設備。
最後，利用標準曲線將待測反應溶液的吸光值換算成總黃酮含量。於此，可得到對照樣本B的總黃酮含量為1007µg/ml及李子萃取物樣本一的總黃酮含量2307µg/ml。
實驗結果如圖3所示，本發明實施例的李子萃取物的總黃酮含量較所製得的對照樣本B的總黃酮含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和其他品種的未成熟青色李子二者並不相同。
3.2. 丹寧含量測試
分別以前述例1所得的對照樣本B為對照組樣本及李子萃取物樣本一為實驗組樣本。測試流程參考上述2.2，採用相同的實驗步驟與實驗設備。
最後，利用標準曲線將待測反應溶液的吸光值換算成單寧酸含量。於此，可得到對照樣本B的總黃酮含量為1756µg/mL及李子萃取物樣本一的總黃酮含量3599µg/mL。
實驗結果如圖4所示，本發明實施例的李子萃取物的丹寧含量較所製得的對照樣本B的丹寧含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和其他品種的未成熟青色李子二者並不相同。
例 4 ：減肥相關基因表現量測試
4.1 材料、儀器及溶液配置
實驗細胞：採用小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），OP9細胞購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC®）之OP9細胞株（ATCC CRL-2749）。
培養基：含有20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、1%抗生素-抗黴菌素(Antibiotic-Antimycotic)（Gibco公司，編號15240-062）的α-最低限度必需培養基（α-Minimum essential medium，簡稱α-MEM）（Gibco公司，編號12000-022）。
試劑：RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。
反轉錄酶：採用SuperScript® III Reverse Transcriptase品牌Invitrogen公司，美國，編號18080-051。
檢測儀器：ABI StepOnePlus TM即時PCR系統（Real-Time PCR system，購自Thermo Fisher Scientific公司，美國）。
4.2. 測試流程
首先，取1.5x10 5個小鼠骨髓基質細胞至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時；將每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞依據下列測試條件分為空白組、對照組以及實驗組來處理每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞。
其中，空白組不添加任何測試樣本，並以前述例1所得的對照樣本A為對照組樣本及李子萃取物樣本一為實驗組樣本。於此，對照組及實驗組的培養基內的測試樣本濃度為0.025mg/mL。
將控制組及實驗組在37℃下培養24小時後，以細胞裂解液分別打破細胞膜以形成細胞溶液。
接著，使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。接著，每組取1000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由反轉錄酶以表一中之引子黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。後續利用即時PCR系統，以及qPCR試劑組將二組反轉錄後產物分別以表一之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察各組細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應1秒，60°C反應20秒，總共40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量各基因的mRNA表現量，進而推斷各基因編碼的蛋白質的表現量。
表一(F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer)
基因 編號 引子名稱 序列（5’→3’） 引子 長度
LIPE 1 LIPE -F TGGCACACCATTTTGACCTG 20
2 LIPE -R TTGCGGTTAGAAGCCACATAG 21
如圖5所示，圖5中顯示是以相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。
其中，圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上相對於空白組的差異越顯著。
其中，圖式中「#」代表p值小於0.05，「##」代表p值小於0.01，以及「###」代表p值小於0.001。當「#」越多時，代表統計上相對於對照組的差異越顯著。
4.3. 測試結果
請參閱圖5。將空白組的LIPE基因的表現量視為1（即100%）時，對照組相對於空白組的LIPE基因的表現量為11.1（即111%），實驗組相對於空白組的LIPE基因的表現量為17.1（即171%），代表實驗組的LIPE基因的表現量為空白組的17倍以上。
並且，在統計學t檢驗的計算下，實驗組和對照組相對於空白組都具有顯著差異，而且實驗組相對於對照組也具有顯著差異。
意即，不論是李子萃取物或是熟成的紅色李子的萃取物皆有促進LIPE基因表現量的顯著效果，而且李子萃取物的功效顯著大於熟成的紅色李子的萃取物的功效。
例 5 ：細胞脂質油滴堆積測試
脂肪細胞內以油滴（Lipid droplet）的形式貯存脂肪。基此，本次試驗分析染色後的油滴，以觀察細胞內油滴的數量，藉以確認脂肪堆積的狀態。後續，再將染劑溶出並分析以作為量化的數值指標。
5.1. 材料或溶液配置：
實驗細胞：採用小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），OP9細胞購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC®）之OP9細胞株（ATCC CRL-2749）。
培養基：為MEMAM（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，產品編號Cat. 12000-022）細胞培養液加入20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號Cat.10437-028）及0.1%之青黴素/鏈黴素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，產品編號Cat.15240-062）。
5.2. 測試流程
首先，取24孔培養盤將每孔接種8×10 4個OP9細胞及500μL培養基在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後，以顯微鏡（ZEISS；放大倍率400x）觀察細胞內油滴形成，藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。將分化完成的脂肪細胞分為五組：空白組、對照組一、對照組二、實驗組一與實驗組二。
實驗組一：將本案例1之方式製備而成的李子萃取物樣本一依照濃度為0.25mg/mL添加至分化完成後的細胞中，然後在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基及樣本。
實驗組二：將本案例1之方式製備而成的李子萃取物樣本一依照濃度為0.125mg/mL添加至分化完成後的細胞中，然後在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基及樣本。
對照組一：將本案例1之方式製備而成的對照樣本A依照濃度為0.25mg/mL添加至分化完成後的細胞中，然後在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基及樣本。
對照組二：將本案例1之方式製備而成的對照樣本A依照濃度為0.125mg/mL添加至分化完成後的細胞中，然後在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基及樣本。
空白組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含分化後的脂肪細胞的分化培養基中，在37℃下培養7天。此7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
接下來，依據下列步驟進行油紅O的染色。於7天細胞處理後，將培養基移除，以1mL之磷酸鹽緩衝溶液（Phosphate buffered saline, PBS）清洗脂肪細胞兩次，再加入1mL之10%甲醛並於室溫下反應30分鐘以固定脂肪細胞。接著移除甲醛後以1mL之PBS輕輕地清洗脂肪細胞兩次，接著於每孔細胞內加入1mL之60%異丙醇，反應1分鐘後，移除異丙醇並加入1mL之油紅O作用溶液與脂肪細胞反應，於室溫下反應1小時，接著移除與脂肪細胞作用的油紅O作用溶液並迅速地以1mL之60%異丙醇進將脂肪細胞行脫色5秒鐘，其中，將空白組、對照組二及實驗組二使用顯微鏡觀察並拍攝細胞，如圖6所示。
後續，將染色後的各組再依下列步驟進行油紅O的定量。加入100%異丙醇於染色之細胞中，並置於振盪器上反應10分鐘以溶解油滴，接著取100μL至96孔培養盤中，以測量ELISA讀取儀（BioTek）讀取各組之OD510nm讀值。其中，利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖7所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
5.3. 測試結果
請參閱圖6。對照組二經由熟成的紅色李子的萃取物的處理之後可見油滴數量明顯少於空白組。而實驗組二經由本案李子萃取物的處理之後可見油滴數量顯著更少於空白組及對照組。換言之，成熟的脂肪細胞經由李子萃取物的作用可以非常有效降低脂肪細胞內所堆積的油脂。
請參閱圖7。以空白組的脂質油滴堆積量為1的情況下，則實驗組一的相對脂質油滴堆積量為0.78，也就是相對於空白組，在李子萃取物濃度為0.25mg/mL的情況下，可以減少22%的脂肪堆積。實驗組二的相對脂質油滴堆積量只有0.76，也就是相對於空白組，在李子萃取物濃度為0.125mg/mL的情況下，可以減少24%的脂肪堆積。對照組一的相對脂質油滴堆積量為0.63，也就是相對於空白組，在成熟李子萃取物濃度為0.25mg/mL的情況下，可以減少37%的脂肪堆積。對照組二的相對脂質油滴堆積量為0.82，也就是相對於空白組，在成熟李子萃取物濃度為0.125mg/mL的情況下，可以減少18%的脂肪堆積。由此可知，李子萃取物能有效地抑制脂肪累積，具有減少受體的脂肪形成的功能，進而達成減肥之功能。
例 6 ：丙酮酸生成速率測試
於此，透過代謝最終產物丙酮酸(Pyruvate)量以判斷小鼠肌母細胞C2C12以李子萃取物處理後的基礎代謝率變化。
6.1.材料與儀器
實驗用細胞：小鼠肌母細胞C2C12，取自生物資源保存及研究中心BCRC；Cat. 60083。
培養基：將Dulbecco改良培養基（Dulbecco’s ModifiedEagle’sMedium，DMEM，購自Gibco，12100-046）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）及1% 抗生素 (購自Gibco，Cat. 15240-062)。
實驗用溶液：磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液，購自Gibco，產品編號10437-028）、馬血清（購自Gibco，產品編號Cat.16050-122）、10X DPBS（購自Gibco，產品編號Cat.14200-075）、台盼藍死細胞染色劑（購自Lonza，產品編號Cat.17-942E）、胰蛋白酶（Trypsin-EDTA：10X Trypsin-EDTA，購自SIGMA，產品編號Cat.59427C，以1X PBS溶液稀釋10倍）、Bradford protein assay reagent（購自Bio-Rad，產品編號Cat.500-0006）、Pyruvate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit（購自BioVision，產品編號Cat. K609）。
6.2. 測試流程
首先，將小鼠肌母細胞C2C12以每孔1×10 6個的方式，接種於每孔含2ml培養基之6孔培養盤中。將培養盤置於5％CO 2、37℃下，培養至八成滿。並更換培養液為分化培養液(DMEM)，誘導細胞分化為肌小管。
將分化完成的細胞分為三組：空白組、對照組與實驗組。
實驗組：將本案例1之方式製備而成的李子萃取物樣本一依照濃度為0.03125mg/mL添加至分化完成後的細胞中，然後在37℃下培養48小時。
對照組：將本案例1之方式製備而成的對照樣本A依照濃度為0.03125mg/mL添加至分化完成後的細胞中，然後在37℃下培養48小時。
空白組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含分化後的脂肪細胞的分化培養基中，在37℃下培養小時。
接下來，各組以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次，再以100 μL/well Pyruvate Assay Buffer裂解細胞，再以10,000g於4℃離心10分鐘，並收集上清液。
同時製作比色法所需之標準曲線：將丙酮酸標準品濃度稀釋至1 nmol /μL，以每孔50μL體積製備濃度0、2、4、6、8、10 nmol/孔的標準曲線。
再將各組待測樣本加入50μL反應混合物(來自Pyruvate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit)置於室溫反應30分鐘。反應後進行Pyruvate含量之測定(測定570nm的吸光值)。
6.3. 實驗結果
參閱圖8可知，實驗組之C2C12細胞的丙酮酸生成有顯著提升，其提升約10%，顯示本發明的李子萃取物可有效提升細胞之基礎代謝率，而基礎代謝率增加意味著肌肉細胞生成率提升，且脂肪細胞堆積降低，以致細胞提升糖解作用的效率。
糖解作用（glycolysis）是將葡萄糖轉化成丙酮酸（CH3COCOO-+ H+）的代謝途徑，在這個過程中所釋放的自由能被用於形成高能量化合物ATP和NADH，細胞中之丙酮酸生成量提升意味著糖解作用之效率上升，使細胞更有效率的產生能量，同時造成基礎代謝率上升，故李子萃取物可有效提升糖解作用的效率，其有益於預防及改善代謝不佳的相關症狀。
例7：人體測試
7.1.樣品：採用例1所製備的李子萃取物樣本二。
7.2.受試者：8位受試者。其中，各受試者為具有便秘困擾或體脂大於30%者。意即，本次測試挑選新陳代謝率較差的受試者。
7.3.測試項目：體重變化、腰圍變化及腸胃道狀態問卷調查。
7.4.測試方式：
令8位受試者每日攝取2克的李子萃取物二，並攝入2周。於飲用前（即第0周，又稱對照組）及飲用2周後（即第2周，又稱為實驗組）分別進行量測和問卷調查。
其中，以體重機量測受試都的體重（kg）。
其中，利用皮尺分別量測受試者的腰圍（cm）。
其中，分別於第0周及第2周由受試者填寫腸胃道狀態問卷，問卷中對於腸胃道相關的各種狀況進行調查，其調查及計分方式如下表二。調查各受試者依據服用李子萃取物前以及服用李子萃取物後的2周間的實際情況，分別判斷是否有下列症狀發生。其中，1分是指完全不同意，2分是指不同意，3分是指部分不同意，4分是指尚可，5分是指部分同意，6分是指同意，7分是指完全同意。
表二
症狀/是否發生 1 2 3 4 5 6 7
第1題. 整體腸胃道不適              
第2題. 上腹部飽脹感              
第3題. 噁心感              
第4題. 反胃              
第5題. 腸道蠕動次數              
第6題. 排便省力              
第7題. 糞質變軟              
下面圖式中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」是指其p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01。當「*」越多時，代表統計上相對於空白組的差異越顯著。
7.5.測試結果：
請參閱圖9。經過2周的每日攝入2克李子萃取物後，8位受試者的平均體重從64.3kg（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至63.9kg（第2周）。使用本發明之李子萃取物僅2周，其前後的平均體重差異達0.4kg。意即，每日攝入2克李子萃取物可以有效降低體重，提升新陳代謝。
請參閱圖10。經過2周的每日攝入2克李子萃取物後，8位受試者的平均腰圍從78.9cm（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至78.6cm（第2周）。可知，使用本發明之李子萃取物僅2周，其前後的平均腰圍差異達0.3cm。意即，每日攝入2克李子萃取物可以有效降低腰圍，減少腹部脂肪堆積，提升新陳代謝。
參考圖11。其中，對於第1題所述整體腸胃道不適的情況，受試者對於表二中全部題目所評分數的總和之平均(意即除以7)由25.4分降到13.5分，意即受試者自評已回到並無不適的情況。每日攝入2克李子萃取物可以有效降改善整體腸胃不適的情況，並且改善率達到46.9%。
參考圖12。其中，對於第2題所述上腹部飽脹感情況，受試者所評分數的總和由35分降到15分。
參考圖13。其中，對於第3題所述噁心感的情況，受試者所評分數的總和由34分降到20分。
參考圖14。其中，對於第4題所述反胃的情況，受試者所評分數的總和由25分降到10分。
參考圖15。其中，對於第5題所述腸道蠕動變快的情況，受試者所評分數的總和由37.5分提升到62.5分。
參考圖16。其中，對於第6題所述排便省力的情況，受試者所評分數的總和由25分提升到75分。
參考圖17。其中，對於第7題所述糞質變軟的情況，受試者所評分數的總和由12.5分提升到87.5分。
由上述可知，各題目的平均分數都有改善，意即各受試者平均而言，對於上述症狀都有明顯的改善。整體新陳代謝低落、腸胃不適的感受度下降，受試者均能明顯感受到其身體機能的提升。
由此可知，長期使用李子萃取物可降低體重、減少腰圍、避免上腹部飽脹感、減少噁心感或反胃、增加腸道蠕動次數、使排便更省力、糞質變軟，減少整體腸胃道不適等，即李子萃取物具明顯的提升身體消化機能之功效。
綜上所述，根據任一實施例的李子萃取物，其可以提升身體機能。根據任一實施例的李子萃取物，其可以提升減脂相關基因表現量，藉由提升LIPE基因表現量達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其可以抑制細胞內脂肪油滴堆積，藉由抑制細胞內脂肪油滴堆積達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其可以提升新陳代謝效率，藉由提升丙酮酸生成效率達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其藉由減少體重及/或減少腰圍達到提升身體機能的用途。根據任一實施例的李子萃取物，其藉由改善腸胃道機能達到提升身體機能的用途。並且，根據任一實施例的李子萃取物，在每日服用李子萃取物2克的情況下即能有效達到提升身體機能的用途。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是本發明實施例的李子萃取物與熟成李提取物的總黃酮含量比較圖。 圖2是本發明實施例的李子萃取物與熟成李提取物的丹寧含量比較圖。 圖3是本發明實施例的李子萃取物與其他品種青果提取物的總黃酮含量比較圖。 圖4是本發明實施例的李子萃取物與其他品種青果提取物的丹寧含量比較圖。 圖5是本發明實施例的李子萃取物的LIPE基因表現量測試結果圖。 圖6是本發明實施例的李子萃取物與熟成李提取物對於脂肪細胞內脂肪油滴堆積測試油滴分佈狀態圖。 圖7是本發明實施例的李子萃取物與熟成李提取物對於脂肪細胞內脂肪油滴堆積測試結果比較圖。 圖8是本發明實施例的李子萃取物與熟成李提取物對於丙酮酸生成速率測試結果比較圖。 圖9是人體實驗體重變化結果圖。 圖10是人體實驗腰圍變化結果圖。 圖11是人體實驗問卷調查整體腸胃道不適改善結果圖。 圖12是人體實驗問卷調查上腹部飽脹感改善結果圖。 圖13是人體實驗問卷調查噁心感改善結果圖。 圖14是人體實驗問卷調查反胃改善結果圖。 圖15是人體實驗問卷調查腸道蠕動次數結果圖。 圖16是人體實驗問卷調查排便省力結果圖。 圖17是人體實驗問卷調查糞質變軟結果圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (10)

  1. 一種李子萃取物的用途，其是用於製備提升身體機能的組合物，且該李子萃取物提取自開花後2~3個月內未熟成的青色的李子。
  2. 如請求項1所述的用途，其中該提升身體機能為提升減脂相關基因表現量，其中該減脂相關基因是LIPE基因。
  3. 如請求項2所述的用途，其中該提升身體機能為抑制細胞內脂肪油滴堆積。
  4. 如請求項2所述的用途，其中該提升身體機能為提升新陳代謝效率。
  5. 如請求項4所述的用途，其中該提升新陳代謝效率是提升丙酮酸生成效率。
  6. 如請求項2所述的用途，其中該提升身體機能為減少體重及/或減少腰圍。
  7. 如請求項1所述的用途，其中該提升身體機能為改善腸胃道機能。
  8. 如請求項7所述的用途，其中該改善腸胃道機能為改善腹脹、噁心、反胃等症狀其中之一。
  9. 如請求項7所述的用途，其中該改善腸胃道機能為提升腸道蠕動、改善便秘、糞質軟化等症狀其中之一。
  10. 如請求項6至9中任一項所述的用途，其中該組合物為一食品組合物，且該組合物內至少包含該李子萃取物2克/日。
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