TWI840027B

TWI840027B - 金針花萃取物用於製備提升抗醣化活性組成物的用途

Info

Publication number: TWI840027B
Application number: TW111148806A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2024-04-21
Also published as: TW202313089A

Abstract

一種金針花萃取物用於製備提升抗醣化活性組成物的用途，金針花萃取物是以溶劑萃取金針花( Hemerocallis fulvaLinn.)所獲得，溶劑為水、醇、或醇水混合物。

Description

金針花萃取物用於製備提升抗醣化活性組成物的用途

一種金針花萃取物的用途，尤其是金針花萃取物用於製備提升抗醣化活性組成物的用途。

脂肪為人體內的必要成分，但過度的脂肪成分對人體會造成損害。國家經濟愈來愈起飛的國家，肥胖(又稱為代謝症候群)問題只增不減，因此以亞洲區來看，中國會是下一波肥胖問題增加幅度大幅上升的國家。

另外，台灣目前已成為為「亞洲第一胖」的國家，18歲以上國民中，男性體重過重之比例為51.1%，女性體重過重之比例為35.8%，且比例還在上升中，甚至體重過重的年齡層也是逐年下降，中小學生體重過重的比例已上升至25%以上，是全球排名第八高的區域。因此肥胖是目前亟需解決的問題。

除此之外，醣化反應(glycation)與皮膚與體內老化相關，更與危害國人健康甚巨的糖尿病有關。醣化反應的本質就是梅納反應(Maillard reaction)或稱為羰胺褐變反應(carbonyl-amine browning)，這是糖的醛(酮)基與含胺基物質(例如蛋白質、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸或上述之衍生物)的胺基之間的一種非酵素性醣化(nonenzymatic glycosylation；glycation)反應。長期處於高血糖症狀下，會引起葡萄糖自動氧化與蛋白質糖化作用，形成高度醣化終產物(advanced glycation end products, AGEs)。而AGEs更可引起多種老化疾病，例如皮膚皺紋、白內障、粥狀動脈硬化、腎臟衰竭等。

近年來，為憂鬱症所苦之人數正增加中。此外，若包含未顯現精神症狀之所謂假性憂鬱症，則其人數增加到相當高之比例。

憂鬱症之原因現今仍未明確了解，惟不限於生物學因素、性格因素。例如：現代社會環境之激烈變化、捨棄弱者之社會構造、受單一價值觀所支配而排除異端之風潮等被認為與憂鬱症患者之增加脫不了關係。

憂鬱症之治療可舉例如：首先多休養、其次藥物治療、或者組合兩者。然而，在現實情況中並不輕易允許休養等，而實際上多以抗憂鬱劑掩飾。

皮膚是保護人類個體的最大屏障，它具有對抗水分散失、病原菌以及各種環境損害之功能。暴露於大量的紫外線(ultraviolet, UV)、游離輻射(ionizing radiation)、藥物或異生物質(xenobiotics)會促使皮膚生成活性氧族(reactive oxygen species, ROS)以及自由基(free radicals)。當所累積的活性氧族以及自由基的數量超過細胞或組織本身的抗氧化能力時，便會形成氧化性壓力(oxidative stress)。接著，活性氧族以及自由基會與細胞內的組成物(包括DNA、蛋白質以及脂質等)相反應，進而對皮膚產生非所欲的影響。

黑色素生成(melanogenesis)(亦即黑色素合成(melanin synthesis))是指當皮膚黑色素細胞(dermal melanocyte)在受到環境因素(諸如紫外線(ultraviolet, UV))或生理因素(諸如疲勞(fatigue)、壓力(stress)、慢性發炎(chronic inflammation)以及體內不正常的α-促黑素細胞素(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)的釋放)的誘發之後，在黑色素細胞內的酪胺酸(tyrosine)經由酪胺酸酶(tyrosinase)的催化(它是黑色素生成的速率-限制步驟(rate-limiting step))以及一系列的氧化還原反應而被轉化為黑色素(melanin)的過程。黑色素可以保護皮膚的下皮層(hypodermis)免於紫外線所造成的光損害(photodamage)，但是當黑色素被大量地累積於皮膚上或不正常地分佈時可能會導致皮膚疾病(skin disorders)，諸如雀斑(lentigines)、斑點(freckle)、黑皮病(melasma)、老人斑(age spots)以及色素過多(hyperpigmentation)等。

為了達到皮膚美白(skin whitening)的目的，目前已有許多黑色素生成抑制劑(melanogenesis inhibitors)被使用來淡化或去除累積於皮膚上的黑色素或是黑斑，而這些黑色素生成抑制劑大多是經由下列的作用機制來調控黑色素的生成：(1)在黑色素生成之前：例如抑制酪胺酸酶的mRNA轉錄(mRNA transcription)(諸如C2-神經醯胺(C2-ceramide)、維生素A酸(tretinoin)以及香草酸(vanillic acid))與醣化(glycosylation)(諸如泛硫醇磺酸鈣(calcium D-pantetheine-S-sulfonate, PaSSO3Ca))；(2)在黑色素生成的期間：例如抑制酪胺酸酶的活性(諸如對苯二酚(hydroquinone)、熊果苷(arbutin)以及麴酸(kojic acid))、加速酪胺酸酶的降解(degradation)(諸如亞麻油酸(linoleic acid)以及苯硫脲(phenylthiourea))，以及促進多巴醌(dopaquinone)的還原(reduction)(諸如抗壞血酸(ascorbic acid))；以及(3)在黑色素生成之後：例如促進黑色素分解(諸如亞麻油酸(linoleic acid))、抑制黑色素體運輸(melanosome transfer)(諸如菸鹼醯胺(Niacinamide)以及絲胺酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor))，以及加速皮膚更新(turnover)(諸如甘草甙(liquiritin)以及乙醇酸(glycolic acid))。

近年來，人類對於皮膚美白與保養的需求與日俱增，然而目前所使用的黑色素合成抑制劑在淡化或去除黑色素上的效果仍不盡理想。此外，目前常見用來解決黑色素生成問題的方式大多為利用塗抹於皮膚表面的醫藥品或保養品。

腦血管病變目前佔台灣死亡率第二，即使腦中風病變輕微，也使病患及家屬經濟上及精神上產生極大的負擔，中風主要的病因是因血管栓塞造成腦組織缺血，使局部神經元因缺血而缺氧以至死亡。目前已經了解部份中樞神經損傷死亡的病理機轉是腦缺血/缺氧後，神經元的能源供應系統受到干擾，大量釋出神經傳導素(麩氨酸)，經由活化NMDA接受器影響鈣離子恆定系統，產生自由基及一氧化氮，導致細胞二度的傷害。最進幾年的研究更發現氧化產生的自由基也是重要的神經細胞死亡原因，也發現了許多抗氧化基因及反應機制。

另一方面，粒線體(mitochondria)亦被稱為細胞的發電站，因為它是細胞內合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)(一種傳遞能量的分子)的主要場所，為細胞的各項活動提供了化學能量。粒線體若損壞，對細胞以及生物個體的影響甚鉅。粒線體在合成ATP的過程中會產生很多的自由基，自由基的活性極強，會與體內任何物質發生強烈的氧化反應而破壞其正常功能。自由基日積月累地傷害粒線體內的酵素與DNA，漸漸地使其功能下降進而使各器官組織的功能衰退。因此，如何提升神經細胞的粒線體活性，進而提升神經細胞的抗氧化能力以達到保護神經之效用，成為本領域的重要課題。

然而，目前用來解決上述問題的醫藥品、食品產品或保養品大多由化學成分所製成，長期使用不但對人體健康有害無益，且這些產品往往價格昂貴，並非為一般使用者所能負擔。為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出具有提升抗醣化活性、抑制細胞脂肪堆積、促進脂肪分解、提升骨骼肌基礎代謝率、抗憂鬱、抑制黑色素生成、提升皮膚抗紫外線能力、提升超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、降低ROS表現量、提升粒線體活性、及提升抗氧化能力的功效之新穎醫藥品、食品產品或保養品以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明提供一種金針花萃取物用於製備提升抗醣化活性組成物的用途，其中該金針花萃取物是以溶劑萃取金針花( Hemerocallis fulvaLinn.)所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物。

在一些實施例中，金針花萃取物具有抑制D-果糖使膠原蛋白產生醣化的作用。

在一些實施例中，金針花萃取物具有減少高度醣化終產物生成量的作用。

在一些實施例中，金針花萃取物具有避免體內功能性蛋白質變性的作用。

在一些實施例中，組成物是醫藥品、食品產品或保養品。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以史徒登氏t-檢定(student's t-test)分析。

依據本發明，金針花( Hemerocallis fulvaLinn.)又稱萱草、忘憂草或黃花菜，是百合科( Liliaceae)萱草屬( Hemerocallis)的多年生草本植物，株高約60~80 cm，地下根部多肉質；葉自根部簇生，呈線形狹長，可及 80 cm。金針花可供食用及藥用，具有治水腫、小便不利、淋濁、帶下、黃疸及便血之功效。

如本文中所使用的，用語「抑制黑色素生成(inhibition of melanogenesis)」與「抑制黑色素合成(inhibition of melanin synthesis)」、「去色素(depigmenting)」、「淡化黑色素(lightening the melanin)」、「美白(whitening)」、「膚色淡化(skin color lightening)」、「漂白(bleaching)」、「淨白」、「增白(brightening)」、「退黑」以及「驅黑」可被交換地使用。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum, jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P (carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

實施例1.金針花萃取物的製備

首先，對金針花(由花蓮玉里農民栽種)由乾料進行均質處理，然後於50~100℃下，以萃取溶劑對經均質處理的金針花以5~20：1~5的體積比進行萃取0.5~3小時而得到一粗萃取物，其中萃取溶劑是水、醇類、含水醇類或其組合，較佳的萃取溶劑是水。接著，冷卻至室溫，然後對粗萃取物以400網目(mesh)的濾網過濾而得到一濾液，然後於45~70℃下對濾液進行減壓濃縮而得到金針花萃取物。

實施例2.金針花萃取物在抗醣化上的效用評估

本實施例係為了測試本發明金針花萃取物的抗醣化活性，因此以抑制D-果糖(D-fructose)使膠原蛋白(Collagen)產生醣化的效率，進行醣化活性之定量。首先，分別取0.2 mL之水作為對照組，或取0.2 mL之濃度為100 mg/mL之本發明金針花萃取物作為實驗組，加入0.2 mL之含有0.06%之NaN3的60 mg/ mL之膠原蛋白溶液(以200 mM之磷酸鈉緩衝液配製，pH 7.4)，並與0.2 mL的1.5M D-果糖(以200 mM之磷酸鈉緩衝液配製，pH 7.4)溶液均勻混合，取出0.1 mL混合溶液作為原點產物，並將剩餘的混合溶液於50℃下反應24小時後，取出0.1 mL作為終點產物，再分別測量原點產物與終點產物於激發波長360 nm、放射波長460 nm的螢光數值。最後，以下列公式計算清除高度醣化終產物(Advanced glycation end-products, AGEs)能力之效率，以代表其抗醣化作用的活性，其中高度醣化終產物生成量越少表示抗醣化活性越高。

本實施例的結果顯示於圖1，抑制非酵素褐變，避免體內功能性蛋白質變性。圖1是本發明金針花萃取物在抗醣化上的功效之數據圖。由圖1可見，與對照組相較之下，實驗組的醣化比例百分比有顯著的降低。其中，與對照組比較，實驗組的醣化比例百分比減少約56%。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物能有效提升其清除高度醣化終產物之能力，並具有優異的抗醣化活性。

實施例3.金針花萃取物在抑制脂肪堆積上的效用評估

本實施例以小鼠骨髓基質細胞(bone marrow stromal cell)進行本發明之金針花萃取物於抑制脂肪堆積之功效測試。該小鼠骨髓基質細胞係購自美國典型培養物保藏中心(美國ATCC ^®)，編號CRL-2749 ^TM。該細胞於分化前係培養於前脂肪細胞擴增培養液(Pre-adipocyte Expansion Medium)，其中包含90%之最低必需培養基Alpha培養基(minimum essential medium alpha medium，購自Gibco，美國，12100-046)、20%之胎牛血清 (Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國)，且加入1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國)；並使用分化培養液(Differentiation Medium)使小鼠骨髓基質細胞進行分化，其中包含90%最低必需培養基Alpha培養基、20%之胎牛血清，且加入1%之青黴素/鏈黴素。細胞中的脂質以油紅O染色試劑(購自Sigma，美國)，其中以100%之異丙醇配製3 mg/mL的油紅O儲備溶液，並將儲備溶液以ddH2O配製成60%的作用溶液。

為證實本發明之金針花萃取物具有抑制脂肪堆積的功效，首先將小鼠骨髓基質細胞分化成脂肪細胞，首先，將8×10 ⁴小鼠骨髓基質細胞OP9與500 µL的前脂肪細胞擴增培養液接種於24孔培養盤中，並於37℃下培養7天，每3天更換新鮮的分化培養基。接著，使用顯微鏡(ZEISS)觀察脂滴(lipid droplet)的形成，確保細胞已完全分化。

之後，將OP9細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將0.25 mg/mL金針花萃取物添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則不做任何處理。接著，將各組細胞培養7~10天，每3天更換培養基。

接著，使用油紅O將細胞內的脂質染色，以評估本發明金針花萃取物是否確實能減少脂肪堆積，首先將培養基輕輕地取出，並以1 mL之磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline, PBS)清洗細胞兩次，再加入1 mL之10%甲醛(購自Echo chemical，台灣，Cat. TG1794-4-0000-72NI)並於室溫下反應30分鐘以固定細胞，接著移除甲醛後以1 mL之PBS輕輕地清洗細胞兩次，接著於每孔細胞內加入1 mL之60%異丙醇(購自Echo chemical，台灣，PH-3101)反應1分鐘後，移除異丙醇並加入1 mL之油紅O作用溶液，於室溫下反應1小時，接著移除油紅O作用溶液並迅速地以1 mL之60%異丙醇進行脫色5秒鐘，再使用顯微鏡拍照並進行量化。接著，加入100%異丙醇於染色之細胞中，並置於振盪器上反應10分鐘以溶解油滴，接著取100 μL至96孔培養盤中，以測量ELISA讀取儀(BioTek)讀取各組之OD510 nm讀值，以量化油紅O。

本實施例的結果顯示於圖2。圖2是本發明金針花萃取物在抑制脂肪堆積上的功效之數據圖。由圖2可見，與對照組相較之下，實驗組的相對脂肪油滴量有降低的情形。其中，與對照組比較，實驗組的相對脂肪油滴量減少約15%。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有抑制細胞脂肪堆積的功效。

實施例4.金針花萃取物在促進脂肪分解上的效用評估

首先，將8×10 ⁴小鼠骨髓基質細胞(bone marrow stromal cell) OP9 (ATCC ^®CRL-2749™)與500 µL的脂肪前細胞擴增培養基(pre-adipocyte expansion medium)(添加有90%最低必需培養基Alpha培養基(minimum essential medium alpha medium)(Gibco)、20%胎牛血清(fetal bovine serum)(Gibco)及1%青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)(Gibco))接種於24孔培養盤中，並於37℃下培養7天，每3天更換新鮮的分化培養基(differentiation medium)(添加有90%最低必需培養基Alpha培養基、20%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素)。接著，使用顯微鏡(ZEISS)觀察油滴(lipid droplet)形成以確認細胞完全分化。

之後，將OP9細胞分成2組，其中包括對照組及實驗組。將0.0625 mg/mL金針花萃取物添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則不做任何處理。接著，將各組細胞培養7~10天，每3天更換培養基。之後，以細胞甘油基測定試劑盒(Glycerol cell-based assay kit)(Cayman)對各組細胞進行甘油分析(glycerol assay)。

從每個孔收集細胞培養上清液，然後將每個孔及標準液中的25 μL的細胞培養上清液轉移到新的96孔培養盤中。接著，每孔添加100 μL重組游離甘油分析試劑(reconstituted Free Glycerol Assay Reagent)，然後於室溫下作用15分鐘。之後，以ELISA讀取儀(BioTek)讀取各組之OD _{540 nm}讀值。

本實施例的結果顯示於圖3。圖3是本發明金針花萃取物在促進脂肪分解上的功效之數據圖。由圖3可見，與對照組相較之下，實驗組的脂肪分解百分比有顯著的提升。其中，與對照組比較，實驗組的脂肪分解百分比提升約10%。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有促進脂肪分解的功效。

實施例5.金針花萃取物在提升骨骼肌基礎代謝率上的效用評估

本實施例以小鼠骨骼肌細胞C2C12進行本發明之金針花萃取物於提升骨骼肌基礎代謝率之功效測試。該小鼠骨骼肌細胞C2C12是購自美國典型培養物保藏中心(美國ATCC ^®)，編號CRL-1772TM。

首先，將細胞培養於添加有3.7 g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Gibco)、100 I.U.青黴素及100 μg/mL鏈黴素的杜貝可氏改良的依格氏培養基(DMEM)中，接而將細胞接種於6孔細胞培養盤中。待細胞接近100%匯聚，將細胞與條件培養基(含有1% FBS及1%馬血清的DMEM)一起培養，俾以將細胞分化成肌管(myotube)。

之後，將經分化的細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將0.0625 mg/mL金針花萃取物添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則不做任何處理。接著，對各組細胞培養48小時。之後，每孔用100 μL的丙酮酸分析緩衝液來裂解細胞，然後在4°C以10,000 g進行離心10分鐘，並收集上清液。接著，在96孔培養盤中加入20 μL的裂解液(三重複)，然後用丙酮酸分析緩衝液將體積調整至50 μL/孔。之後，製作標準曲線以供丙酮酸比色測定(colorimetric assay)(BioVision)，將丙酮酸標準品稀釋至1 nmol/μL，然後製備0、2、4、6、8、10 nmol/孔，總共50 μL/孔。接著，對每孔中加入50 μL的反應混合物(含有46 μL的丙酮酸分析緩衝液、2 μL的丙酮酸探針及2 μL的酵素混合物)，充分混合並反應30分鐘。之後，在570 nm下測量吸光值，然後利用線性內插法(linear interpolation)計算丙酮酸含量。最後，將每個樣品的總蛋白質濃度標準化(布拉德福分析(Bradford assay))(Bio-Rad)。

本實施例的結果顯示於圖4。圖4是本發明金針花萃取物在提升骨骼肌基礎代謝率上的功效之數據圖。由圖4可見，與對照組相較之下，實驗組的相對丙酮酸濃度有顯著的提升。其中，與對照組比較，實驗組的相對丙酮酸濃度提升約80%。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有提升骨骼肌基礎代謝率的功效。

實施例6.金針花萃取物在抗憂鬱上的效用評估

本實施例藉由探討金針花萃取物可否藉由調控與抑制憂鬱及促進多巴胺相關的基因表現來達到抗憂鬱之功效。

於DMEM培養基(含有10%胎牛血清及1%之青黴素/鏈黴素)中培養人類神經瘤母細胞(SH-SY5Y；購自(ATCC ^®CRL-2266™))於6-孔盤，2 mL培養基的細胞濃度為1.5 × 10 ⁵細胞/孔。

之後，將細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將0.5 mg/mL金針花萃取物添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則不做任何處理。接著，於培養箱中培養各組細胞48小時，接而收取各組細胞培養物並拿來進行基因表現分析。

在本實施例中，用來分析與抑制憂鬱相關的基因為有絲分裂原-活化蛋白質激酶去磷酸化酶-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase 1, MKP-1)基因，與促進多巴胺相關的基因為多巴去羧酶(dopa decarboxylase, DDC)基因。

以RNA萃取套組(Geneaid)對上面所得到的各組細胞培養物進行RNA的萃取。對由此所得到的各組RNA取2,000 ng並以SuperScript® III反轉錄酶(Invitrogen)將萃取出的RNA反轉錄為cDNA。接著，以cDNA作為模版，並且使用用來擴增標的基因的引子對，包括MKP-1、DDC及GAPDH (作為內部對照組)，它們的核苷酸序列顯示於下表1，在StepOne Plus即時PCR系統(ABI)中利用KAPA SYBR FAST qPCR套組(2x)(KAPA Biosystems)來進行定量即時PCR，俾以對標的基因進行擴增及定量。PCR產物的熔化曲線是在定量即時PCR反應期間進行確認。

表1

標的基因	SEQ ID NO.#	引子名稱	序列(5'--＞3')	PCR產物大小(bp)
MKP-1	1	MKP1-F	CAGAGCCCCATTACGACCTC	117
2	MKP1-R	CCAGAGGAACTCGGGTGAAG
DDC	3	DDC-F	ACCACAACATGCTGCTCCTTT	81
4	DDC-R	ATCAACGTGCAGCCATATGTCT
GAPDH	5	GAPDH-F	CTGGGCTACACTGAGCACC	101
6	GAPDH-R	AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG

標的基因的相對表現量是推導自方程式2 ^- ^△△ ^Ct，並利用GAPDH基因(作為內部對照組)及基準基因的循環閾值及藉由標準差來計算相對倍數變化，其中△Ct=Ct _目標基因 _/ _基準基因-Ct _GAPDH，△△Ct=△Ct _目標基因-△Ct _基準基因，倍數變化=2 ^- ^△△ ^Ct平均值。以對照組的標的基因表現量作為1的比較基準。各組之間的統計學顯著差異是藉由單尾史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖5及圖6。

圖5是本發明金針花萃取物在抑制與抑制憂鬱相關的MKP-1基因表現上的功效之數據圖。由圖5可見，與對照組相較之下，實驗組的基因相對表現量有顯著的降低，其中與對照組比較，實驗組的基因相對表現量降低約16.5%。圖6是本發明金針花萃取物在提升與促進多巴胺相關的DDC基因表現上的功效之數據圖。由圖6可見，與對照組相較之下，實驗組的基因相對表現量有顯著的提升，其中與對照組比較，實驗組的基因相對表現量提升約10%。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物可藉由調控與抑制憂鬱及促進多巴胺相關的基因表現來達到抗憂鬱及改善情緒之功效。

實施例7.金針花萃取物在抵抗及防禦UVA能力上的效用評估

首先，將人類皮膚纖維母細胞(human skin fibroblast) CCD-966Sk (對應於ATCC® CRL-1881)培養於最低基本培養基(minimum essential medium)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1%青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)以及1 mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)](Gibco)中。於96孔培養盤的每孔中加入200 µL的培養基，使每孔具有5 x 10 ³個人類皮膚纖維母細胞。在37℃下培養24小時後，移除培養基。

之後，將人類皮膚纖維母細胞分成3組，其中包括1個實驗組、1個UVA組及1個對照組。實驗組及UVA組的細胞是藉由使用紫外線輻射室於15 J/cm2下對細胞照射UVA歷時1小時，此條件會造成50%致死劑量(lethal dose 50%, LD ₅₀)，表示導致50%細胞死亡的輻射照射劑量。接著，將1 mg/mL金針花萃取物添加至實驗組的細胞中，而UVA組的細胞則不做任何處理。至於對照組的細胞則未照射UVA。

各組細胞培養物在37℃培養箱中進行培養24小時後，於每孔加入15 µL的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物{3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide}(MTT，4 mg/mL，配於PBS)(AMERSCO/0793-5G)並於37℃下予以培養4小時。之後，移除各孔中的培養基，繼而於每孔加入50 µL的DMSO (ECHO/DA1101-000000-72EC)以分解甲臢結晶(formazan crystal)，接而將培養盤置於振盪器(shaker)上並培育10分鐘，然後於570 nm的波長下以ELISA讀取儀(BioTek)來讀取各孔的吸光值(OD ₅₇₀)。

細胞可活性(%)是藉由將所測得的吸光值(OD ₅₇₀)代入下列公式(1)而計算出：

細胞可活性(%)=(各組所測得的OD ₅₇₀吸光值/對照組所測得的OD ₅₇₀吸光值)×100% (1)

各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖7。

圖7是本發明金針花萃取物在抵抗及防禦UVA能力上的功效之數據圖。由圖7可見，與對照組相較之下，UVA組的細胞可活性(%)有降低的情形，這表示對人類皮膚纖維母細胞照射UVA會造成細胞死亡。而與UVA組相較之下，實驗組的細胞可活性(%)有顯著的提升(與UVA組比較，實驗組的細胞可活性提升約8%)。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有抵抗及防禦UVA損傷的能力，並提升皮膚細胞抗紫外線能力。

實施例8.金針花萃取物在抑制黑色素生成上的效用評估

首先，將老鼠皮膚黑色素瘤細胞株B16F10 (對應於ATCC CRL-6475)培養於杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)[添加有1%青黴素/鏈黴素(Gibco)及10% FBS (Gibco)]中。於6孔培養盤的每孔中加入3 mL的培養基，使每孔具有1.5 x 10 ⁵個B16F10細胞。在37℃下培養24小時後，移除培養基。

之後，將B16F10細胞分成2組，其中包括1個實驗組以及1個對照組。將0.5 mg/mL金針花萃取物添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則不做任何處理。

各組細胞培養物在37℃下培養48小時後，移除培養基並以1xPBS (Gibco)沖洗兩次。之後，加入胰蛋白酶(trypsin)來處理細胞3分鐘並將懸浮的細胞收集於15 mL體積的離心管中，接而以400xg/5分鐘進行旋轉(spin)以沉澱細胞。在以1xPBS沖洗兩次之後，以200 µL的1XPBS再懸浮細胞沉澱物(cell pellet)。接著，將細胞溶液於液態氮中放置10分鐘，接而於室溫下靜置30分鐘進行解凍。在解凍完全之後，以12,000xg進行旋轉30分鐘，接而移除上清液並添加120 µL的1 N NaOH (配於ddH ₂O)。在混合均勻之後，於60℃乾浴槽中靜置1小時。之後，取100 µL的體積至96孔培養盤中並於450 nm的波長下以ELISA讀取儀來讀取各孔的吸光值(OD ₄₅₀)。

黑色素含量(%)是藉由將所測得的吸光值(OD ₄₅₀)代入下列公式(2)而計算出：

黑色素含量(%)=(各組所測得的OD ₄₅₀吸光值/對照組所測得的OD ₄₅₀吸光值)×100% (2)

各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖8。

圖8是本發明金針花萃取物在抑制黑色素生成上的功效之數據圖。由圖8可見，與對照組相較之下，實驗組的黑色素含量有顯著的降低(與對照組比較，實驗組的黑色素含量降低約11%)。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有抑制黑色素生成的功效。

實施例9.金針花萃取物在提升皮膚纖維母細胞之超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性上的效用評估

人類皮膚纖維母細胞購自台灣生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，編號BCRC 60153。將該細胞培養於添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、0.1 mM非必需胺基酸、1.5 g/L碳酸氫鈉(Sigma公司，編號 S5761，美國)、1 mM丙酮酸鈉(GIBCO公司，編號11360-070，美國)的最低必需培養液(Minimum essential medium, MEM)(Eagle)(配於厄爾平衡鹽溶液(Earle's Balanced Salt Solution, Earle's BSS))(GIBCO公司，編號41500-034，美國)。

在含有2 mL上述培養基的6孔培養盤中每個孔洞接種2 × 10 ⁵個人類皮膚纖維母細胞，然後於37℃培養隔夜。在移除培養基之後，將細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將0.5 mg/mL金針花萃取物及1 mM H ₂O ₂添加至實驗組的細胞中並於37℃作用6小時，至於對照組的細胞則不做任何處理。接著，將各組細胞於37℃下培養24小時。之後，移除培養基並以1X PBS (Gibco)清洗1次，然後加入胰蛋白酶(trypsin)來處理細胞3分鐘，繼而用培養基停止胰蛋白酶活性並轉移至1.5 mL離心管中。接著，以300xg離心5分鐘，然後以PBS清洗，接而以300xg離心5分鐘。之後，加入30 μL之1X細胞萃取緩衝液，然後將細胞懸浮液在冰上反應30分鐘，每10分鐘渦旋(vortex)混合。接著，將破碎的細胞懸浮液在4℃以10,000xg離心10分鐘以除去不溶物質，然後將25 μL的1X SOD緩衝液加入活性對照孔的底部。之後，添加25 μL製備的SOD標準品(S1~S7，參見表2)。

表2

	1X SOD溶液
S1	248	2 μL的SOD標準品
S2	100	100 S1
S3	150	100 S2
S4	100	100 S3
S5	100	100 S4
S6	150	100 S5
S7	100	100 S6

之後，將25 μL的樣品加入適當孔的底部，然後對每孔添加150 μL的Master Mix。接著，使用多道移液器(multichannel pipet)向所有孔中加入25 μL之1X黃嘌呤溶液(Xanthine solution)以起始反應，然後立即將培養盤轉移至微量滴定盤讀取儀(microtiter plate reader)，並在室溫下每分鐘以450 nm讀取吸光值，持續10分鐘。

各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖9。

圖9是本發明金針花萃取物在提升皮膚纖維母細胞之SOD活性上的功效之數據圖。由圖9可見，與對照組相較之下，實驗組的SOD活性有顯著的提升(與對照組比較，實驗組的SOD活性提升約30.7%)。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有提升皮膚纖維母細胞之SOD活性的功效。

實施例10.金針花萃取物在降低皮膚纖維母細胞之活性氧族(reactive oxygen species, ROS)表現量上的效用評估

首先，以添加有10%胎牛血清(FBS)、1%青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)及1 mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)的最低必需培養基(MEM)(Gibco)培養人類皮膚纖維母細胞CCD-966SK (BCRC 60153)於6-孔盤，2 mL培養基的細胞濃度為2 × 10 ⁵細胞/孔，接而於37℃進行培養24小時，並移除培養基。接著，將經培養的細胞分成3組，其中包括1個對照組、1個過氧化氫組，及1個實驗組。將1 mg/mL金針花萃取物及1 mM H ₂O ₂添加至實驗組的細胞中。過氧化氫組的細胞被添加以1 mM H ₂O ₂，至於對照組的細胞則不做任何處理。之後，添加5 μg/mL二氯二氫螢光黃二乙酸酯(Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFH-DA) (Sigma/SI-D6883-50MG)(儲備溶液為5 mg/mL溶於DMSO中)並於37℃反應1小時，接而以1 mL的1X PBS (Gibco)清洗每孔兩次。接著，添加200 μL胰蛋白酶(trypsin)並於避光環境反應5分鐘，接而將細胞培養物收集至1.5 mL體積的離心管，並以400 × g進行離心10分鐘。之後，移除上清液並以1X PBS清洗一次，接而以400 × g進行離心10分鐘。接著，移除上清液並以1 mL的1X PBS再懸浮細胞沉澱物。之後，以流式細胞儀(BD Accuri)藉由激發波長(excitation wavelength) 450~490 nm及放射波長(emission wavelength) 510~550 nm來偵測DCFH-DA的螢光訊號，藉此計算出受到ROS傷害的細胞百分比。各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖10。

圖10是本發明金針花萃取物在降低皮膚纖維母細胞之ROS表現量上的功效之數據圖。由圖10可見，與對照組相較之下，過氧化氫組測得的受到ROS傷害的細胞百分比(即氧化壓力高表現細胞)有顯著提升，這表示過氧化氫會對細胞產生大量ROS傷害；而與過氧化氫組相較之下，實驗組測得的受到ROS傷害的細胞百分比有顯著降低(降低ROS表現量約47%)。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有降低皮膚纖維母細胞之ROS表現量的功效，藉此來改善膚質。

實施例11.金針花萃取物在提升神經細胞的粒線體活性上的效用評估

本實施例以小鼠大腦神經母細胞瘤細胞(Brain neuroblastoma) Neuro-2a進行神經細胞粒線體活性分析，並利用流式細胞儀粒線體膜電位偵測套組(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potential detection kit, BD)進行實驗。小鼠大腦神經母細胞瘤細胞Neuro-2a購自美國典型培養物保藏中心(美國ATCC ^®)，編號CCL-131 ^TM。將該細胞培養於添加10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)的DMEM。

在含有2 mL上述培養基的6孔培養盤中每個孔洞接種1 × 10 ⁵個大腦神經母細胞(n=2)。之後，將細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將1 mg/mL金針花萃取物添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則添加培養基。接著，將各組細胞於37°C下培養24小時，然後於37°C下預熱10X分析緩衝液。之後，以無菌的1X PBS製備1X分析緩衝液，混合均勻並置於37°C，然後添加130 μL的二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMSO)至凍乾JC-1粒線體染劑(BD™ MitoScreen (JC-1)試劑套組)以製備JC-1儲備溶液，儲備溶液可儲存於-20°C歷時6個月。接著，將JC-1粒線體染劑與1X分析緩衝液以1：100的比例製備工作溶液，然後移除培養基並以1XPBS潤洗兩次。之後，加入胰蛋白酶(trypsin)/EDTA處理3分鐘後，吸取懸浮的細胞至1.5 mL的微離心管，以400 g轉速離心5分鐘收集沈澱的細胞。

在移除上清液後，以1 mL的1X PBS再懸浮細胞，然後轉移至1.5 mL的離心管，以400 g轉速離心5分鐘。在移除上清液後，添加100 μL的JC-1工作溶液，混合均勻後在避光下作用15分鐘。之後，以400 g轉速離心5分鐘，再以1 mL的1X清洗緩衝液清洗並以400 g轉速離心5分鐘，然後以1 mL的1X清洗緩衝液清洗並以400 g轉速離心5分鐘。以含有2%FBS的500 μL之1X PBS再懸浮細胞，然後利用流式細胞儀(BD Accuri)分析觀察細胞凋亡時粒線體膜電位改變，並以Excel進行史徒登氏t-檢定統計分析樣品群體之間差異的統計學意義。

圖11是本發明金針花萃取物在提升神經細胞的粒線體活性上之效用的數據圖。由圖11可見，與對照組相較之下，實驗組的神經母細胞的粒線體活性(即相對的JC-1聚合體(aggregate))有顯著提升(與對照組比較，實驗組提升神經細胞粒腺體活性約13%)。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有提升神經細胞的粒線體活性之功效。

實施例12.金針花萃取物在提升神經細胞的抗氧化能力上的效用評估

本實施例以小鼠大腦神經母細胞瘤細胞(Brain neuroblastoma) Neuro-2a進行神經細胞的抗氧化能力分析。小鼠大腦神經母細胞瘤細胞Neuro-2a購自美國典型培養物保藏中心(美國ATCC ^®)，編號CCL-131 ^TM。以添加10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)的DMEM培養大腦神經母細胞Neuro-2a於6-孔盤，2 mL培養基的細胞濃度為1 × 10 ⁵細胞/孔，接而於37℃進行培養24小時，並移除培養基。接著，將經培養的細胞分成3組，其中包括1個對照組、1個過氧化氫組，及1個實驗組。將1 mg/mL金針花萃取物及1 mM H ₂O ₂添加至實驗組的細胞中並於37℃作用1小時。過氧化氫組的細胞被添加以1 mM H ₂O ₂並於37℃作用1小時，至於對照組的細胞則不做任何處理。之後，添加5 μg/mL二氯二氫螢光黃二乙酸酯(Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFH-DA)(Sigma/SI-D6883-50MG)(儲備溶液為5 mg/mL溶於DMSO中)並於37℃反應15分鐘，接而以1 mL的1X PBS (Gibco)清洗每孔兩次。接著，添加200 μL胰蛋白酶(trypsin)並於避光環境反應5分鐘，接而將細胞培養物收集至1.5 mL體積的離心管，並以400 × g進行離心10分鐘。之後，移除上清液並以1X PBS清洗一次，接而以400 × g進行離心10分鐘。接著，移除上清液並以1 mL的1X PBS再懸浮細胞沉澱物。之後，以流式細胞儀(BD Accuri)藉由激發波長(excitation wavelength) 450~490 nm及放射波長(emission wavelength) 510~550 nm來偵測DCFH-DA的螢光訊號，藉此計算出受到ROS傷害的細胞百分比。各組之間的統計學顯著差異是藉由史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖12。

圖12是本發明金針花萃取物在提升神經細胞的抗氧化能力上的功效之數據圖。由圖12可見，與對照組相較之下，過氧化氫組測得的受到ROS傷害的細胞百分比(即相對ROS產生量)有顯著提升，這表示過氧化氫會對細胞產生大量ROS傷害；而與過氧化氫組相較之下，實驗組測得的受到ROS傷害的細胞百分比有顯著降低(降低相對ROS產生量約73%)。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物具有提升神經細胞的抗氧化能力之功效。

實施例13.金針花萃取物在提升與神經細胞抗氧化相關的基因表現上的效用評估

本實施例藉由探討金針花萃取物可否藉由提升與神經細胞抗氧化相關的基因表現來達到提升神經細胞的抗氧化能力之功效。

於DMEM培養基(含有10%胎牛血清及1%之青黴素/鏈黴素)中培養小鼠大腦神經母細胞瘤細胞(Neuro-2a, 購自美國典型培養物保藏中心(美國ATCC ^®)，編號CCL-131 ^TM)於6-孔盤，2 mL培養基的細胞濃度為1.5 × 10 ⁵細胞/孔。

之後，將細胞分成2組，其中包括1個對照組及1個實驗組。將1 mg/mL金針花萃取物及200 μM H ₂O ₂添加至實驗組的細胞中，至於對照組的細胞則被添加以200 μM H ₂O ₂。接著，於培養箱中培養各組細胞6小時，接而收取各組細胞培養物並拿來進行基因表現分析。

在本實施例中，用來分析與神經細胞抗氧化相關的基因包括X射線修復交叉互補蛋白1 (X-ray repair cross complementary protein 1, XRCC1)基因、尿嘧啶DNA醣苷酶(uracil DNA glycosylase, UNG)基因、8-氧代鳥嘌呤DNA醣苷酶(8-oxoguanine DNA glycosylase, OGG1)基因、N-甲基化嘌呤DNA醣苷酶(N-methylpurine DNA glycosylase, MPG)基因、ERCC裁除式修復1，內核酸酶非催化次單元(ERCC excision repair 1, endonuclease non-catalytic subunit, ERCC1)基因、ERCC裁除式修復6，內核酸酶非催化次單元(ERCC excision repair 6, endonuclease non-catalytic subunit, ERCC6)基因、榖胱甘肽過氧化酶1 (glutathione peroxidase 1, GPX1)基因、mutL同源物1 (mutL homolog 1, MLH1)基因、黑色素細胞刺激素6 (melanocyte-stimulating hormone 6, MSH6)基因、超氧化物歧化酶1 (superoxide dismutase 1, SOD1)基因及超氧化物歧化酶2 (superoxide dismutase 2, SOD2)基因。

以RNA萃取套組(Geneaid)對上面所得到的各組細胞培養物進行RNA的萃取。對由此所得到的各組RNA取2,000 ng並以SuperScript ^®III反轉錄酶(Invitrogen)將萃取出的RNA反轉錄為cDNA。接著，以cDNA作為模版，並且使用用來擴增標的基因的引子對，包括 XRCC1 、 UNG 、 OGG1 、 MPG 、 ERCC1 、 ERCC6 、 GPX1 、 MLH1 、 MSH6 、 SOD1 、 SOD2及 GAPDH(作為內部對照組)，它們的核苷酸序列顯示於下表3，在StepOne Plus即時PCR系統(ABI)中利用KAPA SYBR FAST qPCR套組(2x)(KAPA Biosystems)來進行定量即時PCR，俾以對標的基因進行擴增及定量。PCR產物的熔化曲線是在定量即時PCR反應期間進行確認。

表3

標的基因	SEQ ID NO.#	引子名稱	序列(5'--＞3')	PCR產物大小(bp)
XRCC1	7	XRCC1-F	TTCTTCCAGGGCAAGCACTT	151
8	XRCC1-R	GATCCCATTCCTGTGCTGTGA
UNG	9	UNG-F	TTGATAGGAAGCGGCACCAT	151
10	UNG-R	GATCACAGCTCCTTCCAGTCAAT
OGG1	11	OGG1-F	CAAGCGACTCCACCCTCCTA	102
12	OGG1-R	GCCCTTTGGAACCCTTTCTG
MPG	13	MPG-F	TCCGGCGACTTCCTAATGG	201
14	MPG-R	CCCCCTGGCTGGAGATGT
ERCC1	15	ERCC1-F	GGAAGCTGGGCGGTACCT	150
16	ERCC1-R	AGGGTCTGACTGTCCGTTTTGTT
ERCC6	17	ERCC6-F	AACCGAGTGGCCCAGGAT	180
18	ERCC6-R	TGATGAAGGATGCTGCACAGA
GPX1	19	GPX1-F	CAGTCGGTGTATGCCTTCTCG	105
20	GPX1-R	GAGGGACGCCACATTCTCG
MLH1	21	MLH1-F	TAAAGCCTTGCGCTCACACAT	150
22	MLH1-R	GAGAAAGAAGAACACATCCCACAGT
MSH6	23	MSH6-F	GACCCCAGCCAGGAGACTATT	150
24	MSH6-R	CATCTTCTCAAATTCTCTTGCTTTTCT
SOD1	25	SOD1-F	GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG	227
26	SOD1-R	CCACAAGCCAAACGACTTCC
SOD2	27	SOD2-F	GGAAGCCATCAAACGTGACTT	116
28	SOD2-R	CCCGTTCCTTATTGAAACCAAGC
GAPDH	5	GAPDH-F	CTGGGCTACACTGAGCACC	101
6	GAPDH-R	AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG

標的基因的相對表現量是推導自方程式2 ^- ^△△ ^Ct，並利用GAPDH基因(作為內部對照組)及基準基因的循環閾值及藉由標準差來計算相對倍數變化，其中△Ct=Ct _目標基因 _/ _基準基因-Ct _GAPDH，△△Ct=△Ct _目標基因-△Ct _基準基因，倍數變化=2 ^- ^△△ ^Ct平均值。以對照組的標的基因表現量作為1的比較基準。各組之間的統計學顯著差異是藉由單尾史徒登氏t-檢定來決定。本實施例的結果顯示於圖13。

圖13是本發明金針花萃取物在提升與神經細胞抗氧化相關的基因表現上的功效之數據圖。由圖13可見，與對照組相較之下，實驗組的基因相對表現量有顯著的提升(提升多種神經細胞抗氧化相關基因表現約12.5~195%)。本實施例的結果顯示，本發明金針花萃取物可藉由提升與神經細胞抗氧化相關的基因表現來提升神經細胞的抗氧化能力。

綜上所述，本發明金針花萃取物能調控XRCC1基因、UNG基因、OGG1基因、MPG基因、ERCC1基因、ERCC6基因、GPX1基因、MLH1基因、MSH6基因、SOD基因、MKP-1基因、及DDC基因的表現量，達到提升抗醣化活性、抑制細胞脂肪堆積、促進脂肪分解及提升骨骼肌基礎代謝率、抗憂鬱、改善情緒、抑制黑色素生成、提升皮膚抗紫外線能力、提升SOD活性、降低ROS表現量、改善膚質膚況、提升粒線體活性、提升抗氧化能力、及保護神經細胞之功效。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

無

圖1是本發明一實施例金針花萃取物在抗醣化上的功效之數據圖。圖2是本發明一實施例金針花萃取物在抑制脂肪堆積上的功效之數據圖。圖3是本發明一實施例金針花萃取物在促進脂肪分解上的功效之數據圖。圖4是本發明一實施例金針花萃取物在提升骨骼肌基礎代謝率上的功效之數據圖。圖5是本發明一實施例金針花萃取物在抑制與抑制憂鬱相關的MKP-1基因表現上的功效之數據圖。圖6是本發明一實施例金針花萃取物在提升與促進多巴胺相關的DDC基因表現上的功效之數據圖。圖7是本發明一實施例金針花萃取物在抵抗及防禦UVA能力上的功效之數據圖。圖8是本發明一實施例金針花萃取物在抑制黑色素生成上的功效之數據圖。圖9是本發明一實施例金針花萃取物在提升皮膚纖維母細胞之SOD活性上的功效之數據圖。圖10是本發明一實施例金針花萃取物在降低皮膚纖維母細胞之ROS表現量上的功效之數據圖。圖11是本發明一實施例金針花萃取物在提升神經細胞的粒線體活性上之效用的數據圖。圖12是本發明一實施例金針花萃取物在提升神經細胞的抗氧化能力上的功效之數據圖。圖13是本發明一實施例金針花萃取物在提升與神經細胞抗氧化相關的基因表現上的功效之數據圖。

Claims

一種金針花萃取物用於製備提升抗醣化活性組成物的用途，其中該金針花萃取物是於50℃~100℃下以水萃取金針花(Hemerocallis fulva Linn.)0.5小時~3小時所獲得，以及該金針花與該水之體積比為1：5~1：20。
如請求項1所述的用途，其中該金針花萃取物具有抑制D-果糖使膠原蛋白產生醣化的作用。
如請求項2所述的用途，其中該金針花萃取物具有減少高度醣化終產物生成量的作用。
如請求項3所述的用途，其中該金針花萃取物具有避免體內功能性蛋白質變性的作用。
如請求項1至4其中任一所述的用途，其中該組成物是一醫藥品、一食品產品或一保養品。