CN110051572B

CN110051572B - 石榴发酵物及其用途

Info

Publication number: CN110051572B
Application number: CN201811145760.6A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 庄伟秀
Original assignee: BAIYUETE BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) CO LTD
Current assignee: Baiyuet Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2038-09-27
Also published as: TWI693899B; TW202002809A; CN110051572A

Abstract

本发明涉及植物提取物，特别涉及石榴发酵物及其用途。本发明提供一种石榴发酵物及其用于调控MMP基因、TIMP基因、及COL4A4基因的表现量、促进胶原蛋白产生及抗老化的用途。

Description

石榴发酵物及其用途

技术领域

本发明是有关于一种石榴(Punica granatum)发酵物及其用于调控MMP基因、TIMP基因、及COL4A4基因的表现量、促进胶原蛋白产生及抗老化的用途。

背景技术

皮肤组织是由表皮、真皮及皮下组织所构成，其中真皮含有大量胶原蛋白及玻尿酸，而与皮肤的保水性及弹力息息相关。人类皮肤会随着年纪、生理因素或环境因素，而有老化、肤质粗糙或产生皱纹等现象，如正常年轻人的皮肤都具一定的弹性和张力，当表情肌松弛后，皮肤会很快复原，使皱纹消失；但进入中年后，皮肤开始明显老化，皮肤变薄、变硬、干燥、张力降低；真皮胶原蛋白减少、弹力纤维变性、断裂，使皮肤的张力和弹性降低，因此，当表情肌松弛后，皮肤不能很快复原，久之则使皱纹成形；且随年龄的增大，皮肤和皮下组织更加松弛，加上面部支持组织的萎缩或缺失，以及肌肉的松软，皮肤会在重力的作用下发生滑坠，形成更深的皱纹。而肌肤粗糙是由于干燥、紫外线、清洁剂或化学物质等刺激性物质等外在重要因素，或激素平衡的紊乱等内在重要因素而产生的肌肤困扰，并伴随角质层屏障功能的下降、角质层水分量的下降、表皮代谢回转的亢进、鳞屑的产生而角质粗糙化等现象。因此皮肤上的细胞若失去弹性及保湿功能，会引起皮肤褶皱、干燥及失去光泽等现象。

目前常见用来解决皮肤问题的方式大多为利用涂抹于皮肤表面的医药品、保养品，或口服具有抗老化效用的健康食品。然而，习知的医药品、保养品及健康食品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，且这些产品往往价格昂贵，并非为一般使用者所能负担。

为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有促进胶原蛋白产生及抗老化的功效的新颖医药品、保养品或食品产品以造福有此需求的广大族群。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的为提供一种石榴发酵物，是藉由一包含下列步骤的方法而制得：(a)以水萃取一石榴而得到一石榴萃取物；以及(b)将石榴萃取物与啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)依序进行发酵而获得一第一石榴发酵物；其中啤酒酵母菌的浓度介于0.01～0.5％，胚芽乳酸杆菌的浓度介于0.01～0.25％。

在本发明的一实施例中，酿酒酵母菌的发酵时间为1至2天，及胚芽乳酸杆菌的发酵时间为1至3天。

在本发明的一实施例中，在步骤(b)中，第一石榴发酵物进一步与醋酸菌(Acetobacter aceti)进行发酵，而获得一第二石榴发酵物。

在本发明的一实施例中，醋酸菌的浓度介于1～20％。

在本发明的一实施例中，醋酸菌的发酵时间为14至21天。

在本发明的一实施例中，萃取的温度介于50℃至100℃，及萃取的时间介于0.5至3小时。

本发明的另一目的为提供一种石榴发酵物用于制备一调控基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)基因、基质金属蛋白酶的组织抑制因子(tissueinhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP)基因、及第IV型胶原蛋白α4链(collagentype IV alpha 4 chain，COL4A4)基因的表现量的组合物的用途。

在本发明的一实施例中，组合物是呈医药品、食品或保养品的形式。

在本发明的一实施例中，MMP基因是MMP2基因。

在本发明的一实施例中，TIMP基因是TIMP1基因。

本发明的另一目的为提供一种石榴发酵物用于制备一促进胶原蛋白产生及抗老化的组合物的用途，其中组合物是呈医药品、食品或保养品的形式。

在本发明的一实施例中，组合物是呈保养品的形式时，石榴发酵物是第一石榴发酵物。

在本发明的一实施例中，组合物是呈食品的形式时，石榴发酵物是第二石榴发酵物。

综上所述，本发明石榴发酵物的功效在于：可调控MMP基因、TIMP基因及COL4A4基因的表现量，并藉由微生物发酵制程让石榴总多酚释出，增加抗氧化与美肌保养作用、促进胶原蛋白产生、降低色素生成与累积、提升肌肤紧致，达到抗老化及抚平皱纹的功效。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明石榴发酵物的总多酚含量检测的数据图；

图2是本发明石榴发酵物的抗糖化活性分析的数据图；

图3是本发明石榴发酵物在抵抗及防御UVA能力上的功效的数据图；

图4是本发明石榴发酵物在抑制黑色素生成上的功效的数据图；

图5是本发明石榴发酵物在抗发炎上的功效的数据图；

图6是本发明石榴发酵物在提升皮肤紧致程度上的功效的数据图；

图7是本发明石榴发酵物在调控MMP2基因表现上的功效的数据图；

图8是本发明石榴发酵物在调控TIMP1基因表现上的功效的数据图；

图9是本发明石榴发酵物在调控COL4A4基因表现上的功效的数据图；

图10是本发明石榴发酵物在抑制人体黑色素生成上的功效的数据图，其中“*”表示与第0周比较，p＜0.05；

图11是本发明石榴发酵物在降低人体红色素生成上的功效的数据图；

图12是本发明石榴发酵物在提升人体肌肤紧实度上的功效的数据图；

图13是本发明石榴发酵物在提升人体胶原蛋白密度上的功效的数据图，其中“*”表示与第0周比较，p＜0.05；及“***”表示与第0周比较，p＜0.001；

图14是本发明石榴发酵物在提升人体胶原蛋白密度上的功效的影像图；

图15是本发明石榴发酵物在提升人体肌肤紧实度上的功效的数据图，其中“*”表示与第0周比较，p＜0.05。

具体实施方式

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，彼此之间的差异以学生t检验(student′s t-test)分析。

依据本发明，石榴(Punica granatum)，英文俗名为Pomegranate，汉语拼音为shiliu，中文别名为安石榴，是千屈菜科(Lythraceae)石榴属(Punica)的落叶灌木；叶对生或近簇生，外观呈矩圆形或倒卵形；花生于枝顶或腋生；浆果近球形，呈红色，有肉质外皮。产区主要分布于伊朗、印度北方的喜马拉雅山脉、中国、美国以及地中海区域等。石榴的主要利用部位为叶、花、果皮以及根。在中国民俗医学上，石榴的果皮被用于治疗鼻衄、中耳炎、创伤出血、月经失调、红崩白带、牙痛、吐血、久泻、久痢、便血、脱肛、滑精、崩漏、带下、虫积腹痛以及疥癣。另外，石榴具有抗病毒(antiviral)、抗细菌(antibacterial)、抗真菌(antifungal)以及抗癌(anticancer)等功效，并且可用于改善心血管健康(cardiovascular health)、预防糖尿病(diabetes)、缓解停经症状(menopausalsymptoms)、改善勃起失能(erectile dysfunction)、治疗阿兹海默症(Alzheimer’sdisease)以及类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)等。

如本文中所使用的，用语「石榴果汁(Punica granatum juice)」意指由包含石榴的果皮(peel)、果肉(pulp)(亦即可食用的部分)以及种籽(seed)的果实所产生的汁液。

如本文中所使用的，用语「石榴水萃取物」意为石榴果汁与水以1∶5～10(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得。

如本文中所使用的，用语「培养(culturing)」以及「培育(cultivation)」可被交换使用。

依据本发明，有关发酵培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

如本文中所使用的，用语「啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」、「胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)」以及「醋酸菌(Acetobacter aceti)」分别意欲涵盖那些为熟习此项技术人士可易于获得的啤酒酵母菌、胚芽乳酸杆菌以及醋酸菌(例如，可购自于国内或国外寄存机构者)，或者利用本技艺中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中所分离纯化出的啤酒酵母菌、胚芽乳酸杆菌以及醋酸菌菌株。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似的物。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservatiVe)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。

依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。

依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum，jelly)以及白凡士林(white petrolatum，)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如卡波普

微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。

依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(externaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

实施例1.石榴发酵物的制备

1.1作为食品产品的石榴发酵物的制备

首先，将石榴果汁与水以1∶5～10(w/w)的比例混合，并在50℃～100℃下分别萃取0.5～3小时，得到石榴的萃取物。将石榴的萃取物冷却至室温供后续三段式发酵使用。三段式发酵是把石榴的萃取物依序接种0.01～0.5％啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BCRC 20271发酵1～2天；0.01～0.25％胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)TCI028(BCRC 910805)发酵1～3天；1～20％醋酸菌(Acetobacter aceti)BCRC 11688(以上菌株皆是购自于台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and DevelopmentInstitute，FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection and ResearchCenter，BCRC))发酵14～21天。之后，于45℃～70℃下减压浓缩，并以200～400网目(mesh)的网筛过滤。接着，添加0.5～1.5％柠檬酸及40～70％异麦芽寡糖调整规格后灭菌，得到作为食品产品的石榴发酵物(即第二石榴发酵物)。

1.2作为保养品的石榴发酵物的制备

首先，将石榴果汁与水以1∶5～10(w/w)的比例混合，并在50℃～100℃下分别萃取0.5～3小时，得到石榴的萃取物。将石榴的萃取物冷却至室温供后续发酵使用。三段式发酵是把石榴的萃取物依序接种0.01～0.5％啤酒酵母菌并发酵1～2天；0.01～0.25％胚芽乳酸杆菌TCI028并发酵1～3天。之后，于45℃～70℃下减压浓缩，并以0.5～20μm孔径的滤袋进行过滤。接着，于90～120℃下灭菌30～120分钟，接而添加0.5～1.5％苯氧乙醇(phenoxyethanol)(作为防腐剂)，得到作为保养品的石榴发酵物(即第一石榴发酵物)。

实施例2.石榴发酵物的总多酚含量检测

首先，制备标准溶液，将10g的没食子酸(gallic acid)溶于水中并添加10mL的体积至量瓶中。接着，分别配制0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL及100μL/mL的标准溶液，接而取100μL的各个标准溶液至具有10mL体积的离心管。之后，添加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)、混合并直立放置3分钟，接而添加400μL的7.5％碳酸钠(sodiμM carbonate)、混合并直立放置30分钟。接着，将200μL的各个反应溶液转移至96-孔盘中，于750nm下测量吸光值。

另外，将实施例1所得到的作为食品产品的石榴发酵物作为实验组，将石榴的萃取物作为比较组。将实验组及比较组分别以水予以稀释并取100mL的体积至微量离心管中。之后，添加500μL的佛萧酚试剂、混合并直立放置3分钟，接而添加400μL的7.5％碳酸钠、混合并直立放置30分钟。接着，将200μL的各组反应溶液转移至96-孔盘中，于750nm下测量吸光值。本实施例的结果显示于图1。

图1是本发明石榴发酵物的总多酚含量检测的数据图。由图1可见，与比较组相较的下，实验组的总多酚含量有显著的提升(提升2.6倍)。本实施例的结果显示，本发明石榴发酵物会大量释出总多酚。

实施例3.石榴发酵物的抗糖化活性(antiglycative activity)分析

首先，将实施例1所得到的作为食品产品的石榴发酵物使用作为实验组，将石榴的萃取物使用作为比较组。分别取0.25mL的经适当稀释的实验组及比较组的样品，接而加入0.25mL的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)[以200mM磷酸钠缓冲液(sodiumphosphate buffer)(pH 7.4)配制含有0.06％NaN₃的60mg/mL BSA]溶液与果糖(fructose)溶液(以200mM磷酸钠缓冲液配制1.5M D-果糖)，均匀混合。之后，取0.1mL的体积于激发光360nm，放射光460nm下测定荧光值，此为反应前的零点。接着，取0.45mL的体积并于50℃下培养24小时，接而取0.1mL的体积测定荧光值，此为反应的终点。对照组以等量样品回溶溶剂代替，以等量的3mM胺胍(aminoguanidine，AG)作为正对照组。抗糖化活性(％)是藉由下列公式(1)计算出：

本实施例的结果显示于图2。图2是本发明石榴发酵物的抗糖化活性分析的数据图。由图2可见，与比较组相较之下，实验组的抗糖化活性有显著的提升(提升35％)。本实施例的结果显示，本发明石榴发酵物具有优异的抗糖化活性。

实施例4.石榴发酵物在抵抗及防御UVA能力上的效用评估

首先，将人类皮肤纤维母细胞(human skin fibroblast)CCD-966Sk(对应于

CRL-1881)培养于最低基本培养基(minimum essential medium)[添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)以及1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)](Gibco)中。于96孔培养盘的每孔中加入200μL的培养基，使每孔具有5x 10³个人类皮肤纤维母细胞。在37℃下培养24小时后，移除培养基。

之后，将人类皮肤纤维母细胞分成4组，其中包括1个实验组、1个比较组、1个UVA组及1个对照组。实验组、比较组及UVA组的细胞是藉由使用紫外线辐射室于15J/cm²下对细胞照射UVA历时1小时，此条件会造成50％致死剂量(lethal dose 50％，LD₅₀)，表示导致50％细胞死亡的辐射照射剂量。接着，将0.5％依据上面实施例1的作为食品产品的石榴发酵物添加至实验组的细胞中，及将0.5％石榴萃取物添加至比较组的细胞中，而UVA组的细胞则不做任何处理。至于对照组的细胞则未照射UVA。

各组细胞培养物在37℃培养箱中进行培养24小时后，于每孔加入15μL的3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯四唑溴化物{3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide}(MTT，4mg/mL，配于PBS)(AMERSCO/0793-5G)并于37℃下予以培养4小时。之后，移除各孔中的培养基，继而于每孔加入50μL的DMSO(ECHO/DA1101-000000-72EC)以分解甲臜结晶(formazan crystal)，接而将培养盘置于振荡器(shaker)上并培育10分钟，然后于570nm的波长下以ELISA读取仪(BioTek)来读取各孔的吸光值(OD₅₇₀)。

细胞可活性(％)是藉由将所测得的吸光值(OD₅₇₀)代入下列公式(2)而计算出：

细胞可活性(％)＝(各组所测得的OD₅₇₀吸光值/对照组所测得的OD₅₇₀吸光值)×100％(2)；

各组之间的统计学显著差异是藉由学生t检验(Student’s t-test)来决定。本实施例的结果显示于图3。

图3是本发明石榴发酵物在抵抗及防御UVA能力上的功效的数据图。由图3可见，与对照组相较之下，UVA组的细胞可活性(％)有降低的情形，这表示对人类皮肤纤维母细胞照射UVA会造成细胞死亡。而与UVA组及比较组相较之下，实验组的细胞可活性(％)有显著的提升(与UVA组比较，实验组的细胞可活性提升12％)。本实施例的结果显示，本发明石榴发酵物具有抵抗及防御UVA损伤的能力。

实施例5.石榴发酵物在抑制黑色素生成(inhibition of melanogenesis)上的效用评估

首先，将老鼠皮肤黑色素瘤细胞株B16F10(对应于ATCC CRL-6475)培养于杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)[添加有1％青霉素/链霉素(Gibco)及10％FBS(Gibco)]中。于6孔培养盘的每孔中加入3mL的培养基，使每孔具有1.5x 10⁵个B16F10细胞。在37℃下培养24小时后，移除培养基。

之后，将B16F10细胞分成3组，其中包括1个实验组、1个比较组以及1个对照组。将0.5％依据上面实施例1的作为食品产品的石榴发酵物(含有3mL的DMEM)添加至实验组的细胞中，及将2％石榴的萃取物(含有3mL的DMEM)添加至比较组的细胞中，而对照组的细胞则被添加DMEM。

各组细胞培养物在37℃下培养48小时后，移除培养基并以1xPBS(Gibco)冲洗两次。之后，加入胰蛋白酶(trypsin)来处理细胞3分钟并将悬浮的细胞收集于15mL体积的离心管中，接而以400xg/5分钟进行旋转(spin)以沉淀细胞。在以1xPBS冲洗两次之后，以200μL的1XPBS再悬浮细胞沉淀物(cell pellet)。接着，将细胞溶液于液态氮中放置10分钟，接而于室温下静置30分钟进行解冻。在解冻完全之后，以12,000xg进行旋转30分钟，接而移除上清液并添加120μL的1N NaOH(配于ddH₂O)。在混合均匀之后，于60℃干浴槽中静置1小时。之后，取100μL的体积至96孔培养盘中并于450nm的波长下以ELISA读取仪来读取各孔的吸光值(OD₄₅₀)。

黑色素含量(％)是藉由将所测得的吸光值(OD₄₅₀)代入下列公式(3)而计算出：

黑色素含量(％)＝(各组所测得的OD₄₅₀吸光值/对照组所测得的OD₄₅₀吸光值)×100％(3)

各组之间的统计学显著差异是藉由史徒登氏t-试验来决定。本实施例的结果显示于图4。

图4是本发明石榴发酵物在抑制黑色素生成上的功效的数据图。由图4可见，与对照组及比较组相较之下，实验组的黑色素含量有显著的降低(与对照组比较，实验组的黑色素含量降低20％)。本实施例的结果显示，本发明石榴发酵物具有抑制黑色素生成的功效。

实施例6.石榴发酵物在抗发炎(anti-inflammation)上的效用评估

首先，将小鼠巨噬细胞RAW 264.7(对应于ATCC TIB-71)培养于90％DMEM，添加有10％FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Gibco)及4mM L-麸酰胺酸(L-glutamine)(Gibco)中。于96孔培养盘的每孔中加入200μL的培养基，使每孔具有2.5x 10⁴个细胞。在37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养24小时后，移除培养基。

之后，将RAW 264.7细胞分成4组，其中包括1个实验组、1个比较组、1个LPS组以及1个对照组。将200ng/mL脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma；SI-L2880-25MG)添加至LPS组、比较组及实验组的细胞中，俾以诱发发炎反应，并将1mg/mL依据上面实施例1的作为食品产品的石榴发酵物添加至实验组的细胞中，及将1％石榴的萃取物添加至比较组的细胞中，而LPS组的细胞不做任何处理，至于对照组的细胞则未添加LPS且不做任何处理。同时，LPS组、实验组及比较组是以不含FBS的培养基来配制，且一个样品进行四重复)。

各组细胞培养物在作用24小时后，从每孔中取出150μL的培养液并置入新的96孔培养盘，接而加入130μL的二次水。之后，使用革利士试剂套组(Griess reagent kit)(Lifetechnologies；1445263)来配制革利士试剂(试剂A及试剂B的比例为1∶1)，取20μL的体积与96孔培养盘中的培养液进行避光反应30分钟。接着，于548nm的波长下以微盘分析仪来读取各孔的吸光值(OD548)。特别地，读取的吸光值越大，表示NO的浓度越高。各组之间的统计学显著差异是藉由史徒登氏t-试验来决定。本实施例的结果显示于图5。

各组细胞培养物在作用24小时后，从每孔中取出150μL的培养液并置入新的96孔培养盘，接而加入130μL的二次水。之后，使用革利士试剂套组(Griess reagent kit)(Lifetechnologies；1445263)来配制革利士试剂(试剂A及试剂B的比例为1∶1)，取20μL的体积与96孔培养盘中的培养液进行避光反应30分钟。接着，于548nm的波长下以微盘分析仪来读取各孔的吸光值(OD₅₄₈)。特别地，读取的吸光值越大，表示NO的浓度越高。各组之间的统计学显著差异是藉由史徒登氏t-试验来决定。本实施例的结果显示于图5。

实施例7.石榴发酵物在提升皮肤紧致程度上的效用评估

首先，将人类皮肤纤维母细胞CCD-966Sk(对应于BCRC编号60153)培养于依格最低基本培养基(Eagle minimum essential medium，EMEM)，配于厄尔平衡盐溶液(Earle’sBalanced Salt Solution，Earle’s BSS)，添加有0.1mM非必需胺基酸、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate)、1mM丙酮酸钠(90％)及10％FBS(Gibco)中。于24孔培养盘的每孔中加入培养基，使每孔每mL培养基具有2x10⁵个细胞。

之后，将人类皮肤纤维母细胞分成3组，其中包括1个实验组、1个比较组及1个对照组。将0.5％依据上面实施例1的作为保养品的石榴发酵物添加至实验组的细胞中，及将0.5％石榴的萃取物添加至比较组的细胞中，而对照组的细胞则不做任何处理。接着，添加0.66体积的充分混合的细胞悬浮液(±实验变量)至无菌试管中，及添加0.33体积的3mg/mL胶原蛋白溶液至细胞悬浮液中。接着，快速添加适当体积的1M NaOH并将溶液上下混合3次，其中将酚红基质指示剂(phenol red media indicator)转为浅粉红色的NaOH的最少量将可产生最坚硬的胶原蛋白凝胶，然后立即将500μL的混合物转移至1.9cm²大小的孔中，以使凝胶于室温下凝固及覆盖20分钟。

之后，添加500μL的培养基(±实验变数)至每个孔中，接而将已成形的凝胶沿着胶体边缘由模型分离，然后藉由将胶体边缘往远离模型方向拉来再悬浮凝胶，并确认凝胶已脱离培养盘。接着，将24孔培养盘重新置放于37℃、潮湿具有5％CO₂的培养箱中。

在预定时间点之时，将24孔培养盘由培养箱中取出用以进行影像获取。接着，将24孔培养盘置于灯箱(light box)的顶部，然后利用数字相机在凝胶上方固定距离处在不同时间点拍照，接而将凝胶重新置于培养箱中。之后，以ImageJ软件来分析影像，追踪每个胶原蛋白凝胶的外观并依据ImageJ软件的操作指引计算出表面积，然后记录每个时间点的表面积作为初始凝胶表面积的百分比。本实施例的结果显示于图6。

图6是本发明石榴发酵物在提升皮肤紧致程度上的功效的数据图。由图6可见，与对照组及比较组相较之下，实验组的胶原蛋白密度(％)有显著的提升(与对照组比较，实验组的胶原蛋白密度提升25％)。本实施例的结果显示，本发明石榴发酵物可藉由提升胶原蛋白密度达到提升皮肤紧致程度的功效。

实施例8.石榴发酵物在调控与皮肤弹性相关的基因表现上的效用评估

在本实施例中，探讨石榴发酵物可否藉由调控与皮肤弹性相关的基因表现来达到提升皮肤弹性的功效。

首先，以添加有10％FBS、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)及1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)的MEM培养基培养人类纤维母细胞CCD-966SK于培养盘，细胞浓度为2×10⁵细胞/孔，接而于37℃进行培养24小时，并移除培养基。

之后，将经培养的细胞分成3组，其中包括1个对照组、1个比较组及1个实验组。将0.25％依据上面实施例1的作为保养品的石榴发酵物添加至实验组的细胞中，及将0.25％石榴的萃取物添加至比较组的细胞中，而对照组的细胞则不做任何处理。接着，收取各组细胞培养物并拿来进行基因表现分析。

在本实施例中，用来分析与皮肤弹性相关的基因包括基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase 2，MMP2)基因、基质金属蛋白酶的组织抑制因子1(tissue inhibitorof matrix metalloproteinase 1，TIMP1)基因、及第IV型胶原蛋白α4链(collagen typeIV alpha 4 chain，COL4A4)基因。

以RNA萃取套组(Geneaid)对上面所得到的各组细胞培养物进行RNA的萃取。对由此所得到的各组RNA取2,000ng并以

III反转录酶(Invitrogen)将萃取出的RNA反转录为cDNA。接着，以cDNA作为模版，并且使用周来扩增目标基因的引子对，包括MMP2、TIMP1、COL4A4及GAPDH(作为内部对照组)，它们的核苷酸序列显示于下表1，在StepOne Plus实时PCR系统(ABI)中利用KAPA CYBR FAST qPCR套组(2x)(KAPABiosystems)来进行定量实时PCR，俾以对目标基因进行扩增及定量。PCR产物的熔化曲线是在定量实时PCR反应期间进行确认。

表1

目标基因的相对表现量是推导自方程式2^-ΔΔCt，并利用GAPDH基因(作为内部对照组)及基准基因的循环阈值及藉由标准偏差来计算相对倍数变化，其中ΔCt＝Ct_{目标基因/基准基因}-Ct_GAPDH，ΔΔCt＝ΔCt_目标基因-ΔCt_基准基因，倍数变化＝2^-ΔΔCt _平均值。以对照组的目标基因表现量作为1的比较基准。各组之间的统计学显著差异是藉由单尾Student’s t-检定来决定。本实施例的结果显示于图7至图9。

图7至图9是本发明石榴发酵物在调控与皮肤弹性相关的基因(包括MMP2基因、TIMP1基因及COL4A4基因)表现上的功效的数据图，其中图7是本发明石榴发酵物在调控MMP2基因表现上的功效的数据图，图8是本发明石榴发酵物在调控TIMP1基因表现上的功效的数据图，及图9是本发明石榴发酵物在调控COL4A4基因表现上的功效的数据图。由图7可见，就MMP2基因而言，与对照组及比较组相较之下，实验组的基因相对表现量有显著的降低(与对照组比较，实验组的基因相对表现量降低42％)，这表示本发明石榴发酵物可藉由抑制MMP2基因的表现量而避免胶原蛋白被分解。由图8可见，就TIMP1基因而言，与对照组及比较组相较之下，实验组的基因相对表现量有显著的提升(与对照组比较，实验组的基因相对表现量提升39％)，这表示本发明石榴发酵物可藉由提升TIMP1基因的表现量而抑制胶原蛋白分解基因活性。由图9可见，就COL4A4基因而言，与对照组及比较组相较之下，实验组的基因相对表现量有显著的提升(与对照组比较，实验组的基因相对表现量提升17倍)，这表示本发明石榴发酵物可藉由提升COL4A4基因的表现量来促进胶原蛋白合成量。本实施例的结果显示，本发明石榴发酵物可藉由调控与皮肤弹性相关的基因表现来达到提升皮肤弹性的功效。

实施例9.作为食品产品的石榴发酵物的人体功效测试

在本实施例中，藉由使用依据实施例1的作为食品产品的石榴发酵物来检测其是否具有改善人体肌肤的功效。

首先，募集8位25～45岁上班族作为受试者，接而请每位受试者每天口服饮用10mL的15～30％作为食品产品的石榴发酵物，测试时间为8周。测试项目包括受试者饮用前后的黑色素含量、红色素含量及肌肤紧实度改善百分比，使用VISIA Complexion分析系统(VISIA Complexion Analysis System)(Canfield scientific，USA)进行检测。本实施例的结果显示于图10至图12。

图10是本发明石榴发酵物在抑制人体黑色素生成上的功效的数据图。图11是本发明石榴发酵物在降低人体红色素生成上的功效的数据图。图12是本发明石榴发酵物在提升人体肌肤紧实度上的功效的数据图。由图10可见，与饮用前(第0周)相较之下，受试者在饮用后第8周所测得的黑色素含量有显著的降低(与第0周比较，受试者在饮用后第8周所测得的黑色素含量降低4.1％)。由图11可见，与饮用前(第0周)相较之下，受试者在饮用后第8周所测得的红色素含量有降低的情形(与第0周比较，受试者在饮用后第8周所测得的红色素含量降低10.3％)。由图12可见，与饮用前(第0周)相较之下，受试者在饮用后第8周所测得的肌肤紧实度改善百分比有提升的情形(与第0周比较，受试者在饮用后第8周所测得的肌肤紧实度改善百分比提升22.2％)。本实施例的结果显示，本发明作为食品产品的石榴发酵物具有改善人体肌肤的功效。

实施例10.作为保养品的石榴发酵物的人体功效测试

在本实施例中，申请人藉由使用依据实施例1的作为保养品的石榴发酵物来检测其是否具有改善人体肌肤的功效。

首先，募集8位受试者，并将每位受试者的左脸使用作为对照组，及将右脸使用作为实验组，其中每日早晚清洁脸部后，将安慰剂涂抹于对照组肌肤，及将5～15％作为保养品的石榴发酵物涂抹于实验组肌肤，以指腹稍加按摩促进吸收，并于使用前(第0周)、使用后第2周与第4周进行检测。检测项目包括胶原蛋白密度、肌肤松弛度及肌肤皱纹，使用VISIA Complexion分析系统(VISIA Complexion Analysis System)(Canfieldscientific，USA)进行检测。本实施例的结果显示于图13至图15。

图13是本发明石榴发酵物在提升人体胶原蛋白密度上的功效的数据图。图14是本发明石榴发酵物在提升人体胶原蛋白密度上的功效的影像图。图15是本发明石榴发酵物在提升人体肌肤紧实度上的功效的数据图。由图13可见，与第0周相较之下，实验组的肌肤胶原蛋白密度会随着时间增加而有显著的提升，对照组则无；与第0周比较，实验组在使用后第2周的肌肤胶原蛋白密度提升11.6％，在使用后第4周的肌肤胶原蛋白密度提升19.6％。由图14可见，与第0周相较之下，实验组的肌肤胶原蛋白密度会随着时间增加而有提升的情形，图14中黑色部分越少表示胶原蛋白密度越高。由图15可见，与第0周相较之下，实验组的肌肤紧实度会随着时间增加而有显著的提升，对照组则无；与第0周比较，实验组在使用后第2周的肌肤紧实度提升11.6％，在使用后第4周的肌肤胶紧实度提升15％。本实施例的结果显示，本发明作为保养品的石榴发酵物具有改善人体肌肤的功效。

综上所述，本发明石榴发酵物可调控MMP基因、TIMP基因及COL4A4基因的表现量，并藉由微生物发酵制程让石榴总多酚释出，增加抗氧化与美肌保养作用、促进胶原蛋白产生、降低色素生成与累积、提升肌肤紧致、改善肌肤暗沉，达到抗老化及抚平皱纹的功效。

以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的申请专利范围中。

Claims

1.一种石榴发酵物，是藉由一包含下列步骤的方法而制得：

(a)以水萃取一石榴而得到一石榴萃取物；以及

(b)将该石榴萃取物与啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)依序进行发酵而获得第一石榴发酵物，以及将该第一石榴发酵物进一步与醋酸菌(Acetobacter aceti)进行发酵，而获得一第二石榴发酵物，其中该石榴发酵物为该第一石榴发酵物或该第二石榴发酵物；

其中该啤酒酵母菌的浓度介于0.01～0.5％，该胚芽乳酸菌的浓度介于0.01～0.25％，该第一石榴发酵物或该第二石榴发酵物提升基质金属蛋白酶的组织抑制因子(tissueinhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP)基因、第IV型膠原蛋白α4链(collagentype IV alpha 4chain,COL4A4)基因及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)基因中的至少一基因的表现量。

2.根据权利要求1所述的石榴发酵物，其特征在于，该啤酒酵母菌的发酵时间为1至2天，及该胚芽乳酸菌的发酵时间为1至3天。

3.根据权利要求1所述的石榴发酵物，其特征在于，该醋酸菌的浓度介于1～20％。

4.根据权利要求3所述的石榴发酵物，其特征在于，该醋酸菌的发酵时间为14至21天。

5.根据权利要求1所述的石榴发酵物，其特征在于，该萃取的温度介于50℃至100℃，及该萃取的时间介于0.5至3小时。

6.根据权利要求1所述的石榴发酵物，其特征在于，该石榴发酵物是呈医药品、食品或保养品的形式。

7.根据权利要求1所述的石榴发酵物，其特征在于，该MMP基因是MMP2基因。

8.根据权利要求1所述的石榴发酵物，其特征在于，所述TIMP基因是TIMP1基因。

9.一种根据权利要求1所述的石榴发酵物用于制备一促进胶原蛋白产生及抗老化的组合物的用途，其特征在于，该组合物是呈医药品、食品或保养品的形式。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，当该组合物是呈保养品的形式时，该石榴发酵物是第一石榴发酵物。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，当该组合物是呈食品的形式时，该石榴发酵物是第二石榴发酵物。