TW202108124A - 香瓜茄發酵汁液用於製備改善肌膚狀況及/或減脂組合物的用途 - Google Patents

香瓜茄發酵汁液用於製備改善肌膚狀況及/或減脂組合物的用途 Download PDF

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Abstract

一種香瓜茄發酵汁液的用途，其用於製備一組合物。此組合物具有下列一種或多種功能：提升穀胱甘肽合成、抑制醣化終產物形成、提升抗老相關基因、抑制黑色素生成、提升保濕相關基因分泌、抑制脂肪累積、促進脂肪分解、減少受體的體脂肪以及改善肌膚狀況。並且，此香瓜茄發酵汁液是由一香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。

Description

香瓜茄發酵汁液用於製備改善肌膚狀況及/或減脂組合物的用途
本發明是關於香瓜茄發酵汁液，特別是關於香瓜茄發酵汁液用於製備改善肌膚狀況及/或減脂組合物的用途。
自有機及天然的飲食概念興起後，生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關產品之研發。為使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。
香瓜茄（Pepino Dulce，學名為Solanum muricatum），又名人參果，是茄科茄屬的多年生草本植物。香瓜茄原產於南美洲地區，近年來成為研究開發的天然植物之一。
在一實施例中，一種香瓜茄發酵汁液的用途，其是用於製備用以提升抗氧化能力的組合物，其中，香瓜茄發酵汁液是由一香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得，香瓜茄培養液包括香瓜茄汁及水，香瓜茄汁與水的比例為1:2-5。相對於香瓜茄培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一實施例中，一種香瓜茄發酵汁液的用途，其是用於製備用於製備用以改善肌膚狀況的組合物。其中，香瓜茄發酵汁液是由一香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。香瓜茄培養液包括香瓜茄汁及水，香瓜茄與水的比例為1:2-5，相對於香瓜茄培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一實施例中，一種香瓜茄發酵汁液的用途，其是用於製備用以減少脂肪的組合物。其中，香瓜茄發酵汁液是由一香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。香瓜茄培養液包括香瓜茄汁及水，且香瓜茄與水的比例為1:2-5。相對於香瓜茄培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液提升抗氧化能力為提升總和抗氧化能力（Total Anti-oxidative Capacity）、降低過氧化產物MDA（Malondialdehyde）、提升穀胱甘肽或其組合。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液改善肌膚狀況為提升肌膚抗老能力、提升抗醣化能力、降低黑色素含量、提升肌膚保濕、減少肌膚紋理、減少肌膚皺紋、減少肌膚泛紅或其組合。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液提升肌膚抗老能力為調控CCT5基因、FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因或UBL5基因。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液提升肌膚保濕為調控HAS2基因或KRT1基因。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液減少脂肪為抑制脂肪累積、促進脂肪分解或其組合。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液是透過發酵程序所製備，其中發酵程序包括添加該酵母菌至該香瓜茄培養液內；將該香瓜茄培養液與該酵母菌進行發酵1日至3日以形成一第一初發酵汁液，其中該酵母菌較佳為Saccharomyces cerevisiae；添加該乳酸菌至該第一初發酵汁液內；將該第一初發酵汁液與該乳酸菌進行發酵1日至5日以形成一第二初發酵汁液，其中該乳酸菌較佳為Streptococcus thermophilus；添加該醋酸菌至該第二初發酵汁液內；將該第二初發酵汁液與該醋酸菌進行發酵3日至10日以形成一第三初發酵汁液，其中該醋酸菌較佳為Acetobacter aceti；以及過濾該第三初發酵汁液所得到。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液的pH值為4.0±1.0，且香瓜茄發酵汁液的糖度為40±2。
在又一實施例中，香瓜茄發酵汁液的多酚含量為88ppm。
綜上所述，根據本發明任一實施例的香瓜茄發酵汁液，其可製備改善肌膚狀況及/或減脂的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：提升穀胱甘肽合成、抑制醣化終產物形成、提升抗老相關基因、抑制黑色素生成、提升保濕相關基因分泌、抑制脂肪累積、促進脂肪分解、減少受體的體脂肪以及改善肌膚狀況。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
關於本文中所使用之濃度符號「%」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。關於本文中所使用之「香瓜茄」通常是指香瓜茄果實。
關於本文中所使用之「香瓜茄培養液」、「香瓜茄水萃液」用語可交互使用，所指皆為香瓜茄汁與水混合均勻後的混合物。
依據本發明，有關微生物發酵反應的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液是由香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。其中，香瓜茄培養液包括香瓜茄及水。在香瓜茄培養液中，香瓜茄與水的比例為1:2-5。在發酵程序中，相對於香瓜茄培養液，此些菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一些實施例中，酵母菌可以是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。在一些實施例中，乳酸菌可以是嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）或植物乳桿菌。在一些實施例中，醋酸菌可以是乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti）。
在一些實施例中，在發酵程序中，先添加0.01%-0.5%的酵母菌至香瓜茄培養液內，並將香瓜茄培養液與酵母菌進行發酵1日至3日以形成第一初發酵汁液。換言之，0.01%-0.5%的酵母菌與香瓜茄培養液混合成的第一混合液進行發酵1日至3日以形成第一初發酵汁液。在一些實施例中，第一混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第一初發酵汁液形成後，再添加0.01%-0.25%乳酸菌至第一初發酵汁液內，並將第一初發酵汁液與乳酸菌進行發酵1日至5日以形成第二初發酵汁液。換言之，0.01%-0.25%乳酸菌與第一初發酵汁液混合成的第二混合液進行發酵1日至5日以形成第二初發酵汁液。在一些實施例中，第二混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第二初發酵汁液形成後，再添加1%-15%的醋酸菌至第二初發酵汁液內，並將第二初發酵汁液與醋酸菌進行發酵3日至10日以形成第三初發酵汁液。換言之，1%-15%的醋酸菌與第二初發酵汁液混合成的第三混合液進行發酵3日至10日以形成第三初發酵汁液。在一些實施例中，第三混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第三初發酵汁液形成後，過濾第三初發酵汁液以得到香瓜茄發酵汁液。在第一示範例中，第三初發酵汁液的過濾步驟包括以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第三初發酵汁液。在第二示範例中，第三初發酵汁液的過濾步驟包括在40℃至70℃下減壓濃縮及以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第三初發酵汁液。在第三示範例中，第三初發酵汁液的過濾步驟包括在40℃至70℃下減壓濃縮及以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第三初發酵汁液以得到一發酵原液，以及調整發酵原液的糖度（Degrees Brix）以形成香瓜茄發酵汁液。
在一些實施例中，可透過添加55%-70%的賦形劑（excipient）來調整發酵原液的糖度。在一些實施例中，用以調整糖度的賦形劑可為異麥芽寡糖。
在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液的pH值為3.7±1.0，且香瓜茄發酵汁液的糖度為40±2。
在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液的多酚含量為88ppm。
香瓜茄培養液是由香瓜茄汁與水以1：2-5的比例混合以得到。在第一示範例中，香瓜茄培養液是由選自於南美洲來源之香瓜茄果汁與水以1：2-5的比例混合以得到。在第二示範例中，香瓜茄培養液是由選自於祕魯Agro international business a&c sac公司之香瓜茄果汁與水以1：2-5的比例混合，再添加葡萄糖溶液將糖度調整為9以得到。在第三示範例中，香瓜茄培養液是由選自於祕魯Agro international business a&c sac公司之香瓜茄果汁與水以1：5的比例混合，再添加葡萄糖溶液將糖度調整為9以得到。
在一些實施例中，原料混合液的滅菌程序可為將原料混合液在80℃至100℃下滅菌0.2小時至1小時，並將滅菌後的原料混合液冷卻至室溫（即25℃至30℃）以形成香瓜茄培養液。在一些實施例中，滅菌後的原料混合液可採取自然降溫的方式冷卻至室溫。
在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液具有改善肌膚狀況及/或減脂之作用。在一些示範例中，改善受體的肌膚狀況可為提升肌膚抗老能力、提升抗醣化能力、降低黑色素含量、提升肌膚保濕、減少肌膚紋理、減少肌膚皺紋、減少肌膚泛紅或其組合。在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液能透過下列一種或多種細胞層面的作用來達成改善肌膚狀況及/或減脂之作用：提升穀胱甘肽合成、抑制醣化終產物形成、提升抗老相關基因、抑制黑色素生成、提升保濕相關基因分泌、抑制脂肪累積、促進脂肪分解、減少受體的體脂肪以及改善肌膚狀況。其中，受體可為人。
在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液能用於製備用以提升抗氧化能力的組合物，其中提升抗氧化能力可為提升總和抗氧化能力（Total Anti-oxidative Capacity）、降低過氧化產物MDA（Malondialdehyde）、提升穀胱甘肽或其組合。
在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液能用於製備用以改善肌膚狀況的組合物，其中改善肌膚狀況可為提升肌膚抗老能力、提升抗醣化能力、降低黑色素含量、提升肌膚保濕、減少肌膚紋理、減少肌膚皺紋、減少肌膚泛紅或其組合，其中提升肌膚抗老能力為調控CCT5基因、FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因或UBL5基因其中至少一項且提升肌膚保濕為調控HAS2基因或KRT1基因其中至少一項。
在一些實施例中，香瓜茄發酵汁液能用於製備用以減少脂肪的組合物，其中減少脂肪為抑制脂肪累積、促進脂肪分解或其組合。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的香瓜茄發酵汁液。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服地、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）、或含有醇的水性溶液（alcohol containing aqueous solution ）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的香瓜茄發酵汁液。在一些實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）或膳食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，前述之食用組合物可以口服方式施予受體。其中，食用組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的香瓜茄發酵汁液。
在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
實施例一：香瓜茄發酵汁液的製備
首先，將採購自秘魯，Agro international business a&c sac公司的香瓜茄汁（產品名Pepino Dulce, Nature Pulp，香瓜茄原產地為祕魯安地斯山脈）與水以1:5（即，香瓜茄汁為一倍重量，水為五倍重量）的比例混合均勻，再添加葡萄糖溶液將糖度調整為9.0，得到香瓜茄培養液。但本發明對於香瓜茄汁的來源並不限制，例如產地為南美洲之供應商為Peruvian Nature公司或Naike公司所提供的香瓜茄汁。
接著，於香瓜茄培養液中殖入0.1%啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC），寄存編號BCRC20271）並在約30℃下發酵1天，以得到第一初發酵汁液。接著，於第一初發酵汁液中殖入0.05%嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（購自BCRC，寄存編號BCRC910636）並在約30℃下發酵1天，以得到第二初發酵汁液。最後，於第二初發酵汁液中殖入10%乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti）（購自BCRC，寄存編號BCRC11688）並在約30℃下發酵5天，以得到第三初發酵汁液。
再將第三初發酵汁液在約60℃下進行減壓濃縮並以目數200的網孔的濾網過濾，以得到發酵原液。最後，添加60%異麥芽寡糖至發酵原液後在約100℃下滅菌2小時，以得到香瓜茄發酵汁液。
於此，分別對香瓜茄培養液、發酵原液以及香瓜茄發酵汁液進行糖度檢測。其中，香瓜茄原料混合液的糖度約為9.0，發酵原液的糖度約為4.0，以及香瓜茄發酵汁液的糖度約為40。
實施例二：香瓜茄水萃液（無發酵）的製備
將採購自秘魯，Agro international business a&c sac公司（產品名Pepino Dulce, Nature Pulp，香瓜茄原產地為祕魯安地斯山脈）的香瓜茄汁與水以1:5的比例混合均勻，再添加葡萄糖溶液將糖度調整為9，得到香瓜茄水萃液，其pH值為6.3。
實施例三：總多酚含量測試
秤取10.0mg的沒食子酸（Gallic acid）置於10mL容量瓶中，然後以水（H2 O）定量至10mL，以得到沒食子酸的儲備溶液（stock solution）。將沒食子酸的儲備溶液稀釋10倍，即100μL沒食子酸的儲備溶液加900μL的水，以得到100μg/mL沒食子酸的初始溶液（即含1000ppm的沒食子酸）。然後，依據下表一配置0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、及100μg/mL之沒食子酸的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至玻璃試管中。加入500μL之福林酚試劑（Folin-Ciocalteu's phenol reagent，購自Merck）至各玻璃試管內與標準溶液混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到標準反應溶液。取200μL之標準反應溶液至96孔板中，並測量其在750nm下之吸光值，以獲得標準曲線。
表一
標準溶液（μg/mL） 0 20 40 60 80 100
初始溶液（μL） 0 20 40 60 80 100
水（μL） 100 80 60 40 20 0
將實驗組的測試樣品（即實施例一的香瓜茄發酵汁液）及對照組的測試樣品（即實施例二的香瓜茄水萃液）分別以水稀釋10倍。將各樣本取100mL到玻璃試管中。接著，加入500μL之福林酚試劑至玻璃試管中與樣本混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到待測反應溶液。將裝有待測反應溶液的玻璃試管進行震盪以確保無氣泡後，取200μL之待測反應溶液至96孔板中，並測量待測反應溶液於750nm下之吸光值。
接著，各樣本對應的待測反應溶液的吸光值先除以樣本的糖度，再利用標準曲線以內插法換算成總多酚含量。於此，可得到香瓜茄水萃液的總多酚含量為27ppm及香瓜茄發酵汁液的總多酚含量為88ppm，如圖1所示。由此可知，香瓜茄透過微生物發酵後，可增加總多酚含量3.2倍。即，相對於香瓜茄水萃液，香瓜茄發酵汁液能提升抗氧化活性。
實施例四：評估細胞抗氧化功效-穀胱甘肽含量檢測 A. 實驗材料 1.  細胞株：人類周邊血單核球細胞（human peripheral blood mononuclear cell，hPBMC）。 2.  培養基：X-VIVO10培養基（購自Lonza，型號04-380Q） 3.  GSH檢測試劑（購自abcam，型號Ab112132）。 4.  香瓜茄水萃液：此實驗中所使用的香瓜茄水萃液是透過如上實施例二所獲得。 5.  香瓜茄發酵汁液：此實驗中所使用的香瓜茄水萃液是透過如上實施例一所獲得。 B. 實驗步驟 1.於6孔培養盤中，每孔培養基中植入2x106 個人類周邊血單核球細胞（於後方步驟中將略稱為細胞）。 2.於37℃培養24小時。 3.將細胞分為三組：空白組、實驗組A、實驗組B。第一組為空白組（Mock）；第二組（實驗組A）則加入香瓜茄水萃液，使加入香瓜茄發酵汁液後，整體溶液中的香瓜茄發酵汁液濃度為0.0625%；第三組（實驗組B）則加入香瓜茄發酵汁液，使加入香瓜茄發酵汁液後，整體溶液中的香瓜茄發酵汁液濃度為0.0625%；接著將N三組細胞於37℃培養24小時。 4.收集細胞。 5.用磷酸鹽緩衝生理鹽水（Phosphate-Buffered Saline，PBS）（購自Gibco）沖洗一次。 6.重懸浮細胞（Resuspend cells）於1毫升的PBS。 7.以GSH試劑（1：1000）將細胞染色15分鐘。 8.用PBS沖洗一次。 9.重懸浮細胞（Resuspend cells）於200微升的PBS。 10.通過流式細胞儀（購自BD Accuri，型號C6 Plus）分析相對的螢光異硫氰酸鹽（FITC）訊號。 11.偵測出之數值以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定分析數值間的統計顯著性，其結果如圖1所示。其中，相較於空白組，***表示p ＜0.001。
由圖2結果可知，有加入香瓜茄水萃液的第二組（實驗組A）細胞，GSH含量並無提升，反而相較於空白組降低7.41%；加入香瓜茄發酵汁液的第三組（實驗組B）細胞，GSH含量則是相較於空白組明顯提升8.34%，使其相對GSH含量（relative GSH content）為第一組（空白組）細胞的1.08倍，並為第二組（實驗組）細胞的1.17倍。GSH是由麩胺酸、胱胺酸和甘胺酸所組成的三胜肽，其硫醇基（-SH）與氧化還原相關，主要功能為細胞內生性抗氧化的防禦，可以對抗ROS的氧化傷害。因此，由圖1的結果亦可證實，添加本案實施例一而得之香瓜茄發酵汁液，確實可提升細胞中GSH含量，增加細胞內氧化還原的能力，以達到細胞抗氧化的功效。
實施例五：抗醣化測試
以200mM磷酸鈉緩衝液（Sodium phosphate buffer，pH7.4）、疊氮化鈉（Sodium azide，NaN3 ）與牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，品牌：Gibco）配置含有0.06%NaN3 的60mg/mL BSA溶液。
以200mM磷酸鈉緩衝液與D果糖（D-（-）-Fructose，C6 H12 O6 ）配置1.5M D-fructose溶液。
以200mM磷酸鈉緩衝液與氨基胍鹽酸鹽（Aminoguanidine hydrochloride，AG，CH6 N4 •HCl）配置3mM AG溶液。
取0.25mL實施例二中所得到的香瓜茄水萃液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到實驗組A的待測溶液。
取0.25mL實施例一中所得到的香瓜茄發酵汁液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到實驗組B的待測溶液。
取0.25mL之3mM AG溶液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到空白組的待測溶液。
取0.1mL各組別的待測溶液作為各組別的零點溶液。使用螢光分光光度計（Thermo Fisher Scientific‎）對0.1mL各組別的零點溶液以360nm之激發光以及460nm之放射光測定其螢光值，以得到反應前之零點之螢光值。
取0.45mL各組別的待測溶液於50℃下培養24小時，以得到各組別的終點溶液。取0.1mL各組別的終點溶液並使用螢光分光光度計對0.1mL各組別的終點溶液以360nm之激發光以及460nm之放射光測定其螢光值，以得到反應之終點之螢光值。
然後根據下列公式（1）計算各組別的相對醣化終產物（Advanced Glycation End products，AGEs）的形成量（%），以得知其抗醣化活性（Antiglycative activity）。換言之，於此，是將空白組的AGEs形成量視為1（即空白組的相對AGEs形成量為100%）來計算各組別的相對AGEs形成量（%）。
AGEs形成量（％）＝
Figure 02_image001
（1）
其中，Fluorescence sample24hr 代表實驗組的終點之螢光值，Fluorescence sample0hr 代表實驗組的零點之螢光值，Fluorescence control24hr 代表空白組的終點之螢光值，Fluorescence control0hr 代表空白組的零點之螢光值。
參照圖3，相較於空白組，實驗組A（水萃液）並無影響醣化終產物的形成量，而實驗組B（發酵汁液）明顯減少24.24%的醣化終產物的形成量。由此可知，香瓜茄發酵汁液能有效抑制醣化終產物的形成，即具有抗醣化的作用。
實施例六：抗老基因檢測
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類纖維母細胞受經香瓜茄水萃液或香瓜茄發酵汁液處理後，細胞中抗老化相關基因的變化。
舉例來說，皮膚抗老化CCT5基因（Gene ID: 22948）、FOXO基因（Gene ID: 2308）、MRPS5基因（Gene ID: 64969）、Pink1基因（Gene ID: 65018）、Ubl-5基因（Gene ID: 59286）。
其中，CCT5基因為CCT 基因家族中的一員，與成熟細胞恢復年輕狀態的過程有關；Pink1基因與老化粒線體恢復年輕狀態的過程有關；FOXO基因、MRPS5基因、Ubl-5基因皆與粒線體活化的過程有關，粒線體就於同生物體內的發電廠，若粒線體的活性不足，容易引響細胞老化現象。
因此，實施例六中以CCT5基因、FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因、Ubl-5基因作為抗老基因分析標的。
材料與儀器 1.          細胞株（下稱細胞）：人類纖維母細胞（CCD-996SK，來自ATCC）。 2.          培養基：最小必需培養液（Minimum essential medium ）（MEM） （Gibco；型號： 11095080），加入 10% 胎牛血清（FBS） （Gibco；型號：10437-028）、1% 青黴素-鏈黴素 （Gibco；型號： 15140122）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate） （Gibco；型號： 11360-070）、1.5 g/l 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate ）（Sigma；型號： S5761-500G），和 0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acids） （Gibco；Cat. 11140050）。 3.          RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，型號：. FC24015-G） 4.          反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase）（Invitrogen公司，美國，編號18080-051） 5.          測量標的基因引子，其中包含FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因、Ubl-5基因，另包括內部控制組（GAPDH基因）。 6.          KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組（購自Sigma公司，美國，編號38220000000） 7.          ABI StepOnePlusTM 即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。 8.          香瓜茄發酵汁液：此實驗中所使用的香瓜茄發酵汁液是透過如上實施例一所獲得。 9.          香瓜茄水萃液：此實驗中所使用的香瓜茄水萃液是透過如上實施例二所獲得。
首先，將人類纖維母細胞（與此實施例簡稱為細胞）以每孔1×105 個細胞量培養於含有2mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37℃下培養16小時，然後將細胞分為以下三組：實驗組A、實驗組B與空白組。
測試條件
組別 添加成分 細胞實驗濃度 處理時間
空白組 無 無 24小時
實驗組A 香瓜茄水萃液 2.0% 24小時
實驗組B 香瓜茄發酵汁液 2.0% 24小時
詳細來說，實驗組A是將如上實施例所製備的香瓜茄水萃液2.0%濃度的培養基2ml，培養人類纖維母細胞24小時。實驗組B是將如上實施例所製備的香瓜茄發酵汁液2.0%濃度的培養基2ml，培養人類纖維母細胞24小時。
空白組是單純使用2毫升培養液來培養人類纖維母細胞，未再加入其他添加成分，培養人類纖維母細胞24小時，用於做為實驗空白組。
以上實驗組A及實驗組B及空白組，每組進行四重複。
將處理後的人類纖維母細胞（即實驗組A及實驗組B）以及空白組的人類纖維母細胞以細胞裂解液分別破細胞膜以形成三組的細胞溶液。接著，以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）分別萃取三組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克（ng）的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript® III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM 即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表1的引子（SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12）對六組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察三組的人類纖維母細胞內的CCT5基因、FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因、UBL5基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，接著95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量CCT5基因、FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因、UBL5基因的mRNA表現量，進而推斷CCT5基因、FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因、UBL5基因編碼的蛋白質的表現量。
表一
引子名稱 序列編號 序列 長度
CCT5-F SEQ ID NO:1 ATAAATGTGAGGCTGAATC 19
CCT5-R SEQ ID NO:2 ACTTGTCACTTGTGGCAC 18
FOXO-F SEQ ID NO:3 CGGACAAACGGCTCACTCT 19
FOXO-R SEQ ID NO:4 GGACCCGCATGAATCGACTAT 21
MRPS5-F SEQ ID NO:5 GTCCGGACAGTCCCTCAC 18
MRPS5-R SEQ ID NO:6 CCCAATAAATGACCTGCCGTC 21
Pink1-F SEQ ID NO:7 CTGTGGTGGCTAGTGCTCCT 20
Pink1-R SEQ ID NO:8 TCCAGACGTGAGACAGTTGG 20
UBL5-F SEQ ID NO:9 TCCTAGCGTT AACTGCGACC 20
UBL5-R SEQ ID NO:10 CTAGCTGGAG CTCGAATCGC 20
GAPDH-F SEQ ID NO:11 CTGGGCTACACTGAGCACC 19
GAPDH-R SEQ ID NO:12 AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG 21
需要特別說明的是，下文述及之圖式中顯示的各基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
請參閱圖4。將空白組的CCT5基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組A相對於空白組的CCT5基因的表現量為0.22（即22%）、實驗組B相對於空白組的CCT5基因的表現量為1.46（即146%），代表細胞經香瓜茄發酵汁液處理後，CCT5基因的表現量升高，為空白組的1.46倍。
請參閱圖4。將空白組的FOXO基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組A相對於空白組的FOXO基因的表現量為0.25（即25%）、實驗組B相對於空白組的FOXO基因的表現量為1.58（即158%），代表細胞經香瓜茄發酵汁液處理後，FOXO基因的表現量升高，為空白組的1.58倍。
請參閱圖4。將空白組的MRPS5基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組A相對於空白組的MRPS5基因的表現量為0.17（即17%）、實驗組B相對於空白組的MRPS5基因的表現量為1.12（即112%），代表細胞經香瓜茄發酵汁液處理後，MRPS5基因的表現量升高，為空白組的1.12倍。
請參閱圖4。將空白組的Pink1基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組A相對於空白組的Pink1基因的表現量為0.30（即30%）、實驗組B相對於空白組的Pink1基因的表現量為1.35（即135%），代表細胞經香瓜茄發酵汁液處理後，Pink1基因的表現量升高，為空白組的1.35倍。
請參閱圖4。將空白組的UBL5基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組A相對於空白組的UBL5基因的表現量為0.25（即25%）、實驗組B相對於空白組的UBL5基因的表現量為1.48（即148%），代表細胞經香瓜茄發酵汁液處理後，實驗組的UBL5基因的表現量升高，為空白組的1.48倍。
由此可知，當人類纖維母細胞經香瓜茄發酵汁液處理後，細胞內與抗老回春相關的各種基因表現量提高，代表細胞由老化狀態回復到未老化前的狀態，有效的延緩了細胞的老化。
實施例七：黑色素含量檢測
於此，所使用的細胞培養基為添加有1vol%盤尼西林-鏈黴素（penicillin/streptomycin，品牌：Gibco）及10vol%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，品牌：Gibco）之杜貝可氏改良的依格氏培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM，品牌：Gibco）。
首先，以每孔1.5×105 個細胞的細胞數，將小鼠黑色素瘤細胞株B16F10（購自美國典型培養物保存中心（ATCC），編號CRL-6475）接種於含有3mL細胞培養基的6孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養24小時。
在培養24小時後，將B16F10細胞分成3個組別：一個實驗組（即實驗組（香瓜茄發酵汁液組））、一個對照組以及一個空白組。移除各組別的細胞培養基，並更換成每孔3mL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養48小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.03125vol%實施例一中所得到的香瓜茄發酵汁液的細胞培養基。對照組的實驗培養基為含有0.03125vol%麴酸（kojic acid）的細胞培養基（空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含香瓜茄發酵汁液，也不含麴酸）。
於培養48小時後，移除各孔中的實驗培養基並以1倍（1x）的磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco）潤洗二次。於沖洗後，將胰蛋白酶（trypsin）加入至各孔中以處理細胞3分鐘。於3分鐘處理後，將各孔的懸浮的細胞個別收集於15mL離心管中，接而以400xg離心5分鐘以分離細胞沉澱物（cell pellet）與上清液。透過1xPBS再懸浮細胞沉澱物及離心反覆進行二次後，以200μL的1xPBS再懸浮細胞沉澱物，以得到細胞溶液。接著，將細胞溶液於液態氮中放置10分鐘，接而於室溫下靜置30分鐘進行解凍。在解凍完全之後，各離心管以12,000xg離心30分鐘。於30分鐘離心後，移除各離心管中上清液並添加入120μL 1N NaOH（配於ddH2 O）以與各離心管中的沉澱物進行混合。在混合均勻之後，將含有混合溶液的各離心管於60℃乾浴槽中靜置1小時。之後，從各離心管中取100μL混合溶液至96孔培養盤中並於450nm的波長下以ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法）讀取儀（廠牌：BioTek）來讀取96孔培養盤中各孔的吸光值（OD450）。
於量測後，藉由將所測得的吸光值代入下列公式（2）而計算出相對黑色素含量（%）。換言之，於此，是將空白組的黑色素含量視為1（即空白組的相對黑色素含量為100%）來計算各組別的相對黑色素含量（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗（student t-test）來統計分析，如圖5所示。在圖5中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05，「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。
相對黑色素含量（%）＝（OD450 sample/OD450 control）×100%
其中，OD450 sample代表欲換算之組別的吸光值，而OD450 control代表空白組的吸光值。
參照圖5，相較於空白組，實驗組的黑色素含量有顯著地降低，且其可降低24.71%的黑色素生成；對照組的黑色素含量也顯著降低，其降低14.45%的黑色素生成，麴酸是已知的美白成分，由此可知，香瓜茄發酵汁液能有效抑制黑色素生成，即有效地抑制酪胺酸酶形成，具有美白之功效。
實施例八：保濕基因檢測
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類初代皮膚角質細胞受經香瓜茄水萃液或香瓜茄發酵汁液處理後，細胞中保濕相關基因的變化。
舉例來說，保濕基因為Krt1基因（Gene ID:3848）及HAS2基因（Gene ID:3037）
其中，Krt1基因與角蛋白有關，角蛋白為肌膚主要的構型物，緊密排列時具減少水分蒸散之鎖水功效，因此Krt1基因提升能影響肌膚保濕有關；；HAS2基因為玻尿酸合成酶相關基因，與玻尿酸合成有關，HAS2基因提升與玻尿酸含量有關，因此也能影響肌膚水潤和彈性。
因此，實施例八中以Krt1基因及HAS2基因作為分析標的。
材料與儀器 1.          細胞株：細胞株：人類初代皮膚角質細胞（Human primary epidermal keratinocytes）（CELLnTEC公司（瑞士），HPEK-50）。 2.          培養基：Keratinocyte-SFM （1X） （Thermo）。 3.          RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G） 4.          反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase）（Invitrogen公司，美國，編號18080-051） 5.          測量標的基因引子，其中包含Krt1基因及HAS2基因，另包括內部控制組（TBP基因）。 6.          KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組（購自Sigma公司，美國，編號38220000000） 7.          ABI StepOnePlusTM 即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。 8.          香瓜茄發酵汁液：此實驗中所使用的香瓜茄發酵汁液是透過如上實施例1所獲得。 9.          香瓜茄水萃液：此實驗中所使用的香瓜茄水萃液是透過如上實施例2所獲得。
實驗步驟
首先，取1.5x105 個人類初代皮膚角質細胞至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時，將每孔培養後的人類初代皮膚角質細胞依據下列測試條件分為空白組以及實驗組（共二組）來處理每孔培養後的人類初代皮膚角質細胞。
測試條件
組別 添加成分 細胞實驗濃度 處理時間
空白組 無 無 6小時
實驗組 香瓜茄發酵汁液 香瓜茄發酵汁液% 6小時
詳細來說，空白組是單純使用2毫升培養液來培養人類初代皮膚角質細胞，未再加入其他添加成分，培養人類初代皮膚角質細胞6小時，用於做為實驗空白組。
實驗組是將含有如上實施例1所製備的香瓜茄發酵汁液1%濃度的培養基2ml，培養人類初代皮膚角質細胞6小時。
以上空白組及實驗組，每組進行四重複。
將處理後的人類初代皮膚角質細胞（即空白組及實驗組）以細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。接著，以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）分別萃取四組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克（ng）的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript® III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM 即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表1的引子（SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:18）對二組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察二組的人類初代皮膚角質細胞內的Krt1基因、HAS2基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，接著95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量Krt1基因、HAS2基因的mRNA表現量，進而推斷Krt1基因、HAS2基因編碼的蛋白質的表現量。
表2
引子名稱 序列編號 引子序列 長度
HAS2-F SEQ ID NO:13 CGGTGCTCCAAAAAGGCAAA 20
HAS2-R SEQ ID NO:14 ACACAATGAGTTGGGCGAGA 20
KRT1-F SEQ ID NO:15 AGAGTGGACCAACTGAAGAGT 21
KRT1-R SEQ ID NO:16 ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT 21
TBP-F SEQ ID NO:17 TATAATCCCAAGCGGTTTGC 20
TBP-R SEQ ID NO:18 GCTGGAAAACCCAACTTCTG 20
*R為REVERSE反向，F為FORWARD順向。
需要特別說明的是，下文述及之圖式中顯示的Krt1基因、HAS2基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
請參閱圖6，將空白組的HAS2基因和KRT1基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組相對於空白組的HAS2基因的表現量為1.43（即143%）、KRT1基因的表現量為2.27（即227%），代表實驗組的HAS2基因的表現量上升為空白組的1.43倍，KRT1基因的表現量上升為空白組的2.27倍。
換言之，實驗組相較於空白組的HAS2基因的表現量上升43%、KRT1基因的表現量上升127%。
結果如圖6所示，當人類初代皮膚角質細胞以香瓜茄發酵汁液處理後，人類初代皮膚角質細胞的HAS2基因、KRT1基因的表現量上升，代表香瓜茄發酵汁液具調節角蛋白及玻尿酸含量之能力，具提升肌膚保濕能力之潛力。
實施例九：脂肪累積檢測
於此，所使用的前脂肪細胞增殖培養基（pre-adipocyte expansion medium）為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之最低必需培養基α（Minimum Essential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco）。所使用的分化培養基（differentiation medium）為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之MEMα（品牌：Gibco）。並且，將油-紅O染色試劑（品牌：Sigma）徹底溶解於100%異丙醇（isopropanol，供應商：ECHO）以配製3mg/mL之油-紅O染色試劑的儲備溶液。為獲得可供使用的油-紅O工作溶液（oil-red O working solution），於使用前即時將油-紅O染色試劑的儲備溶液以二次水（ddH2O）稀釋至濃度1.8mg/mL，即為60%油-紅O染色試劑的儲備溶液。
首先，以每孔8×104 個細胞的細胞數，將小鼠骨髓基質細胞株OP9（購自ATCC，編號CRL-2749）接種於含有500μL前脂肪細胞增殖培養基的24孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL分化培養基。於培養7天後，使用顯微鏡（廠牌：ZEISS）觀察各孔中的細胞內的油滴（lipid droplet）形成以確認細胞完全分化成脂肪細胞，供後續實驗使用。
在培養24小時後，將脂肪細胞分成3個組別：二個實驗組（即實驗組A（香瓜茄水萃液）與實驗組B（香瓜茄發酵汁液））以及空白組。移除各組別的分化培養基，並更換成每孔500μL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL實驗培養基。其中，實驗組A的實驗培養基為含有0.0625vol%例一中所得到的香瓜茄水萃液的分化培養基。實驗組B的實驗培養基為含有0.0625vol%例一中所得到的香瓜茄發酵汁液的分化培養基。空白組的實驗培養基為單純的分化培養基（即不含香瓜茄水萃液亦不含香瓜茄發酵汁液）。
接著，移除各孔中的實驗培養基並以1xPBS潤洗二次。繼而，於各孔內添加1mL的10%甲醛（formaldehyde，供應商：ECHO）並於室溫下培養30分鐘，藉以固定細胞。之後，移除各孔內的甲醛並以1mL PBS對各孔潤洗二次。於再次潤洗後，添加1mL的60%異丙醇至每孔中並作用1分鐘。接著，移除異丙醇，再添加1mL油-紅O工作溶液並於室溫下作用1小時。
於作用1小時候，移除油-紅O工作溶液並以1mL的60%異丙醇快速退染5秒。於退染後，染色後的細胞以1xPBS潤洗後，加入100%異丙醇至各孔中，並置於振盪器（shaker）上反應10分鐘以溶解染劑。然後，從各孔中取100μL前述之溶染劑-異丙醇溶液至96孔培養盤並於510nm的波長下以ELISA讀取儀（廠牌：BioTek）讀取各孔的吸光值（OD510）。
於量測後，藉由將所測得的吸光值代入下列公式（3）而計算出相對脂肪油滴量（%）。換言之，於此，是將空白組的脂肪油滴量視為1（即空白組的相對脂肪油滴量為100%）來計算各組別的相對脂肪油滴量（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖4所示。在圖4中，「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01。 相對脂肪油滴量（%）＝（OD510 sample/OD510 control）×100%   （3）
其中，OD510 sample代表欲換算之組別的吸光值，而OD510 control代表空白組的吸光值。
參照圖4，相較於空白組，實驗組A的相對脂肪油滴量有顯著地降低，且其可減少11.72%的油滴量。相較於空白組，實驗組B的相對脂肪油滴量有顯著地降低，且其可減少32.29%的油滴量。由此可知，香瓜茄發酵汁液能有效地抑制脂肪累積，具有減脂之功效。並且，香瓜茄透過微生物發酵後可能產出較香瓜茄培養液更多的減脂活性成分。
實施例十：減脂功效試驗
減脂是指脂肪被分解，而脂肪分解（Lipolysis）作用是指脂肪細胞內所貯存的三酸甘油酯（triglyceride, TG）被逐步降解為脂肪酸（fatty acid, FA）與甘油（Glycerol）的過程。基此，本次試驗分析脂肪細胞中甘油（Glycerol）的含量作為量化指標，以觀察是否有產生脂肪分解作用。
本次試驗採用小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC® ）之OP9細胞株 （ATCC CRL-2749）。
首先，取24孔培養盤將每孔接種8×104 個OP9細胞及500μL培養基（Medium），前培養基其中包含80%之MEMAM（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國）細胞培養液、20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國，Cat#10437-028），且加入0.1%之青黴素/鏈黴素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國），在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後，以顯微鏡（ZEISS；放大倍率400x）觀察細胞內油滴形成，藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。
然後，將分化完成的脂肪細胞分為二組：二個實驗組（即實驗組A（添加實施例二所製備的香瓜茄水萃液）與實驗組B（添加實施例一所製備的香瓜茄發酵汁液））以及空白組。
實驗組A：依照每孔500μL培養基含有0.156μL的香瓜茄水萃液的比例（即，濃度為0.03125%）將香瓜茄水萃液添加至含分化後的培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
實驗組B：依照每孔500μL培養基含有0.156μL 的香瓜茄發酵汁液的比例（即，濃度為0.03125%）將香瓜茄發酵汁液添加至含分化後的培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
空白組：不作任何處理，即不額外添加其他成分至含分化後的培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
於7天的細胞處理後，使用細胞甘油基檢測試劑套組（Glycerol cell-based assay kit，購自Cayman，美國，產品編號10011725）依據下列步驟測量甘油含量。收集各組的上清液，並各取其中的25μL轉移到新的96孔培養盤中，並於各孔中加入100μL之重構游離甘油測定試劑（Reconstituted free glycerol assay reagent），再於室溫下作用15分鐘後，將培養盤以ELISA讀數器讀取各組之OD540nm 的吸光度，以量化各組脂肪細胞分解並釋放至細胞培養液中的甘油量，如圖6所示。於此，甘油量的多寡與脂肪的分解量成正比。其中，利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
參考圖8。將空白組的脂肪分解量視為100%時，實驗組A的脂肪分解量為96.07%，實驗組B的脂肪分解量為104.85%，也就是說香瓜茄發酵汁液處理的之後能顯著地提升4.85%的脂肪分解量。此結果顯示，香瓜茄發酵汁液能直接且有效促進脂肪細胞中脂肪分解，以減少脂肪細胞中脂肪的含量，而達到燃脂減肥的功效。
實施例十一-脂肪代謝基因的細胞實驗
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定小鼠骨髓基質細胞受經香瓜茄水萃液或香瓜茄發酵汁液處理後，細胞中脂肪代謝基因基因的變化。
舉例來說，脂肪代謝基因基因為UCP2基因（Gene ID:7351）。
其中， UCP2（Uncoupling Protein 2）基因所編碼的蛋白質為體解偶聯蛋白（UCP），其為線粒體陰離子載體蛋白（Mitochondrial anion carrier proteins,MACP）家族的成員之一，主要功能為將三磷酸腺核苷（Adenosine triphosphate,ATP）還原，並促進陰離子從線粒體的內膜向外轉移，及促進質子從外部到線粒體內膜的返迴轉移，並將過程中產生的能量以熱能釋放出來；UCP2基因在許多組織中表達，且以骨骼肌表達量最高，被認為與非顫抖性生熱（Nonshivering thermogenesis）有關。因此，UCP2基因的表現量上升，能夠促進脂肪的分解，並使脂肪的累積量降低。
因此，實施例十一中以UCP2基因作為分析標的。
材料與儀器 10.       細胞株：小鼠骨髓基質細胞OP9（BCRC；編號CRL-2749）。 11.       培養基：包含80%之MEMAM（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國）細胞培養液、20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國，Cat#10437-028），且加入0.1%之青黴素/鏈黴素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國）。 12.       RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G） 13.       反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase）（Invitrogen公司，美國，編號18080-051） 14.       測量標的基因引子，其中包含UCP2基因，另包括內部空白組（m-ACTB基因）。 15.       KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組（購自Sigma公司，美國，編號38220000000） 16.       ABI StepOnePlusTM 即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。 17.       香瓜茄發酵汁液：此實驗中所使用的香瓜茄水萃液是透過如上實施例一所獲得。 18.       香瓜茄水萃液：此實驗中所使用的香瓜茄水萃液是透過如上實施例二所獲得。
實驗步驟
首先，取1.5x105 個小鼠骨髓基質細胞OP9至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時，將每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞OP9依據下列測試條件分為空白組以及實驗組（共三組）來處理每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞。
測試條件
組別 添加成分 細胞實驗濃度 處理時間
空白組 無 無 無
實驗組A 香瓜茄水萃液 香瓜茄水萃液0.0625% 6小時
實驗組B 香瓜茄發酵汁液 香瓜茄發酵汁液0.0625% 6小時
詳細來說，空白組是單純使用2毫升培養液來培養小鼠骨髓基質細胞，未再加入其他添加成分，培養6小時，用於做為實驗空白組。
實驗組A是將如上實施例所製備的香瓜茄水萃液0.0625%濃度的培養基2ml，培養小鼠骨髓基質細胞6小時。
實驗組B是將如上實施例所製備的香瓜茄發酵汁液0.0625%濃度的培養基2ml，培養小鼠骨髓基質細胞6小時。
以上空白組、實驗組A、實驗組B，每組進行四重複。
將處理後的小鼠骨髓基質細胞（即空白組、實驗組A、實驗組B）以細胞裂解液分別破細胞膜以形成三組的細胞溶液。接著，以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）分別萃取三組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克（ng）的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript® III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM 即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表1的引子（SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:22）對三組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察三組的小鼠骨髓基質細胞內的UCP2基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，接著95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量UCP2基因的mRNA表現量，進而推斷UCP2基因編碼的蛋白質的表現量。
表1
引子名稱 序列編號 引子序列 長度
UCP2-F SEQ ID NO:19 ATGGTTGGTTTCAAGGCCACA 21
UCP2-R SEQ ID NO:20 CGGTATCCAGAGGGAAAGTGAT 22
m-ACTB-F SEQ ID NO:21 GGCTGTATTCCCCTCCATCG 20
m-ACTB-R SEQ ID NO:22 CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 22
*R為REVERSE反向，F為FORWARD順向。
需要特別說明的是，下文述及之圖式中顯示的UCP2的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
請參閱圖9，將空白組的UCP2基因的表現量視為1（即100%）時，實驗組A相對於空白組的UCP2基因的表現量為1.26（即126%），實驗組B相對於空白組的UCP2基因的表現量為4.75（即475%），代表實驗組A的UCP2基因的表現量上升為空白組的1.26倍，實驗組實驗組B的UCP2基因的表現量上升為空白組的4.75倍。
換言之，實驗組A相較於空白組的UCP2基因的表現量上升26%，實驗組B相較於空白組的UCP2基因的表現量上升375%。
由此可知，當小鼠骨髓基質細胞以含有香瓜茄發酵汁液處理後，小鼠骨髓基質細胞的UCP2的表現量上升。
結果如圖9所示，本發明之香瓜茄發酵汁液可提升細胞UCP2的基因表現量，代表，而使香瓜茄發酵汁液對促進脂肪的分解，並使脂肪的累積量降低具有效果。
實施例十二：減脂瘦身之人體檢測
令8位肥胖受試者（即其體脂率大於25%或BMI值大於24）每日飲用一瓶50mL香瓜茄發酵飲料（其含有12vol%例1中所得到的香瓜茄發酵汁液與88vol%水），連續飲用4週。並且，於飲用前（即第0週）及飲用4週後（即第4週），以體重機測量此些受試者體重，以體脂計（廠牌：TANITA BC-601FS）測量此些受試者全身體脂率，以及以布尺量測此些受試者的腰圍。並且，第0週的量測結果與第4週的量測結果之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖10至圖13所示。在圖10至圖13中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05；「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01。
參照圖10，相比飲用前（第0週），持續4週飲用香瓜茄發酵飲料可使體重顯著地減少約1.0公斤。
參照圖11，相比飲用前（第0週），持續4週飲用香瓜茄發酵飲料可使全身體脂率顯著地減少約1.0%。
參照圖12，相比飲用前（第0週），持續4週飲用香瓜茄發酵飲料可使軀幹體脂率顯著地減少約1.2%。
參照圖13，相比飲用前（第0週），持續4週飲用香瓜茄發酵飲料可使腰圍顯著地減少約1.1公分。
由此可知，長期使用香瓜茄發酵汁液可改善肥胖者的脂肪累積、體重，即香瓜茄發酵汁液具瘦身減脂之功效。
實施例十三：抗氧化之人體檢測
令8位肥胖受試者（即其體脂率大於25%或BMI值大於24）每日飲用一瓶50mL香瓜茄發酵飲料（其含有12vol%例1中所得到的香瓜茄發酵汁液與88vol%水），連續飲用4週。並且，於飲用前（即第0週）及飲用4週後（即第4週）進行採血，並檢測血中的總和抗氧化能力（Total Anti-oxidative Capacity）以及過氧化產物（MDA），其中總和抗氧化能力及過氧化產物是委託立人醫事檢驗所（台灣）進行檢測。
一般來說，總和抗氧化能力，簡稱為TAC，可代表體內還原氧化物的能力。許多研究顯示自由基會引起人體一些病變，如：心血管疾病及各種發炎疾病等，而體內的抗氧化劑具有保護細胞的作用，可以來防衛自由基的攻擊，所以，可藉由檢測體內抗氧化能力狀態，來監測身體之失衡狀態，總和抗氧化能力越高，代表體內抗氧化能力越好；過氧化產物（MDA，Malondialdehyde），代表的是體內脂質過氧化的產物，被廣泛接受為氧化損傷的測定標的之一，過氧化產物（MDA，Malondialdehyde）越高，代表體內的氧化壓力越高。
於量測後，將第0週之數值作為基準（即第0週之抗氧化相關數值為100%），計算第4週的相對抗氧化相關數值（%）。並且，第0週的量測結果與第4週的量測結果之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖14及圖15所示。在圖14及圖15中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05；「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。
參照圖14，相比飲用前（第0週），持續4週飲用香瓜茄發酵飲料可使總和抗氧化能力顯著地增加約11.0%；其中第0周的總和抗氧化能力原始數值為0.74nmol/L，第4周的總和抗氧化能力原始數值為0.83nmol/L。
參照圖15，相比飲用前（第0週），持續4週飲用香瓜茄發酵飲料可使過氧化產物（MDA）顯著地減少約26.1%；其中第0周的MDA原始數值為1.1nmol/ml，第4周的MDA原始數值為0.9nmol/ml。
實施例十四：改善肌膚狀況之人體檢測
令8位肥胖受試者（即其體脂率大於25%或BMI值大於24）每日飲用一瓶50mL香瓜茄發酵飲料（其含有12vol%例1中所得到的香瓜茄發酵汁液與88vol%水），連續飲用4週。並且，於飲用前（即第0週）及飲用4週後（即第4週），以VISIA肌膚檢測儀（VISIA Complexion Analysis System，購自美國Canfield公司）及皮膚表面濕度測試儀（Corneometer CM825，購自德國C+K公司）檢測肌膚狀況。於此，以VISIA肌膚檢測儀量測肌膚紋理、肌膚皺紋、肌膚泛紅（紅色素），並且以皮膚表面濕度測試儀量測肌膚含水量。
於量測後，將第0週之肌膚狀況作為基準（即第0週之相對肌膚狀況為100%），計算第4週的相對肌膚狀況（%）。並且，第0週的相對肌膚狀況與第4週的相對肌膚狀況之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖16至圖19所示。在圖16至圖19中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05。
參照圖16至圖19，相比飲用前（第0週），持續4週飲用香瓜茄發酵飲料可使肌膚紋理顯著地減少約4.3%，使肌膚皺紋減少約5.3%，使肌膚紅色素減少約7.6%，以及使肌膚含水量顯著地增加約9.6%。由此可知，長期使用香瓜茄發酵汁液可改善肌膚狀況，即香瓜茄發酵汁液具改善肌膚狀況之功效。
綜上所述，根據本發明任一實施例的香瓜茄發酵汁液，其可製備改善肌膚狀況及/或減脂的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：提升穀胱甘肽合成、抑制醣化終產物形成、提升抗老相關基因、抑制黑色素生成、提升保濕相關基因分泌、抑制脂肪累積、促進脂肪分解、減少受體的體脂肪以及改善肌膚狀況。
無
圖1是繪示香瓜茄培養液（發酵前）與香瓜茄發酵汁液（發酵後）的總多酚含量的變化之長條圖。 圖2是繪示各組別的相對穀胱甘肽含量之長條圖。 圖3是繪示各組別的相對醣化終產物形成量之長條圖。 圖4是繪示各組別的相對抗老基因表現量之長條圖。 圖5是繪示各組別的相對黑色素含量之長條圖。 圖6是繪示各組別的相對保濕基因表現量之長條圖。 圖7是繪示各組別的抑制脂肪堆積效果之長條圖。 圖8是繪示各組別的促進脂肪分解之長條圖。 圖9是繪示各組別的相對燃脂基因表現量之長條圖。 圖10是繪示一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的體重的變化之長條圖。 圖11是繪示一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的全身體脂率的變化之長條圖。 圖12是繪示一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的軀幹體脂率的變化之長條圖。 圖13是繪示一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的臀圍的變化之長條圖。 圖14是繪示一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的總合抗氧化能力的變化之長條圖。 圖15是繪示一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的物過氧化產物MDA的變化之長條圖。 圖16是繪示一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的相對肌膚紋理（粗糙度）的變化之長條圖。 圖17是一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的相對肌膚皺紋的變化之長條圖。 圖18是一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的相對肌膚泛紅（紅色素）的變化之長條圖。 圖19是一示範例之香瓜茄發酵汁液使用前與使用後的相對肌膚含水量的變化之長條圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012

Claims (11)

  1. 一種香瓜茄發酵汁液的用途，其是用於製備用以改善肌膚狀況的組合物，其中該香瓜茄發酵汁液是由一香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得，其中該香瓜茄培養液包括香瓜茄汁及水，該香瓜茄汁與該水的比例為1:2-5，以及相對於該香瓜茄培養液，該複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
  2. 如請求項1所述的用途，其中改善該肌膚狀況為提升肌膚抗老能力、提升抗醣化能力、降低黑色素含量、提升肌膚保濕、減少肌膚紋理、減少肌膚皺紋、減少肌膚泛紅或其組合。
  3. 如請求項2所述的用途，其中該提升肌膚抗老能力為調控CCT5基因、FOXO基因、MRPS5基因、Pink1基因或UBL5基因其中至少一項。
  4. 如請求項2所述的用途，其中該提升肌膚保濕為調控HAS2基因或KRT1基因其中至少一項。
  5. 一種香瓜茄發酵汁液的用途，其是用於製備用以提升抗氧化能力的組合物，其中該香瓜茄發酵汁液是由一香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得，其中該香瓜茄培養液包括香瓜茄汁及水，該香瓜茄汁與該水的比例為1:2-5，以及相對於該香瓜茄培養液，該複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
  6. 如請求項5所述的用途，其中所述提升抗氧化能力為提升總和抗氧化能力（Total Anti-oxidative Capacity）、降低過氧化產物MDA（Malondialdehyde）、提升穀胱甘肽或其組合。
  7. 一種香瓜茄發酵汁液的用途，其是用於製備用以減少脂肪的組合物，其中該香瓜茄發酵汁液是由一香瓜茄培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得，其中該香瓜茄培養液包括香瓜茄汁及水，該香瓜茄與該水的比例為1:2-5，以及相對於該香瓜茄培養液，該複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
  8. 如請求項7所述的用途，其中所述減少脂肪為抑制脂肪累積、促進脂肪分解或其組合。
  9. 如請求項1至8中的任一項所述的用途，其中該發酵程序包括： 添加該酵母菌至該香瓜茄培養液內； 將該香瓜茄培養液與該酵母菌進行發酵1日至3日以形成一第一初發酵汁液，其中該酵母菌為Saccharomyces cerevisiae； 添加該乳酸菌至該第一初發酵汁液內； 將該第一初發酵汁液與該乳酸菌進行發酵1日至5日以形成一第二初發酵汁液，其中該乳酸菌為Streptococcus thermophilus； 添加該醋酸菌至該第二初發酵汁液內； 將該第二初發酵汁液與該醋酸菌進行發酵3日至10日以形成一第三初發酵汁液，其中該醋酸菌為Acetobacter aceti；以及 過濾該第三初發酵汁液以得到該香瓜茄發酵汁液。
  10. 如請求項1至8中的任一項所述的用途，其中該香瓜茄發酵汁液的pH值為4.0±1.0，且該香瓜茄發酵汁液的糖度為40±2。
  11. 如請求項1至8中的任一項所述的用途，其中該香瓜茄發酵汁液的多酚含量為88ppm。
TW109129405A 2019-08-27 2020-08-27 香瓜茄發酵汁液用於製備提升肌膚抗老能力、提升抗醣化能力、降低黑色素含量、提升肌膚保濕、減少肌膚紋理、減少肌膚皺紋、減少肌膚泛紅及/或減脂組合物的用途 TWI774046B (zh)

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