TWI734332B - 西印度櫻桃果實的萃取物用於調控體重、美肌、抗發炎及抗老化的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種西印度櫻桃果實的萃取物用於調控體重、美肌、抗發炎及抗老化的用途。
Description
本發明是有關於一種西印度櫻桃(Malpighia glabra)果實的萃取物用於調控體重、美肌、抗發炎及抗老化的用途。
皮膚組織是由表皮、真皮及皮下組織所構成，其中真皮含有大量膠原蛋白及玻尿酸，而與皮膚之保水性及彈力息息相關。人類皮膚會隨著年紀、生理因素或環境因素，而有老化、膚質粗糙或產生皺紋等現象，如正常年輕人的皮膚都具一定的彈性和張力，當表情肌鬆弛後，皮膚會很快復原，使皺紋消失；但進入中年後，皮膚開始明顯老化，皮膚變薄、變硬、乾燥、張力降低；真皮膠原蛋白減少、彈力纖維變性、斷裂，使皮膚的張力和彈性降低，因此，當表情肌鬆弛後，皮膚不能很快復原，久之則使皺紋成形；且隨年齡的增大，皮膚和皮下組織更加鬆弛，加上面部支持組織的萎縮或缺失，以及肌肉的鬆軟，皮膚會在重力的作用下發生滑墜，形成更深的皺紋。而肌膚粗糙係由於乾燥、紫外線、清潔劑或化學物質等刺激性物質等外在重要因素，或激素平衡之紊亂等內在重要因素而產生之肌膚困擾，並伴隨角質層屏障功能之下降、角質層水分量之下降、表皮代謝回轉之亢進、鱗屑之產生而角質粗糙化等現象。因此皮膚上的細胞若失去彈性及保濕功能，會引起皮膚褶皺、乾燥及失去光澤等現象。
另一方面。皮膚是保護人類個體的最大屏障，它具有對抗水分散失、病原菌以及各種環境損害之功能。暴露於大量的紫外線(ultraviolet,UV)、游離輻射(ionizing radiation)、藥物或異生物質(xenobiotics)會促使皮膚生成活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)以及自由基(free radicals)。當所累積的活性氧分子以及自由基的數量超過細胞或組織本身的抗氧化能力時，便會形成氧化性壓力(oxidative stress)。接著，活性氧分子以及自由基會與細胞內的組成物(包括DNA、蛋白質以及脂質等)相反應，進而對皮膚產生非所欲的影響。
黑色素生成(melanogenesis)(亦即黑色素合成(melanin synthesis))是指當皮膚黑色素細胞(dermal melanocyte)在受到環境因素(諸如紫外線(ultraviolet,UV))或生理因素(諸如疲勞(fatigue)、壓力(stress)、慢性發炎(chronic inflammation)以及體內不正常的α-促黑素細胞素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)的釋放)的誘發之後，在黑色素細胞內的酪胺酸(tyrosine)經由酪胺酸酶(tyrosinase)的催化(它是黑色素生成的速率-限制步驟(rate-limiting step))以及一系列的氧化還原反應而被轉化為黑色素(melanin)的過程。黑色素可以保護皮膚的下皮層(hypodermis)免於紫外線所造成的光損害(photodamage)，但是當黑色素被大量地累積於皮膚上或不正常地分佈時可能會導致皮膚疾病(skin disorders)，諸如雀斑(lentigines)、斑點(freckle)、黑皮病(melasma)、老人斑(age spots)以及色素過多(hyperpigmentation)等。
為了達到皮膚美白(skin whitening)及美肌的目的，目前已有許多黑色素生成抑制劑(melanogenesis inhibitors)被使用來淡化或去除累積於皮膚上的黑色素或是黑斑，而這些黑色素生成抑制劑大多是經由下列的作用機制來調控黑色素的生成：(1)在黑色素生成之前：例如抑制酪胺酸酶的mRNA轉錄(mRNA transcription)(諸如C2-神經醯胺(C2-ceramide)、維生素A酸(tretinoin)以及香草酸(vanillic acid))與醣化(glycosylation)(諸如泛硫醇磺酸鈣(calcium D-pantetheine-S-sulfonate,PaSSO3Ca))；(2)在黑色素生成的期間：例如抑制酪胺酸酶的活性(諸如對苯二酚(hydroquinone)、熊果苷(arbutin)以及麴酸(kojic acid))、加速酪胺酸酶的降解(degradation)(諸如亞麻油酸(linoleic acid)以及苯硫脲(phenylthiourea))，以及促進多巴醌(dopaquinone)的還原(reduction)(諸如抗壞血酸(ascorbic acid))；以及(3)在黑色素生成之後：例如促進黑色素分解(諸如亞麻油酸
(linoleic acid))、抑制黑色素體運輸(melanosome transfer)(諸如菸鹼醯胺(Niacinamide)以及絲胺酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor))，以及加速皮膚更新(turnover)(諸如甘草甙(liquiritin)以及乙醇酸(glycolic acid))。
脂肪為人體內的必要成分，但過度的脂肪成分對人體會造成損害。國家經濟愈來愈起飛的國家，肥胖(又稱為代謝症候群)問題只增不減，因此以亞洲區來看，中國會是下一波肥胖問題增加幅度大幅上升的國家。
另外，台灣目前已成為為「亞洲第一胖」的國家，18歲以上國民中，男性體重過重之比例為51.1%，女性體重過重之比例為35.8%，且比例還在上升中，甚至體重過重的年齡層也是逐年下降，中小學生體重過重的比例已上升至25%以上，是全球排名第八高的區域。此外，肥胖會導致慢性發炎，促使體內的發炎反應，誘發脂肪細胞轉變為胰島素抗性細胞，進而導致高血糖、高膽固醇、高血壓、及脂肪代謝異常。因此肥胖是目前亟需解決的問題。
除此之外，醣化反應(glycation)與皮膚與體內老化相關，更與危害國人健康甚巨的糖尿病有關。醣化反應的本質就是梅納反應(Maillard reaction)或稱為羰胺褐變反應(carbonyl-amine browning)，這是糖的醛(酮)基與含胺基物質(例如蛋白質、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸或上述之衍生物)的胺基之間的一種非酵素性醣化(nonenzymatic glycosylation；glycation)反應。長期處於高血糖症狀下，會引起葡萄糖自動氧化與蛋白質糖化作用，形成高度醣化終產物(advanced glycation end products,AGEs)。而AGEs更可引起多種老化疾病，例如皮膚皺紋、白內障、粥狀動脈硬化、腎臟衰竭等。
當人類食用的碳水化合物為澱粉時，不論是直鏈或是支鏈的澱粉都可被唾腺和胰臟中的α-澱粉酶快速地分解。澱粉酶係一種分解酶，其水解雙鏈葡萄糖中連結之α-1,4-糖苷鍵的酶，根據作用的方式可分為α-澱粉酶與β-澱粉酶。α-澱粉酶為水解大量的α鏈與α鏈連接的多醣(諸如澱粉、肝醣)而產生葡萄糖及麥芽糖的酵素；α-澱粉酶在人體或是其他哺乳動物中發現的型式為澱粉酶(唾液、胰臟等)，亦會出現在含有澱粉的種子作為一種食物的儲存，以及許多微生物會分泌α-澱粉酶。
由於α-澱粉酶可將澱粉轉化成醣類，進而造成血糖濃度上升，因此本領域的研究人員已開始將α-澱粉酶抑制劑應用於糖尿病及代謝症候群的治療。
瘦體素(leptin)為人體調節體重的重要因子，可抑制食慾及脂肪增生，並增加基礎代謝率，將體脂肪控制於適當範圍中。許多長期肥胖者皆有瘦體素分泌不足的問題，難以減重且容易復胖。
然而，目前用來解決上述問題(包括調控體重、美肌、抗發炎及抗老化)的醫藥品、食品產品或保養品大多由化學成分所製成，長期使用不但對人體健康有害無益，且這些產品往往價格昂貴，並非為一般使用者所能負擔。為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出具有調控體重、美肌、抗發炎及抗老化的功效之新穎醫藥品、食品產品或保養品以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種西印度櫻桃(Malpighia glabra)果實的萃取物用於製備一調控體重、美肌、抗發炎及抗老化之組成物的用途，其中該西印度櫻桃果實的萃取物是以水、醇類、含水醇類或其組合作為一萃取溶劑對該西印度櫻桃果實進行萃取而製得。
在本發明的一實施例中，該西印度櫻桃果實與該萃取溶劑的體積比例介於1~5：5~20。
在本發明的一實施例中，該西印度櫻桃果實的萃取物的有效濃度為至少0.0625mg/mL。
在本發明的一實施例中，該調控體重包括抑制α-澱粉酶(α-amylase)活性、抑制脂肪酶(lipase)活性及提升瘦體素(leptin)含量。
在本發明的一實施例中，該美肌包括抑制皮膚黑色素生成、提升皮膚的膠原蛋白含量及提升皮膚的彈力蛋白含量。
在本發明的一實施例中，該皮膚黑色素生成為藍光損傷所誘發的皮膚黑色素生成。
在本發明的一實施例中，該抗發炎為抑制脂肪細胞導致的慢性發炎。
在本發明的一實施例中，該抗老化為降低活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)表現量。
在本發明的一實施例中，該西印度櫻桃果實為西印度櫻桃開花後25~35天之果實。
在本發明的一實施例中，該組成物是一醫藥品、一食品產品或一保養品。
綜上所述，本發明西印度櫻桃果實的萃取物之功效在於：可藉由抑制α-澱粉酶(α-amylase)活性、抑制脂肪酶(lipase)活性、提升瘦體素(leptin)含量、抑制藍光損傷所誘發的皮膚黑色素生成、提升皮膚的膠原蛋白含量、提升皮膚的彈力蛋白含量、抑制脂肪細胞導致的慢性發炎、及降低活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)表現量，達到調控體重、美肌、抗發炎及抗老化的功效。另一方面，西印度櫻桃果實的萃取物可有效預防三高，適合開發作為美肌與體重管理之產品。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1是本發明西印度櫻桃果實的萃取物的原花青素含量檢測之數據圖。
圖2是本發明西印度櫻桃果實的萃取物的黃酮含量檢測之數據圖。
圖3是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制α-澱粉酶活性上的功效之數據圖。
圖4是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制脂肪酶活性上的功效之數據圖。
圖5是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在提升瘦體素含量上的功效之數據圖。
圖6是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在降低AGEs誘發的ROS表現量上的功效之數據圖，其中***表示p<0.001。
圖7是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制藍光損傷所誘發的皮膚黑色素生成上的功效之數據圖，其中***表示p<0.001。
圖8是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在提升皮膚的膠原蛋白含量上的效用之數據圖，其中**表示p<0.01。
圖9是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在提升皮膚的彈力蛋白含量上的效用之數據圖，其中*表示p<0.05。
圖10是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制脂肪細胞導致的慢性發炎上的功效之數據圖，其中*表示p<0.05；**表示p<0.01。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以史徒登氏t-檢定(student's t-test)分析。
依據本發明，西印度櫻桃(Malpighia glabra)是一種金虎尾科(Malpighiaceae)金虎尾屬(Malpighia)小喬木，原產熱帶，果實可食用。又稱亮葉金虎尾。西印度櫻桃原產於南美、墨西哥南部、波多黎各、多米尼加、海地、巴西、中美等地，但現在也開始在德克薩斯和亞洲的熱帶地區種植。西印度櫻桃以含有豐富的維生素C而著稱，可透過種子、扦插等方式繁殖。生長環境喜乾燥的沙質土壤和充分日照。
如本文中所使用的，用語“西印度櫻桃果實(Malpighia glabra fruitlet)”意指西印度櫻桃開花後25~35天之果實。
依據本發明，西印度櫻桃果實的萃取物可以使用新鮮的西印度櫻桃果實而被製備，或者可使用預先經過一選自於由下列所構成之群組中的加
工處理的西印度櫻桃果實而被製備：乾燥處理、研磨處理、切碎處理，及其組合。
如本文中所使用的，用語“抗老化(anti-aging)”意指預防、減緩人類皮膚外觀之老化現象，例如：皺紋的產生及失去彈性等。評量實現此目的之程度將根據熟悉此項技藝者已知之諸多因素來決定，諸如消費者的全身狀態、年齡、性別等。
如本文中所使用的，用語“抑制黑色素生成(inhibition of melanogenesis)”與“抑制黑色素合成(inhibition of melanin synthesis)”、“去色素(depigmenting)”、“淡化黑色素(lightening the melanin)”、“美白(whitening)”、“膚色淡化(skin color lightening)”、“漂白(bleaching)”、“淨白”、“增白(brightening)”、“退黑”以及“驅黑”可被交換地使用。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以
及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。
依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。
依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。
依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P(carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑
(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。
依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質
類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
首先，將開花後第25~35天的西印度櫻桃(Malpighia glabra)(來自於巴西(Brazil))的果實切成12mm的大小，然後進行均質，接而以水、醇類、含水醇類或其組合作為萃取溶劑對均質後的西印度櫻桃果實進行萃取，其中萃取的溫度介於75℃至95℃，萃取溶劑與西印度櫻桃果實的體積比介於5~20：1~5。接著，將所得到的產物進行離心，取離心後的上清液得到一濾液，然後於50~60℃下對濾液進行減壓濃縮而得到一濃縮產物。之後，對濃縮產物進行噴霧乾燥，得到本發明西印度櫻桃果實的萃取物。
原花青素(proanthocyanidin,OPC)含量檢測的分析方法主要是參考Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagents,V.L.Singleton,Joseph A.Rossi Am J Enol Vitic.,January 1965,16：144-158所述方法並加以修飾。將適當稀釋後的樣品取0.1mL，加入0.6mL之4%香草醛甲醇溶液，再加入0.3mL濃HCl，混合均勻且於室溫下避光反應15分鐘後，以ELISA讀取儀(ELISA Reader)測定500nm吸光值。對照組以等量去離子水代替，另以兒茶素(catechin)配製100、200、300、400、500、600、700及800μg/mL之甲醇溶液，進行同步試驗並繪製標準曲線，作為定量參考依據。在本實施例中，本發明西印度櫻桃果實的萃取物被使用作為實驗組，而西印度櫻桃成熟果實的萃取物被使用作為比較組，其中西印度櫻桃成熟果實的萃取物之製備方法
大致上是相同於本發明西印度櫻桃果實的萃取物，不同之處在於：以西印度櫻桃成熟果實取代西印度櫻桃果實。本實施例的結果顯示於圖1。
圖1是本發明西印度櫻桃果實的萃取物的原花青素含量檢測之數據圖。由圖1可見，與比較組相較之下，實驗組的原花青素含量有顯著的提升，其中與比較組相較之下，實驗組的原花青素含量提升13.3倍。本實驗結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物會大量釋出原花青素。
另外，黃酮含量檢測的分析方法主要是參考Zhishen Jia et al.,(1999),Food Chemistry,64：555-559所述方法並加以修飾，取200μL之適當稀釋後的樣品加入1000μL之H2O，混合均勻後，加入200μL之5%檸檬酸鈉(Sodium nitrite)，靜置6分鐘後加入200μL之10%硝酸鋁(Aluminum nitrate)，再靜置6分鐘。最後加入2mL之4%氫氧化鈉(Sodium hydroxide)與1.4mL之H2O，混合均勻，於500nm下進行分析，以芸香素(Rutin)為標準品繪製標準曲線。在本實施例中，本發明西印度櫻桃果實的萃取物被使用作為實驗組，而西印度櫻桃成熟果實的萃取物被使用作為比較組，其中西印度櫻桃成熟果實的萃取物之製備方法大致上是相同於本發明西印度櫻桃果實的萃取物，不同之處在於：以西印度櫻桃成熟果實取代西印度櫻桃果實。本實施例的結果顯示於圖2。
圖2是本發明西印度櫻桃果實的萃取物的黃酮含量檢測之數據圖。由圖2可見，與比較組相較之下，實驗組的黃酮含量有顯著的提升，其中與比較組相較之下，實驗組的黃酮含量提升2.34倍。本實驗結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物會大量釋出黃酮。由於西印度櫻桃果實的萃取物之原花青素及黃酮含量最高，因此以西印度櫻桃果實的萃取物拿來進行後續實驗。
本實驗方法主要是參考E.Apostolidis et al.,(2007),Innovative Food Science & Emerging Technologies,8：46-54方法來進行。首先，準備下列實驗材料：0.02M磷酸鈉緩衝液(含6mM氯化鈉，pH 6.9)、2N氫氧化鈉、二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid)呈色試劑(又稱為終止劑)、1%可溶澱粉(starch)及α-澱粉酶(α-amylase)。
二硝基水楊酸呈色試劑的製備方式如下：取1g之3,5-二硝基水楊酸加入50mL去離子水，緩慢地加入30g酒石酸鉀鈉(sodium potassium tartrate tetrahydrate)，再加入20mL的2N氫氧化鈉，以去離子水定量至100mL。以二氧化碳填充保存，保存期限以兩週為限。
1%可溶澱粉的製備方式如下：取1g可溶澱粉溶於100mL的0.02M磷酸鈉緩衝液，緩慢地加熱使之完全溶解後，溫度降溫至室溫後定量至100mL。分析前至少要置於室溫下4到5分鐘。
α-澱粉酶(5units/mL)製備方式如下：α-澱粉酶(Sigma Chemical Co.，美國)以0.02M磷酸鈉緩衝液進行溶解，其固體活性為10至30units/mg，以每毫克100units計算，500KU約有50g之α-澱粉酶固體，配製5units/mL可配製成100L之α-澱粉酶，將其冰浴或儲存於4℃。
接著，以0.02M磷酸鈉緩衝液(含6mM氯化鈉，pH 6.9)為對照組，以添加2.5wt%西印度櫻桃果實的萃取物作為實驗組，實驗組及對照組分別有0分鐘反應組及10分鐘反應組。
之後，準備實驗組及對照組，分別取200μL置於微量離心管中，皆各取兩管一管作為0分鐘反應組另一管作為10分鐘反應組；各組加入200μL溶於磷酸鈉緩衝液之α-澱粉酶(5units/mL)，混合均勻後，置於25℃下培養10分鐘使酵素作用；0分鐘反應組，先加入二硝基水楊酸呈色試劑(作為終止劑)，再加入200μL 1%可溶澱粉，以避免繼續反應；10分鐘反應組，加入200μL 1%可溶澱粉，混合均勻後，置於25℃下培養10分鐘，再加入400μL之二硝基水楊酸呈色試劑，混合均勻後，置於沸水中反應5分鐘，將其冷卻至室溫。0分鐘反應組及10分鐘反應組皆以適當水量稀釋至可測定範圍，例如：150μL反應後樣品及850μL水，以分光光度計於540nm偵測吸光值，且背景值以緩衝溶液進行歸零。
α-澱粉酶活性抑制能力的計算公式如下：α-澱粉酶抑制百分比=[1-(ASample 10-ASample 0)/(AControl 10-AControl 0)]×100%
ASample 10=實驗組10分鐘反應組之吸光值
ASample 0=實驗組0分鐘反應組之吸光值
AControl 10=對照組10分鐘反應組之吸光值
AControl 0=對照組0分鐘反應組之吸光值
圖3是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制α-澱粉酶活性上的功效之數據圖。由圖3可見，實驗組可有效抑制α-澱粉酶活性，抑制百分比達至接近27%。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物可抑制α-澱粉酶活性，藉此達到調控體重的功效。
首先，配製緩衝液A，取17mg之結構油脂(structured lipids,SLS)與1g之Triton X-100定量至100mL水。接著，配製緩衝液B，Tris 66mM(pH7.4)，以HCl滴定，作為配製脂肪酶(lipase)緩衝溶液與反應之終止劑。之後，配製1.6mM 4-硝基苯基月桂酸酯(4-Nitrophenyl laurate)，取51.43mg之4-硝基苯基月桂酸酯，加入100mL的緩衝液A，於65℃下攪拌15分鐘混合均勻，待溶液呈澄清狀後，於室溫下冷卻後才可使用(保存條件：冷藏4℃，保存3天；隔日使用前呈現混濁狀態需再加熱65℃使溶液呈透明澄清，待冷卻後方能使用)。
接著，配製150U/mL脂肪酶，秤取99.21mg脂肪酶加緩衝液B定量至10mL，混合均勻後當日使用。之後，取空白組與10%西印度櫻桃果實的萃取物作為樣品組各25μL，加入25μL之脂肪酶，接而加入50μL之1.6mM 4-硝基苯基月桂酸酯，於37℃反應30分鐘後，加入100μL之緩衝液B終止反應。於400nm測定吸光值並依下列公式計算出抑制率(樣品空白組、對照組及空白組的處理方式相同)。
圖4是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制脂肪酶活性上的功效之數據圖。由圖4可見，樣品組可有效抑制脂肪酶活性，抑制百分比達至接近74%。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物可抑制脂肪酶活性，藉此達到調控體重的功效。
首先，將小鼠脂肪細胞3T3-L1(購自於ATCC® CL-173TM)培養於前脂肪細胞擴增培養液(Pre-adipocyte Expansion Medium)，其中包含90%之杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Gibco)、10%之牛血清(Bovine Serum，購自Gibco，美國)，且加入1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國)。於96孔培養盤的每孔中加入200μL的培養基，使每孔具有1 x 104個3T3-L1細胞。在37℃下培養48小時後，移除培養基。之後，添加分化培養液(Differentiation Medium)，其中包含90%之杜貝可氏改良的依格氏培養基、10%胎牛血清(FBS)、1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin)、1.0μM/mL地塞米松(Dexamethasone,DEXA)(Sigma)、0.5mM/mL甲基異丁基黄嘌呤(Methylisobutylxanthine,IBMX)(Sigma)及1.0μg/mL胰島素(Insulin)(Sigma)，每2天替換新鮮的分化培養液。4天之後，將分化培養液替換成脂肪細胞維持培養基(Adipocyte maintenance medium)，其中包含90%之杜貝可氏改良的依格氏培養基(DMEM)(Gibco)、10%胎牛血清(FBS)、1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin)及1.0μg/mL胰島素，每2天替換新鮮的脂肪細胞維持培養基。在開始分化誘導後的7-10天後，細胞已完全分化。接著，使用顯微鏡觀察脂肪滴形成。
之後，將3T3-L1細胞分成2組，其中包括1個實驗組及1個對照組。將0.125mg/mL西印度櫻桃果實的萃取物添加至實驗組的細胞中，而對照組的細胞則不做任何處理。在培養12天之後(每48小時替換培養基)，收集培養基並使用小鼠LEP(瘦體素)ELISA套組(Mouse LEP(Leptin)ELISA Kit)(Elabscience)決定瘦體素含量。
圖5是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在提升瘦體素含量上的功效之數據圖。由圖5可見，與對照組相較之下，實驗組的瘦體素含量有顯著提升(提升18%)。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物可有效提升瘦體素含量，藉此達到調控體重的功效。
本實施例抗醣化(抑制非酵素褐變，避免體內功能性蛋白質變性)的實驗流程如下：以200mM磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer)(pH 7.4)配製膠原蛋白(Collagen)(60mg/mL)(含0.06% NaN3)及D-果糖(D-fructose)(1.5M)。之後，分成3組，其中包括1個實驗組(即樣品)、1個AGE組及1個對照組。實驗組及AGE組被處理以AGEs(0.2mL之膠原蛋白及0.2mL之D-果糖混合均勻)。接著，將0.25mg/mL西印度櫻桃果實的萃取物添加至實驗組中，而對照組則不做任何處理。接著，於50℃下反應24小時。於上述醣化反應之原點及終點各取0.1mL進行螢光檢測(激發波長360nm，放射波長460nm)。
相對AGEs形成(%)的計算方式如下：
圖6是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在降低AGEs誘發的ROS表現量上的功效之數據圖。由圖6可見，與對照組相較之下，AGE組的ROS陽性細胞有顯著提升，這表示AGEs會誘發細胞產生大量ROS。而與AGE組相較之下，實驗組的ROS陽性細胞有顯著降低(降低57.1%)。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物可有效降低AGEs誘發的ROS表現量，藉此達到抗老化的功效。
首先，將老鼠皮膚黑色素瘤細胞株B16F10(購自於ATCC CRL-6475)培養於杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)[添加有1%青黴素/鏈黴素(Gibco)及10% FBS(Gibco)]中。於6孔培養盤的每孔中加入3mL的培養基，使每孔具有1.5 x 105個B16F10細胞。在37℃下培養24小時後，移除培養基。
之後，將B16F10細胞分成4組，其中包括1個實驗組、1個對照組、1個藍光組及1個比較組。將12J/cm2劑量的藍光照射藍光組、實驗組及比較組的細胞歷時1小時。將0.0625mg/mL西印度櫻桃果實的萃取物添加至實驗組的
細胞中，及將0.0625mg/mL麴酸(kojic acid)(一種黑色素生成抑制劑)添加至比較組的細胞中。至於對照組的細胞則不做任何處理。
各組細胞培養物在37℃下培養48小時後，移除培養基並以1xPBS(Gibco)沖洗兩次。之後，加入胰蛋白酶(trypsin)來處理細胞3分鐘並將懸浮的細胞收集於15mL體積的離心管中，接而以400xg/5分鐘進行旋轉(spin)以沉澱細胞。在以1xPBS沖洗兩次之後，以200μL的1XPBS再懸浮細胞沉澱物(cell pellet)。接著，將細胞溶液於液態氮中放置10分鐘，接而於室溫下靜置30分鐘進行解凍。在解凍完全之後，以12,000xg進行旋轉30分鐘，接而移除上清液並添加120μL的1N NaOH(配於ddH2O)。在混合均勻之後，於60℃乾浴槽中靜置1小時。之後，取100μL的體積至96孔培養盤中並於450nm的波長下以ELISA讀取儀來讀取各孔的吸光值(OD450)。
黑色素含量(%)是藉由將所測得的吸光值(OD450)代入下列公式而計算出：黑色素含量(%)=(各組所測得的OD450吸光值/對照組所測得的OD450吸光值)×100%
各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖7。
圖7是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制藍光損傷所誘發的皮膚黑色素生成上的功效之數據圖。由圖7可見，與對照組相較之下，藍光組的黑色素表現量有顯著提升，這表示藍光損傷會誘發皮膚黑色素生成。而與藍光組及比較組相較之下，實驗組的黑色素表現量有顯著降低。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物可有效抑制藍光損傷所誘發的皮膚黑色素生成，藉此達到美肌的功效。
首先，以添加有10%胎牛血清(FBS)、1%青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)及1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)的最低必需培養基(MEM)(Gibco)培養人類皮膚纖維母細胞(human skin fibroblast)CCD-966SK
(ATCC® CRL-1881)於24-孔盤，500μL培養基的細胞濃度為2×104細胞/孔，接而於37℃進行培養24小時，並以PBS清洗。
接著，將經培養的細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將實施例1得到的西印度櫻桃果實的萃取物以無血清培養基稀釋為具有0.25mg/mL濃度的稀釋液，繼而添加500μL的該稀釋液至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則添加500μL的無血清培養基。之後，收取1,000μL的培養基並轉移至1.5mL微量離心管中，接而添加200μL的膠原蛋白分離&濃縮試劑(collagen isolation & concentration reagent)，並翻轉離心管6~8次。接著，於4℃進行培養隔夜。之後，取出離心管並以12,000rpm離心10分鐘，接而移除1,000μL的上清液。接著，以SircolTM可溶性膠原蛋白分析套組(SircolTM Soluble Collagen Assay Kit)(Biocolor Life Science Assays,Northern Ireland,UK)來分析各組的膠原蛋白相對百分比。添加1,000μL的Sircol®染劑至離心管中，並輕微振盪30分鐘，接而以12,000rpm離心10分鐘，並移除上清液。接著，添加750μL的酸-鹽類清洗試劑(acid-salt washing reagent)，並以12,000rpm離心10分鐘。之後，移除上清液並翻轉離心管，接而以棉花棒移除離心管中的液體。接著，添加250μL的鹼性試劑並充分振盪混合，繼而以光譜訊號感測器測量波長555nm的吸光值，藉此計算出膠原蛋白分泌率，其中以對照組的膠原蛋白分泌率作為100%的基準。本實施例的結果顯示於圖8。
圖8是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在提升皮膚中膠原蛋白含量上的效用之數據圖。由圖8可見，與對照組相較之下，實驗組所測得的膠原蛋白相對百分比有顯著的提升。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物確實可提升皮膚中膠原蛋白含量，藉此達到美肌的功效。
本實驗是參考FastinTM彈力蛋白分析套組(FastinTM Elastin Assay kit)的使用者操作指南來進行。首先，以添加有10%胎牛血清(FBS)、1%青黴素/鏈黴素及1mM丙酮酸鈉的最低必需培養基(MEM)(Gibco)培養人類皮膚纖維母
細胞CCD-966SK(ATCC® CRL-1881)於6-孔盤，2mL培養基的細胞濃度為1×105細胞/孔，接而於37℃進行培養24小時。
接著，將經培養的細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將實施例1得到的西印度櫻桃果實的萃取物以培養基稀釋為具有0.25mg/mL濃度的稀釋液，繼而添加2mL的該稀釋液至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則添加2mL的培養基。在培養各組細胞48小時後，移除培養基並以1X PBS清洗一次。接著，對各組細胞處理胰蛋白酶(trypsin)3分鐘，然後以培養基終止胰蛋白酶活性並轉移至1.5mL體積的試管中。之後，透過胰蛋白酶收取細胞並轉移至1.5mL體積的微量離心管中，然後以300 xg離心5分鐘。接著，將細胞沉澱物保留在大約300μL的PBS(Gibco)中，然後對300μL的細胞懸浮液加入100μL的1.0M草酸(oxalic acid)，並在100℃的加熱儀中作用1小時。之後，對每個試管加入等體積的彈力蛋白沉澱試劑(Elastin Precipitating Reagent)，蓋上試管並短暫渦旋混合，靜置15分鐘以完成沉澱。接著，以10,000 xg離心10分鐘，然後排出試管的液體內容物，透過將倒置的試管輕拍到紙巾上，以除去試管中剩餘的大部分流體。
接著，添加1mL的染料試劑，透過顛倒試管來混合內容物，然後將試管放在機械振盪器上作用90分鐘。之後，排出試管中未結合的染料。彈力蛋白-染料複合物可以觀察到為在試管的底部和內部下壁中的紅棕色沉積物。接著，對每個試管中加入250μL的染料解離試劑，然後蓋上試管，藉由渦旋混合器將染料釋放到溶液中，確保所有結合的染料都已進入溶液。之後，將每個試管的內容物轉移到96孔盤中，並將盤放入ELISA讀取儀中，在513nm下測量吸光值。本實施例的結果顯示於圖9。
圖9是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在提升皮膚中彈力蛋白含量上的效用之數據圖。由圖9可見，與對照組相較之下，實驗組所測得的彈力蛋白含量有顯著的提升。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物確實可提升皮膚中彈力蛋白含量，藉此達到美肌的功效。
收取已分化之脂肪細胞OP9(ATCC® CRL-2749TM)培養基(條件培養基，其會誘發脂肪細胞發炎，分泌發炎因子)備用。在96孔盤每孔種1 X 104顆RAW264.7(ATCC® TIB-71TM)，於37℃培養箱培養24小時後，將原培養基吸除，置換成脂肪細胞條件培養基，以每200μL加到96孔盤中，並同時處理待測樣品。
之後，將OP9細胞分成3組，其中包括1個實驗組、1個病理對照組及1個空白對照組。實驗組及病理對照組的細胞被處理以OP-9條件培養基，俾以誘發發炎反應。接著，將0.25mg/mL西印度櫻桃果實的萃取物添加至實驗組的細胞中，而空白對照組的細胞則被添加DMEM(Gibco)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)及4mM L-麩醯胺酸(L-glutamine)(Gibco)。放回37℃培養箱反應18小時後，每孔取出150μL移至新的96孔盤中，再每孔加入130μL的ddH2O，接著加入革利士試劑套組(Griess Reagent Kit)(Invitrogen)中的A劑及B劑各10μL到每孔中，於室溫反應30分鐘，最後使用全光譜光學分析儀量(BioTek)測波長548nm下的吸光值。
圖10是本發明西印度櫻桃果實的萃取物在抑制脂肪細胞導致的慢性發炎上的功效之數據圖。由圖10可見，與空白對照組相較之下，病理對照組的發炎程度(NO含量)有顯著提升，這表示脂肪細胞會誘發發炎反應。而與病理對照組相較之下，實驗組的發炎程度(NO含量)有顯著降低(降低8.5%)。本實施例的結果顯示，本發明西印度櫻桃果實的萃取物可有效抑制脂肪細胞導致的慢性發炎，藉此達到抗發炎的功效。
綜上所述，本發明西印度櫻桃果實的萃取物可藉由抑制α-澱粉酶活性、抑制脂肪酶活性、提升瘦體素含量、抑制藍光損傷所誘發的皮膚黑色素生成、提升皮膚中膠原蛋白含量、提升皮膚中彈力蛋白含量、抑制脂肪細胞導致的慢性發炎、及降低ROS表現量，達到調控體重、美肌、抗發炎及抗老化的功效。另一方面，西印度櫻桃果實的萃取物可有效預防三高，適合開發作為美肌與體重管理之產品。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
Claims (7)
- 一種西印度櫻桃(Malpighia glabra)果實的萃取物用於製備一調控體重、美肌、抗發炎及抗老化之組成物的用途，其中該西印度櫻桃果實的萃取物是以水作為一萃取溶劑對該西印度櫻桃果實進行萃取而製得，其中該西印度櫻桃果實與該萃取溶劑的體積比例介於1~5：5~20，且萃取的溫度介於75℃至95℃，其中該調控體重包括抑制α-澱粉酶(α-amylase)活性、抑制脂肪酶(lipase)活性及提升瘦體素(leptin)含量，其中該西印度櫻桃果實為西印度櫻桃開花後25~35天之果實。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該西印度櫻桃果實的萃取物的有效濃度為至少0.0625mg/mL。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該美肌包括抑制皮膚黑色素生成、提升皮膚的膠原蛋白含量及提升皮膚的彈力蛋白含量。
- 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中該皮膚黑色素生成為藍光損傷所誘發的皮膚黑色素生成。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該抗發炎為抑制脂肪細胞導致的慢性發炎。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該抗老化為降低活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)表現量。
- 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該組成物是一醫藥品、一食品產品或一保養品。
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| Tarun Belwal et al., "Phytopharmacology of Acerola (Malpighia spp.) and its potential as functional food", Trends in Food Science & Technology 74 (2018) 99–106. |
| Tarun Belwal et al., "Phytopharmacology of Acerola (Malpighia spp.) and its potential as functional food", Trends in Food Science & Technology 74 (2018) 99–106. Roberta da Silva Nunes et al., "Antigenotoxicity and Antioxidant Activity of Acerola Fruit (Malpighia glabra L.) at Two Stages of Ripeness", Plant Foods Hum Nutr (2011) 66:129–135. * |
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