CN111939182A

CN111939182A - 银杏愈伤组织萃取物的用途、及培养银杏愈伤组织的方法

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Publication number: CN111939182A
Application number: CN202010078500.2A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 陈世禔
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2020-11-17
Also published as: TWI777096B; TW202042829A

Abstract

本发明提供一种银杏愈伤组织萃取物在制备提升Tgm1基因、KRT基因、AQP3基因、FLG‑F基因、GBA基因、HAS基因、CCT基因、Pink1基因、Atg基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因或Ubl‑5基因的表达量、提升皮肤的保湿能力及抗老化的组合物中的用途，其中所述银杏愈伤组织的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂对所述银杏愈伤组织进行萃取而制得的。本发明还提供一种用于培养银杏愈伤组织的方法。

Description

银杏愈伤组织萃取物的用途、及培养银杏愈伤组织的方法

技术领域

本发明涉及一种银杏(Ginkgo biloba)愈伤组织的萃取物用于提升Tgm1基因、KRT基因、AQP3基因、FLG-F基因、GBA基因、HAS基因、CCT基因、Pink1基因、Atg基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因或Ubl-5基因的表达量、提升皮肤的保湿能力及抗老化的用途、用于诱导及增殖银杏愈伤组织的方法、及用于培养银杏愈伤组织的培养基。

背景技术

皮肤组织是由表皮、真皮及皮下组织所构成，其中真皮含有大量胶原蛋白及玻尿酸，而与皮肤的保水性及弹力息息相关。人类皮肤会随着年纪、生理因素或环境因素，而有老化、肤质粗糙或产生皱纹等现象，如正常年轻人的皮肤都具一定的弹性和张力，当表情肌松弛后，皮肤会很快复原，使皱纹消失；但进入中年后，皮肤开始明显老化，皮肤变薄、变硬、干燥、张力降低；真皮胶原蛋白减少、弹力纤维变性、断裂，使皮肤的张力和弹性降低，因此，当表情肌松弛后，皮肤不能很快复原，久之则使皱纹成形；且随年龄的增大，皮肤和皮下组织更加松弛，加上面部支持组织的萎缩或缺失，以及肌肉的松软，皮肤会在重力的作用下发生滑坠，形成更深的皱纹。而肌肤粗糙是由于干燥、紫外线、清洁剂或化学物质等刺激性物质等外在重要因素，或激素平衡的紊乱等内在重要因素而产生的肌肤困扰，并伴随角质层屏障功能的下降、角质层水分量的下降、表皮代谢回转的亢进、鳞屑的产生而角质粗糙化等现象。因此皮肤上的细胞若失去弹性及保湿功能，会引起皮肤褶皱、干燥及失去光泽等现象。

近年来，人类对于皮肤保湿(moisturizing)的需求与日俱增，因为一旦提升皮肤的保湿能力，就能够达到抗老化的效用。然而，目前常见用来提升皮肤保湿能力的方式大多为利用涂抹于皮肤表面的化妆品、保养品，或口服宣称具有提升皮肤保湿效用的健康食品。然而，习知的化妆品、保养品及健康食品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，且这些产品往往价格昂贵，并非为一般使用者所能负担。

此外，自古人类总梦想着追求青春永驻、长生不老之道，近年来随着医学及生物科技的发展与进步，不但可通过前端的医学技术来对抗疾病，许多要求能抗老的产品也陆续地研发问世，近年来抗老化的风潮慢慢地向全球蔓延开来，以日本为例，高达七成以上民众具有抗老化意识，而台湾民众对于抗老化的关心也持续升高，此股抗老化趋势将带动抗老化相关产品市场销售，预期全球市场也将持续扩张。

另一方面，粒线体亦被称为细胞的发电站，因为它是细胞内合成三磷酸腺苷(ATP)(一种传递能量的分子)的主要场所，为细胞的各项活动提供了化学能量。粒线体若损坏，对细胞以及生物个体的影响甚巨。粒线体在合成ATP的过程中会产生很多的自由基，自由基的活性极强，会与体内任何物质发生强烈的氧化反应而破坏其正常功能。自由基日积月累地伤害粒线体内的酶与DNA，渐渐地使其功能下降进而使各器官组织的功能衰退。因此，如何提升细胞的粒线体活性，进而达到抗老化的效用，成为本领域的重要课题。

为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有提升皮肤的保湿能力及抗老化效用的新颖医药品、食品产品或保养品以造福有此需求的广大族群。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的为提供一种银杏(Ginkgo biloba)愈伤组织的萃取物用于制备提升转谷胺酰胺酶1(transglutaminase 1,Tgm1)基因、角蛋白(keratin,KRT)基因、水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)基因、丝聚蛋白(filaggrin,FLG-F)基因、葡糖神经酰胺酶(Glucosylceramidase,GBA)基因、玻尿酸合成酶(hyaluronan synthase,HAS)基因、含有T-复合物蛋白质1亚单位α(TCP1)复合物的陪伴蛋白(chaperonin containing T-complexprotein 1subunit alpha(TCP1)complex,CCT)基因、第一型PTEN诱发激酶(PTEN-inducedkinase 1,Pink1)基因、自噬-相关蛋白质(Autophagy-related,Atg)基因、沉默调节蛋白1(Sirtuin 1,SIRT1)基因、谷胺酰胺-依赖型NAD(+)合成酶(Glutamine-dependent NAD(+)synthetase,NADSYN)基因、粒线体核醣体蛋白质S5(mitochondrial ribosomal proteinS5,MRPS5)基因或泛素样蛋白质5(Ubiquitin-like protein 5,Ubl-5)基因的表达量的组合物的用途，其中该银杏愈伤组织的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂对该银杏愈伤组织进行萃取而制得的。

在本发明的一实施例中，该KRT基因是KRT1基因、KRT10基因或KRT14基因。

在本发明的一实施例中，该HAS基因是HAS2基因或HAS3基因。

在本发明的一实施例中，该CCT基因是含有TCP1亚单位2的陪伴蛋白(chaperonincontaining TCP1 subunit 2,CCT2)基因、含有TCP1亚单位5的陪伴蛋白(chaperonincontaining TCP1 subunit 5,CCT5)基因、含有TCP1亚单位6A的陪伴蛋白(chaperonincontaining TCP1 subunit 6A,CCT6A)基因、含有TCP1亚单位7的陪伴蛋白(chaperonincontaining TCP1 subunit 7,CCT7)基因、或含有TCP1亚单位8的陪伴蛋白(chaperonincontaining TCP1 subunit 8,CCT8)基因。

在本发明的一实施例中，该Atg基因是Atg1基因或Atg8基因。

本发明的另一目的为提供一种银杏(Ginkgo biloba)愈伤组织的萃取物用于制备提升皮肤的保湿能力及抗老化的组合物的用途，其中该银杏愈伤组织的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂对该银杏愈伤组织进行萃取而制得。

在本发明的一实施例中，该银杏愈伤组织是经由添加甲基茉莉花酸(methyljasmonic acid,MeJA)的培养基培养而得。

在本发明的一实施例中，该银杏愈伤组织的萃取物的有效浓度为至少0.25％(v/v)。

在本发明的一实施例中，该组合物是医药品、食品产品或保养品。

本发明的另一目的为提供一种用于培养银杏愈伤组织的方法，包含使用添加甲基茉莉花酸(methyl jasmonic acid,MeJA)的培养基来培养该银杏愈伤组织，其中该甲基茉莉花酸的浓度为至少0.1mM。

综上所述，本发明的银杏愈伤组织的萃取物的功效在于：可通过提升Tgm1基因、KRT基因、AQP3基因、FLG-F基因、GBA基因、HAS基因、CCT基因、Pink1基因、Atg基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因或Ubl-5基因的表达量来达到提升皮肤的保湿能力及抗老化的功效，且人体实验也证实有效。另一方面，本发明利用培养过程中的甲基茉莉花酸的添加让多酚、黄酮等效性物质大量生成，用于保湿抗老，使本发明的银杏愈伤组织的萃取物更有利于产业利用。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定者为准。

附图说明

图1A是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在提升总多酚含量上的功效的数据图。

图1B是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在提升总黄酮含量上的功效的数据图。

图2是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在作用6或24小时之时提升与皮肤细胞保湿相关的Tgm1、KRT1、KRT10、KRT14、AQP3、FLG-F、GBA、HAS2及HAS3基因表达上的功效的数据图，其中*表示与对照组比较，p<0.05；**表示与对照组比较，p<0.01；***表示与对照组比较，p<0.001。

图3是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在促进角质细胞分泌玻尿酸上的功效的数据图，其中***表示与对照组比较，p<0.001。

图4A是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在作用48小时之时提升与抗老化相关的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8及Pink1基因表达上的功效的数据图，其中*表示与对照组比较，p<0.05；**表示与对照组比较，p<0.01；***表示与对照组比较，p<0.001。

图4B是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在作用24或48小时之时提升与抗老化相关的Atg1、Atg8、SIRT1、NADSYN、MRPS5及Ubl-5基因表达上的功效的数据图，其中*表示与对照组比较，p<0.05；**表示与对照组比较，p<0.01；***表示与对照组比较，p<0.001。

图5是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在降低细纹生成上的功效的数据图及照片，其中*表示与对照组比较，p<0.05。

图6是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在增加肌肤保水度上的功效的数据图。

图7是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在改善脸部泛红上的功效的数据图及影像图。

具体实施方式

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

依据本发明，银杏(Ginkgo biloba)别名为公孙树或鸭脚树，为银杏科(Ginkgoaceae)银杏属(Ginkgo)的落叶乔木。银杏原产于中国南方，其存在历史可追溯至2亿年前，为银杏门中唯一现存物种，而被称为植物界中的活化石。银杏的枝干浴火不死，逢难再生。二战后荒木不生的长崎、广岛，也是银杏率先冒出新芽，显示其强韧的生命。银杏是适应性极佳，抗逆力十分强大的树种，在极端环境下能生成特殊物质抵御逆境，因此能耐寒、耐热且不容易受害虫或病菌感染。

依据本发明，愈伤组织(callus)是植物原始尚未分化的状态，来自于茎与根的顶端分生组织(apical meristem)或是体细胞(somatic cell)。愈伤组织具有超基因(epigentic)作用与全能分化能力(totipotent)，能够分化成植物胚胎细胞进而形成新的植株，并有帮助细胞代谢新生、推迟老化与赋予活力等功效。近代利用植物组织培养方法，已经成功发展出一套属于植物愈伤组织增殖的技术，然而对于不同品种的植株尚须经由详尽实验找出适合的培养配方，方能产出有利用价值的植物愈伤组织，提供产业利用。

如本文中所使用的，用语“银杏愈伤组织的萃取物”及“银杏干细胞”可交换使用。

如本文中所使用的，用语“抗老化(anti-aging)”意指预防、减缓人类皮肤外观的老化现象，例如：皱纹的产生及失去弹性等。评量实现此目的的程度将根据熟悉此项技艺者已知的诸多因素来决定，诸如消费者的全身状态、年龄、性别等。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于非经肠地道(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)、外部制剂(external preparation)以及类似之物。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂、缓冲液、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

依据本发明，该医药品可以选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、真皮内注射(intradermal injection)、肌肉内注射(intramuscular injection)、静脉内注射(intravenous injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。

依据本发明，该外部制剂是通过将本发明的医药品与熟习此项技艺者所详知的基料(base)相混合而被制备。

依据本发明，该基料可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、防腐剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、表面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、稳定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如

974P(

974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可进一步包含有被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一种或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、表面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。

依据本发明，保养品亦可与一种或多种选自于下列的已知活性的外用剂(external use agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatory agents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultravioletabsorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，通过习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

实施例1.银杏愈伤组织的萃取物的制备

首先，取银杏的芽作为培植体，并将银杏进行灭菌处理以除去植物表面的微生物，可以任意方式使银杏产生伤口，举例而言，可以割划、撕裂或剪切的方式，获得带有伤口的银杏，并于该伤口上形成愈伤组织。

将甲基茉莉花酸(methyl jasmonic acid,MeJA)溶于二甲基亚砜配成0.1微摩尔的分子量备用。接着，将5mL的甲基茉莉花酸溶液(浓度为0.1mM)均匀地滴在包含银杏愈伤组织的培养基(MS培养基(Murashige and Skoog)，添加0.5mg/L的1-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，NAA)、0.1mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)、3％蔗糖与0.8％琼脂，调整pH值至5.8)以上，培养后一周采收备用。之后，将经培养的银杏愈伤组织采收后供后续萃取用。接着，对采收后的银杏愈伤组织进行均质处理，然后以水、醇类、含水醇类或其组合，其中水为最佳溶剂作为萃取溶剂对经均质处理的银杏愈伤组织进行萃取20分钟，经均质处理的银杏愈伤组织与萃取溶剂的体积比例0.8～1.2:8～12(较佳1:10)，且萃取的温度介于30℃至50℃。之后，冷却至室温，然后以400网目(mesh)的滤网对得到的产物过滤而得到本发明的银杏愈伤组织的萃取物。

实施例2.经由添加甲基茉莉花酸的培养基培养而得到的银杏愈伤组织的萃取物在提升总多酚及总黄酮含量上的效用评估

首先，制备标准溶液，将10g的没食子酸(gallic acid)溶于水中并添加10mL的体积至量瓶中。接着，分别配制0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL及100μg/mL的标准溶液，继而取100μL的各个标准溶液至具有10mL体积的离心管。之后，添加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)、混合并直立放置3分钟，接着添加400μL的7.5％碳酸钠(sodiμM carbonate)、混合并直立放置30分钟。接着，将200μL的各个反应溶液转移至96-孔盘中，于750nm下测量吸光值。

另外，将实施例1所得到的银杏愈伤组织的萃取物作为实验组，将未添加甲基茉莉花酸培养的银杏愈伤组织作为比较组。将实验组及比较组分别以水予以稀释并取100mL的体积至微量离心管中。之后，添加500μL的佛萧酚试剂、混合并直立放置3分钟，然后添加400μL的7.5％碳酸钠、混合并直立放置30分钟。接着，将200μL的各组反应溶液转移至96-孔盘中，于750nm下测量吸光值。总多酚含量的结果显示于图1A。

图1A是本发明银杏愈伤组织的萃取物在提升总多酚含量上的功效的数据图。由图1A可见，与比较组相较之下，实验组的总多酚含量有显著的提升1.6倍。本实施例的结果显示，本发明经由添加甲基茉莉花酸的培养基培养而得的银杏愈伤组织的萃取物可有效提升总多酚含量。

另外，总黄酮含量检测的实验流程如下：检测总黄酮含量以芸香素(rutin)(ChromaDex ASB-00018440)当量作为总黄酮相对含量的表示。准备材料包含有10％硝酸铝(Aluminum nitrat)(水溶液)(Alfa Aesar 12360)、5％柠檬酸钠(sodium nitrite)(水溶液)(Sigma 31443)、4％氢氧化钠(sodium hydroxide)(水溶液)(Macron 7708-10)及200μg/mL芸香素(甲醇溶液)。

取上述芸香素标准液0、200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL及1200μL分别加入试管中，分别依序加入1200μL、1000μL、800μL、600μL、400μL、200μL及0μL的水，震荡均匀混合。取200μL各浓度的芸香素溶液，分别加入200μL的5％柠檬酸钠，混合均匀后静置6分钟；加入200μL的10％硝酸铝，混合均匀后静置6分钟；再加入2mL的4％氢氧化钠混合均匀后，再加入1.4mL H₂O混合均匀。取200μL上述反应液于96孔反应盘中，以分光亮度计于500nm侦测吸光值，并绘制标准曲线。

将实施例1所得到的银杏愈伤组织的萃取物作为实验组，将未添加甲基茉莉花酸培养的银杏愈伤组织作为比较组。实验组或比较组经适当的稀释后，取200μL的实验组或比较组样品置于试管中，加入200μL 5％柠檬酸钠，混合均匀后静置6分钟；加入200μL 10％硝酸铝，混合均匀后静置6分钟；加入2mL4％氢氧化钠混合均匀后，再加入1.4mL H₂O混合均匀。取200μL上述反应液于96孔反应盘中，以分光亮度计于500nm侦测吸光值。总黄酮含量的结果显示于图1B。

图1B是本发明银杏愈伤组织的萃取物在提升总黄酮含量上的功效的数据图。由图1B可见，与比较组相较之下，实验组的总黄酮含量有显著提升2.3倍。本实施例的结果显示，本发明经由添加甲基茉莉花酸的培养基培养而得到的银杏愈伤组织的萃取物可有效提升总黄酮含量。

实施例3.银杏愈伤组织的萃取物在提升皮肤的保湿能力上的效用评估

本实施例通过探讨银杏愈伤组织的萃取物可否通过提升与皮肤细胞保湿相关的基因的表达来达到提升皮肤的保湿能力的功效。

于角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM；购自Thermo，产品编号：17005042)中培养人类表皮角质细胞(HPEK-50；购自CELLnTEC)于6-孔盘，2mL培养基的细胞浓度为1×10⁵细胞/孔。

之后，将细胞分成3组，其中包括1个对照组及2个实验组(亦即实验组1与2)。将银杏愈伤组织的萃取物以培养基稀释为具有0.25％(v/v)及0.5％(v/v)浓度的稀释液，继而分别将0.25％稀释液添加至实验组1的细胞中，及将0.5％稀释液添加至实验组2的细胞中，至于对照组的细胞(即HPEK-50)则仅添加培养基。接着，于培养箱中培养各组细胞6或24小时，然后收取各组细胞培养物并拿来进行基因表达分析。

在本实施例中，用来分析与皮肤细胞保湿相关的基因包括转谷胺酰胺酶1(transglutaminase 1,Tgm1)基因、角蛋白1(keratin 1,KRT1)基因、KRT10基因、KRT14基因、水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)基因、丝聚蛋白(filaggrin,FLG-F)基因、葡糖神经酰胺酶(Glucosylceramidase,GBA)基因、玻尿酸合成酶2(hyaluronan synthase 2,HAS2)基因及HAS3基因。

以RNA萃取试剂盒(Geneaid)对上面所得到的各组细胞培养物进行RNA的萃取。对由此所得到的各组RNA取2,000ng并以Super

III反转录酶(Invitrogen)将萃取出的RNA反转录为cDNA。接着，以cDNA作为模版，并且使用用来扩增目标基因的引物对，包括Tgm1、KRT1、KRT10、KRT14、AQP3、FLG-F、GBA、HAS2、HAS3及TBP(作为内部对照组)，它们的核苷酸序列显示于下表1，在StepOne Plus实时PCR系统(ABI)中利用KAPA CYBR FAST qPCR试剂盒(2x)(KAPA Biosystems)来进行定量实时PCR，以便对目标基因进行扩增及定量。PCR产物的熔化曲线是在定量实时PCR反应期间进行确认。

表1

目标基因的相对表达量是推导自方程式2^-△△Ct，并利用TBP基因(作为内部对照组)及基准基因的循环阈值及通过标准偏差来计算相对倍数变化，其中△Ct＝Ct_{目标基因/基准基因}-Ct_TBP，△△Ct＝△Ct_目标基因-△Ct_基准基因，倍数变化＝2^-△△Ct _平均值。以对照组的目标基因表达量作为1的比较基准。各组之间的统计学显著差异是通过单尾学生t-检验(student’s t-test)来决定。本实施例的结果显示于图2。

图2是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在作用6或24小时之时提升与皮肤细胞保湿相关的Tgm1、KRT1、KRT10、KRT14、AQP3、FLG-F、GBA、HAS2及HAS3基因表达上的功效的数据图。由图2可见，无论是Tgm1基因、KRT14基因、FLG-F基因、GBA基因、HAS2基因或HAS3基因，与对照组(即HPEK mock)相较之下，实验组1及实验组2在作用6或24小时之时的基因相对表达量有显著的提升。就KRT1基因而言，与对照组相较之下，除实验组2作用6小时之外，实验组1在作用6及24小时之时及实验组2在作用24小时之时的基因相对表达量有显著的提升。就KRT10基因而言，与对照组相较之下，除实验组2作用24小时之外，实验组1在作用6及24小时之时及实验组2在作用6小时之时的基因相对表达量有显著的提升。就AQP3基因而言，与对照组相较之下，除实验组2作用24小时之外，实验组1在作用6及24小时之时及实验组2在作用6小时之时的基因相对表达量有显著的提升。本实施例的结果显示，本发明银杏愈伤组织的萃取物可通过提升与皮肤细胞保湿相关的Tgm1、KRT1、KRT10、KRT14、AQP3、FLG-F、GBA、HAS2及HAS3基因的表达来维持角质细胞排列，使皮肤角质组织完整，增加肌肤保水度，提升角质细胞合成玻尿酸，有效为肌肤锁住水分，填补皮肤角质层的细胞间隙间的脂质，达到提升皮肤的保湿能力的功效。

实施例4.银杏愈伤组织的萃取物在促进角质细胞分泌玻尿酸上的效用评估

本实施例进一步测试本发明银杏愈伤组织的萃取物对促进角质细胞分泌玻尿酸的效果，由于已知角质细胞会分泌玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层屏障的完整，及防止皮肤水分散失及形成完整防护，因此。首先于96孔培养盘中，每孔加入200μL的角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM；购自Thermo，产品编号：17005042)并植入1x10⁴个人类表皮角质细胞(HPEK-50；购自CELLnTEC)/孔，然后于37℃培养过夜。

之后，将细胞分成3组，其中包括1个对照组及2个实验组(亦即实验组1与2)。将银杏愈伤组织的萃取物以培养基稀释为具有0.5％(v/v)及1％(v/v)浓度的稀释液，继而分别将0.5％稀释液添加至实验组1的细胞中，及将1％稀释液添加至实验组2的细胞中，至于对照组的细胞则不作任何处理。于37℃培养24小时，时间结束后在不扰动贴附细胞的情况下，每孔收集100μL的培养基。

接着，利用人类玻尿酸(Human Hyaluronic Acid,HA又称人类透明质酸)的ELISA分析检测试剂盒(购自Cusabio Biotech公司，中国，编号CSB-E04805h)进行分析。首先于在底部覆盖一层人类透明质酸捕捉抗体的96孔培养盘中，加入100μL的各孔收集的培养基，或溶于含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液的标准品，于37℃下与捕捉抗体进行结合2小时，时间结束后将液体移除，并直接于每孔中加入100μL的侦测抗体(生物素抗体(biotin-antibody)(1X))，然后于37℃下侦测捕捉抗体1小时。接着，吸出每个孔并清洗，重复该过程两次，总共清洗三次。之后，使用多通道移液器(multi-channel pipette)以清洗缓冲液(200μL)填充每个孔进行清洗，并静置2分钟，然后在每个步骤完全除去液体对于良好的性能是必不可少的。最后一次清洗后，透过抽吸或倾析(decanting)除去任何剩余的清洗缓冲液。翻转培养盘并用干净的纸巾擦干。之后，每孔加入100μL的辣根过氧化物酶-卵白素(HRP-avidin)于37℃下作用1小时，然后重复抽吸/清洗程序5次。接着，加入90μL的TMB受质呈色溶液，于37℃下作用15～30分钟并且避光，再于每孔加入50μL的终止溶液以中止反应，轻轻敲打培养盘以确保充分混合，最后以酶免疫分析仪(BioTek)测量其5分钟内于450nm的吸光值。再以Excel软件进行学生t-检验以决定变异系数是否在统计上具有显著差异。实验结果显示于图3。

图3是本发明银杏愈伤组织的萃取物在促进角质细胞分泌玻尿酸上的功效的数据图。由图3可见，与对照组相较之下，实验组1及实验组2的玻尿酸生成量皆有显著提升，其中实验组1提升30.8％，实验组2提升27.5％。本实施例的结果显示，本发明银杏愈伤组织的萃取物可有效促进角质细胞分泌玻尿酸，能有效使皮肤角质层结构完整并提升皮肤屏障功能，并使皮肤保水力提升。

实施例5.银杏愈伤组织的萃取物在抗老化上的效用评估

本实施例通过探讨银杏愈伤组织的萃取物可否通过提升与抗老化相关的基因的表达来达到抗老化的功效。

首先，以添加有10％胎牛血清(FBS)(Gibco)及1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)(Gibco)的杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium,DMEM)培养人类骨髓神经母细胞瘤SHSY-5Y(

CRL-2266^TM)于6-孔盘，2mL培养基的细胞浓度为1×10⁵细胞/孔。

之后，将细胞分成3组，其中包括1个对照组及2个实验组(亦即实验组1与2)。将银杏愈伤组织的萃取物以培养基稀释为具有0.5％(v/v)及1％(v/v)浓度的稀释液，继而分别将0.5％稀释液添加至实验组1的细胞中，及将1％稀释液添加至实验组2的细胞中，至于对照组的细胞则添加培养基。接着，于培养箱中培养各组细胞24或48小时，然后收取各组细胞培养物并拿来进行基因表达分析。

在本实施例中，用来分析与抗老化相关的基因包括含有TCP1亚单位2的陪伴蛋白(chaperonin containing TCP1 subunit 2,CCT2)基因、含有TCP1亚单位5的陪伴蛋白(chaperonin containing TCP1 subunit 5,CCT5)基因、含有TCP1亚单位6A的陪伴蛋白(chaperonin containing TCP1 subunit 6A,CCT6A)基因、含有TCP1亚单位7的陪伴蛋白(chaperonin containing TCP1 subunit 7,CCT7)基因、含有TCP1亚单位8的陪伴蛋白(chaperonin containing TCP1 subunit 8,CCT8)基因、第一型PTEN诱发激酶(PTEN-induced kinase 1,Pink1)基因、自噬-相关蛋白质1(Autophagy-related 1,Atg1)基因、自噬-相关蛋白质8(Autophagy-related 8,Atg8)基因、沉默调节蛋白1(Sirtuin 1,SIRT1)基因、谷胺酰胺-依赖型NAD(+)合成酶(Glutamine-dependent NAD(+)synthetase,NADSYN)基因、粒线体核醣体蛋白质S5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)基因及泛素样蛋白质5(Ubiquitin-like protein 5,Ubl-5)基因，其中NADSYN基因协助合成NAD，提供粒线体能量来源，维持活力；SIRT1基因协助粒线体修护受损DNA，减缓老化；Atg1基因为使粒线体回春相关的基因，回春抗老；Atg8基因清除突变DNA使粒线体回春，恢复青春活力；MRPS5基因协助粒线体蛋白合成，提供能量来源；CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7及CCT8基因使老熟细胞逆龄回年轻细胞；Pink1基因使老化粒线体回复年轻状态；Ubl-5基因回复粒线体活性，动物实验证实使年老的小鼠回复年轻时的状态。

III反转录酶(Invitrogen)将萃取出的RNA反转录为cDNA。接着，以cDNA作为模版，并且使用用来扩增目标基因的引物对，包括CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、Pink1、Atg1、Atg8、SIRT1、NADSYN、MRPS5、Ubl-5及GAPDH(作为内部对照组)，它们的核苷酸序列显示于下表2，在StepOne Plus实时PCR系统(ABI)中利用KAPA CYBR FAST qPCR试剂盒(2x)(KAPA Biosystems)来进行定量实时PCR，以便对目标基因进行扩增及定量。PCR产物的熔化曲线是在定量实时PCR反应期间进行确认。

表2

目标基因的相对表达量是推导自方程式2^-△△Ct，并利用GAPDH基因(作为内部对照组)及基准基因的循环阈值及通过标准偏差来计算相对倍数变化，其中△Ct＝Ct_{目标基因/基准基因}-Ct_GAPDH，△△Ct＝△Ct_目标基因-△Ct_基准基因，倍数变化＝2^-△△Ct _平均值。以对照组的目标基因表达量作为1的比较基准。各组之间的统计学显著差异是通过单尾学生t-检验来决定。本实施例的结果显示于图4A及图4B。

图4A是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在作用48小时之时提升与抗老化相关的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8及Pink1基因表达上的功效的数据图。由图4A可见，无论是CCT2、CCT5、CCT6A、CCT8或Pink1基因，与对照组相较之下，实验组1及实验组2在作用48小时之时的基因相对表达量有显著的提升。就CCT7基因而言，与对照组相较之下，除实验组2作用48小时之外，实验组1在作用48小时之时的基因相对表达量有显著的提升。

图4B是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在作用24或48小时之时提升与抗老化相关的Atg1、Atg8、SIRT1、NADSYN、MRPS5及Ubl-5基因表达上的功效的数据图。由图4B可见，无论是Atg1、SIRT1或MRPS5基因，与对照组相较之下，实验组1及实验组2在作用24或48小时之时的基因相对表达量有显著的提升。就Atg8基因而言，与对照组相较之下，除实验组1作用24小时之外，实验组1在作用48小时之时及实验组2在作用24小时或48之时的基因相对表达量有显著的提升。就NADSYN基因而言，与对照组相较之下，除实验组1作用48小时之外，实验组1在作用24小时之时及实验组2在作用24小时或48之时的基因相对表达量有显著的提升。就Ubl-5基因而言，与对照组相较之下，除实验组1作用24小时之外，实验组1在作用48小时之时及实验组2在作用24小时或48之时的基因相对表达量有显著的提升。本实施例的结果显示，本发明的银杏愈伤组织的萃取物可通过提升与抗老化相关的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、Pink1、Atg1、Atg8、SIRT1、NADSYN、MRPS5及Ubl-5基因表达来多方位提升粒线体活性，强化肌肤活力源头，达到抗老化的功效。

实施例6.银杏愈伤组织的萃取物的人体功效测试

在本实施例中，通过使用实施例1所制得的银杏愈伤组织的萃取物来检测其是否具有改善人体肌肤的功效。

首先，募集8位受试者，并将每位受试者的左脸使用作为对照组，及将右脸使用作为实验组，其中每日早晚清洁脸部后，将安慰剂涂抹于对照组肌肤，及将1％银杏愈伤组织的萃取物作为银杏干细胞精华液涂抹于实验组肌肤，以指腹稍加按摩促进吸收，并于使用前(第0周)及使用后第4周或15分钟进行检测。检测项目包括肌肤皱纹、肌肤含水量及肌肤泛红，肌肤皱纹及肌肤含水量是于使用后第4周检测，肌肤泛红是于使用后15分钟检测，并以VISIA Complexion分析系统(VISIA Complexion Analysis System)(Canfieldscientific,USA)进行检测。本实施例的结果显示于图5至图7。

图5是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在降低细纹生成上的功效的数据图及照片。图6是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在增加肌肤保水度上的功效的数据图。图7是本发明的银杏愈伤组织的萃取物在改善脸部泛红上的功效的数据图及影像图。由图5可见，与第0周相较之下，实验组的肌肤细纹会随着时间增加而有显著的降低，对照组则无；与第0周比较，实验组在使用后第4周的肌肤细纹降低13％。由图6可见，与第0周相较之下，实验组的肌肤保水度会随着时间增加而有提升的情形，其中与第0周比较，实验组在使用后第4周的肌肤保水度提升13.3％。由图7可见，与使用前相较之下，实验组的脸部泛红在使用后15分钟即有改善，对照组则无；与使用前比较，实验组在使用后15分钟的肌肤泛红改善10.3％。本实施例的结果显示，本发明的银杏愈伤组织的萃取物具有改善人体肌肤以达到保湿及抗老化的功效。

综上所述，本发明的银杏愈伤组织的萃取物可通过提升Tgm1基因、KRT基因、AQP3基因、FLG-F基因、GBA基因、HAS基因、CCT基因、Pink1基因、Atg基因、SIRT1基因、NADSYN基因、MRPS5基因或Ubl-5基因的表达量来达到提升皮肤的保湿能力及抗老化的功效，且人体实验也证实有效。另一方面，本发明利用培养过程中的甲基茉莉花酸的添加让多酚、黄酮等效性物质大量生成，用于保湿抗老，使本发明的银杏愈伤组织的萃取物更有利于产业利用。

以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的权利要求书中。

Claims

1.一种银杏(Ginkgo biloba)愈伤组织的萃取物用于制备提升转谷胺酰胺酶1(Tgm1)基因、角蛋白(KRT)基因、水通道蛋白3(AQP3)基因、丝聚蛋白(FLG-F)基因、葡糖神经酰胺酶(GBA)基因、玻尿酸合成酶(HAS)基因、含有T-复合物蛋白质1亚单位α(TCP1)复合物的陪伴蛋白(CCT)基因、第一型PTEN诱发激酶(Pink1)基因、自噬-相关蛋白质(Atg)基因、沉默调节蛋白1(SIRT1)基因、谷胺酰胺-依赖型NAD(+)合成酶(NADSYN)基因、粒线体核醣体蛋白质S5(MRPS5)基因或泛素样蛋白质5(Ubl-5)基因的表达量的组合物的用途，其中所述银杏愈伤组织的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂对所述银杏愈伤组织进行萃取而制得的。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述KRT基因是KRT1基因、KRT10基因或KRT14基因。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述HAS基因是HAS2基因或HAS3基因。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述CCT基因是含有TCP1亚单位2的陪伴蛋白(CCT2)基因、含有TCP1亚单位5的陪伴蛋白(CCT5)基因、含有TCP1亚单位6A的陪伴蛋白(CCT6A)基因、含有TCP1亚单位7的陪伴蛋白(CCT7)基因、或含有TCP1亚单位8的陪伴蛋白(CCT8)基因。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述Atg基因是Atg1基因或Atg8基因。

6.一种银杏(Ginkgo biloba)愈伤组织的萃取物用于制备提升皮肤的保湿能力及抗老化的组合物的用途，其中所述银杏愈伤组织的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂对所述银杏愈伤组织进行萃取而制得的。

7.如权利要求1或6所述的用途，其中所述银杏愈伤组织是经由添加甲基茉莉花酸的培养基培养而得的。

8.如权利要求1或6所述的用途，其中所述银杏愈伤组织的萃取物的有效浓度为至少0.25％(v/v)。

9.如权利要求1或6所述的用途，其中所述组合物是医药品、食品产品或保养品。

10.一种用于培养银杏愈伤组织的方法，包含使用添加甲基茉莉花酸的培养基来培养所述银杏愈伤组织，其中所述甲基茉莉花酸的浓度为至少0.1mM。