CN109069407A - 具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物，其制备方法和含有其的美白化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有增加的没食子酸(Gallic acid)含量的莲愈伤组织或其提取物，及其制备方法。根据本发明的莲愈伤组织提取物因含有大量的没食子酸而具有优异的美白作用，因此可以有利地用作化妆品组合物。

Description

具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物，其制备方法 和含有其的美白化妆品组合物
技术领域
本发明涉及具有增加的没食子酸含量的莲(Nelumbo Nucifera)愈伤组织提取物及其制备方法。此外，本发明涉及具有优异的皮肤美白作用的化妆品组合物，其包含所述提取物。
背景技术
皮肤的黑变(Melanism)是由皮肤细胞对内在和外在因素的反应所引起的，并且通常是由皮肤暴露于紫外线所引起的。即，当皮肤暴露于紫外线时，酪氨酸酶(Tyrosinase)被活化，其作用于酪氨酸(一种存在于皮肤组织中的氨基酸)，从而产生多巴(dopa)。多巴被氧化成多巴醌(dopaquinone)，然后聚合成为作为皮肤色素细胞的黑素细胞(Melanocyte)中黑素体(Melanosome)中的黑色素。这种黑色素迁移到角化细胞(Keratinocyte)(皮肤角蛋白形成细胞)，通过角质化到达皮肤表面，并保护皮肤抵抗紫外线。
黑色素是人体必需的紫外线吸收剂，其作为自由基清除剂有效去除改变生物材料(如蛋白质、脂质、核酸等)的各种自由基。然而，当黑色素在局部过度合成时，或者当皮肤的生理功能因皮肤损伤和老化而减弱时，黑色素沉积在皮肤表面上，引起斑点、雀斑和各种色素沉着。
由于已经揭示了这种皮肤黑变的原因和机制，通常使用向化妆品组合物中加入具有抑制酪氨酸酶(其参与黑变过程)作用的物质的方法，或者通过抑制黑色素生成期间的一些反应来减少黑色素生成的方法，来预防皮肤的黑变。
用于此目的的代表性物质包括熊果苷、抗坏血酸、对苯二酚等。熊果苷具有优异的抑制酪氨酸酶活性的作用，但是其在稳定性方面存在问题，因为当将其加入化妆品中时，其变色并且其效力随着时间的推移而降低。此外，由于其高度的皮肤应激性，熊果苷具有有限的用途。抗坏血酸的问题在于，其对酪氨酸酶活性的抑制作用较低，并且由于分子本身的稳定性较低，其不适合作为黑色素生成抑制剂。对苯二酚的问题在于，其对皮肤具有高度的刺激性，因此由于安全性问题，目前其在化妆品制剂中的使用受到限制。
此外，由于已经揭示天然来源的植物提取物含有表现出各种生理学活性的活性成分，因此可以代替美白物质并显示出适当的美白作用的植物提取物是令人关注的。
在寻找显示美白作用的植物提取物的努力中，存在对莲提取物的用途的研究(韩国专利号0828193)。然而，在这种情况下，问题在于需要直接培养莲的步骤，这表明存在时间和空间限制，并且通过简单的提取不能获得具有足够活性的活性成分。
为了克服这些限制，对莲愈伤组织的使用的关注正在增加。然而，常规的莲愈伤组织提取物的问题在于，它们在低浓度下没有作用，并且在对于人皮肤的实际临床试验中显示出不显著的美白作用。
发明内容
技术问题
因此，本发明人已进行了研究以获得具有最大化的美白作用的莲愈伤组织提取物，结果是，在含有甲基茉莉酸(Methyl Jasmonic acid)的介质中培养来源于莲组织的莲愈伤组织，产生了具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物，并且已经发现，具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物具有优异的美白作用，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种莲(Nelumbo Nucifera)愈伤组织或其提取物，其具有增加的没食子酸(Gallic acid)含量。
本发明的另一个目的是提供一种增加莲愈伤组织或其提取物中的没食子酸含量的方法。
本发明的又一个目的是提供一种用于制备具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的方法。
本发明的再一个目的是提供一种美白化妆品组合物，其包含作为活性成分的具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物。
技术方案
为了达到目的，本发明提供一种具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织或其提取物，其制备方法，以及包含所述提取物的具有优异的皮肤美白作用的化妆品组合物。
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明提供一种莲(Nelumbo Nucifera)愈伤组织或其提取物，其具有增加的没食子酸(Gallic acid)含量。
莲(Nelumbo Nucifera)是一种在池塘中生长的多年生植物。它的根部横向扩展，形状呈柱状，有许多节，并且它们的末端变得更厚，特别是在秋天时。叶子从根茎萌发出，上升到水面之上，具有接近圆形的形状，具有遍布的叶脉，直径约40cm，不易被水弄湿，并且在叶脉处具有刺状突起。花在七月到八月开放，呈红色或白色，直径为15至20cm。花柄具有刺状的柄，在末端有一朵花。果实在十月份成熟，形状呈椭圆形，长约2cm，是可食用的。莲的果实或种子被称为莲子；莲的成熟种子中的绿色胚芽被称为莲子胚芽；莲的成熟种子中的白色粒被称为莲子肉；莲的雄蕊被称为莲蕊；叶子被称为莲叶；根茎被称为莲藕；根茎的节被称为藕节。熟知莲叶用于腹泻、头痛、头晕、呕血、产后出血治疗、遗尿和解毒。
本发明中使用的莲愈伤组织来源于在韩国被称为“阿罗红”的莲的种子，但不限于此。“阿罗红”是指一种莲植物，其由从韩国庆尚南道咸安郡的城山城堡出土的约700岁的种子种植。其也被称为咸安莲。阿罗红莲花是一种带有花瓣的浅樱桃红色花，其可以在高丽王朝的佛教画作中看到。其特征在于，在花瓣收缩和扩散处颜色逐渐变淡，仅在花瓣末端留下深红色。花瓣根部的纯白色沿着花瓣逐渐变为樱桃红色，长花瓣的简洁优雅的形状以其无与伦比的形象而自豪，这是现有的莲花所无法比拟的。
愈伤组织(Callus)是指当在含有植物生长素的介质中培养从植物中切下的组织时，或者任何种类的植物受伤时，或者用植物生长素处理伤口部位时，产生的特定的组织或细胞团。通常，愈伤组织为无定形的组织或细胞团，其丧失了引起正常器官发生或组织分化的能力，并且其主要由薄壁细胞组成。从广义上讲，其还包括由土壤杆菌属(Agrobacterium)等的感染引起的植物肿瘤组织。
换言之，植物中的细胞在增殖后立即被引导，并规律地组装成特定的组织和器官。然而，据信当通过不同的植物生长激素从外部刺激愈伤组织(通过组织培养形成的未分化的细胞团)时，已经保持到那时的对照被释放，并且细胞随机增殖。
当将通过去分化获得的愈伤组织加入至具有相同组成的液体介质中并振荡培养时，细胞彼此分开，并继续以悬浮状态增殖。愈伤组织或培养的细胞可以通过在新鲜介质中传代培养而永久地分裂和增殖，因此其与分化的细胞在本质上不同，不同在于整个植物会通过分化的细胞老化和死亡。当将传代培养几代的愈伤组织或细胞施用于去除了各种植物生长激素的固体介质上时，芽和根长出来并复原为独立的植物。再生的植物来源于一个培养细胞的分裂和增殖，培养细胞来源于下胚轴或其他组织。
在本发明中，“莲愈伤组织”可以来源于莲的任何部分。在一个实施方案中，其可以为来源于种子叶(子叶)的愈伤组织，所述种子叶从由莲种子萌发的幼苗上切下。当将从莲的任何组织上切下的部分置于具有受控的植物生长素和细胞因子含量的介质中时，可以形成愈伤组织。
在本发明中，“莲愈伤组织培养物”是通过在介质中培养莲愈伤组织而获得的。对于介质，可以不受限制地使用本技术领域中通常用于愈伤组织培养的任何介质。
没食子酸(Gallic acid)具有由下式1表示的结构：
[式1]
没食子酸是一种次生代谢产物，其在植物细胞的正常代谢期间作为副产物产生，并在细胞的某些位置累积。已知没食子酸具有美白作用。
在本发明中，可以通过在含有甲基茉莉酸(Methyl Jasmonic acid)的介质中培养莲愈伤组织，来制备具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织。可以通过在含有甲基茉莉酸的介质中培养莲愈伤组织，然后提取，来制备具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物。
甲基茉莉酸是一种诱导子，其用于增加次级代谢产物没食子酸的含量。可以在含有100至400μM甲基茉莉酸的介质，特别地含有100至250μM甲基茉莉酸的介质，更特别地含有200μM甲基茉莉酸的介质中培养莲愈伤组织，但不限于此。如果介质中甲基茉莉酸的浓度小于100μM，则其对生理学活性物质含量的变化将没有显著作用，而如果介质中甲基茉莉酸的浓度超过400μM，则由于愈伤组织的褐变，其将难以维持莲愈伤组织。
在本发明中，“诱导子(elicitor)”是一种植物免疫活化物质，其增强植物的各种防御机制。
具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织或其提取物可以含有基于提取物的总重量0.01至10重量％，更特别地0.1至3重量％的没食子酸，但不限于此。
具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织、其裂解物、其提取物或其培养物可以包含在组合物中。
在本发明中，“裂解物”是指通过使用化学或物理方法裂解愈伤组织而获得的细胞裂解物，“提取物”为通过将愈伤组织溶解在溶剂中，然后通过分离而获得的物质，并且可以将其通过蒸馏或蒸发浓缩。此外，“培养物”为含有培养液和/或培养的愈伤组织的物质。
在本发明的一个实施方案中，显示通过在含有甲基茉莉酸的介质中培养莲愈伤组织，然后通过提取而获得的莲愈伤组织提取物具有增加的没食子酸含量。特别地，显示通过在含有200μM甲基茉莉酸的介质中培养而获得的莲愈伤组织提取物具有最高的没食子酸含量。
在本发明的一个实施方案中，显示通过在含有甲基茉莉酸的介质中培养获得的莲(Nelumbo Nucifera)愈伤组织提取物的没食子酸含量比在不含甲基茉莉酸的介质中培养的莲愈伤组织的没食子酸含量高至少10倍。
本发明还提供了一种用于制备具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使莲(Nelumbo Nucifera)种子发芽；
(b)从发芽的莲组织中诱导出莲愈伤组织；
(c)在含有甲基茉莉酸(Methyl Jasmonic acid)的介质中培养莲愈伤组织；和
(d)提取具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织培养物。
在根据本发明的制备方法中，为了使莲种子发芽并在步骤(b)中得到愈伤组织，可以选择合适的介质。可以不受限制地使用在本技术领域中通常用于愈伤组织培养的任何介质。对于植物，通常使用MS(Murashige-Skoog)介质、B5介质等。MS基础固体介质(Murashige和Skoog 1962，Duchefa，Cat No.M0221)的组成包括每升1650mg NH4NO3、1900mg KNO3、440mg CaCl2·2H2O、370mg MgSO4·7H2O、170mg KH2PO4、0.83mg KI、6.2mg H3BO3、22.3mgMnSO4·4H2O、8.6mg ZnSO4·7H2O、0.25mg Na2MoO4·2H2O、0.025mg CuSO4·5H2O、0.025mgCoCl2·6H2O、27.8mg FeSO4·7H2O、37.3mg Na2EDTA·2H2O、100mg肌醇、0.5mg烟酸、0.5mg吡哆醇-HCl、0.5mg硫胺素-HCl、2mg甘氨酸和30000mg蔗糖。
在本发明的一个实施方案中，作为用于从莲种子诱导愈伤组织的介质，可以使用通过向MS基础固体介质中加入40.0g/L蔗糖、5-10.0g/L琼脂、0.5mg/Lα-萘乙酸(NAA)和1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)而获得的介质。在这方面，介质的pH为5.5至6.0。更具体地，pH为5.7至5.8。
在根据本发明的制备方法中，为了增加步骤(c)中次级代谢产物没食子酸的含量，可以在含有100至400μM甲基茉莉酸的介质，特别地含有100至250μM甲基茉莉酸的介质，更特别地含有200μM甲基茉莉酸的介质中培养莲愈伤组织，但不限于此。
对于含有甲基茉莉酸的介质，可以不受限制地使用本技术领域中通常用于愈伤组织培养的任何介质。
在本发明的一个实施方案中，显示相比于一般的莲愈伤组织提取物的没食子酸含量，通过在含有甲基茉莉酸作为诱导子的介质中培养而获得的莲愈伤组织提取物的没食子酸含量是增加的。特别地，显示通过在含有200μM甲基茉莉酸的介质中培养而获得的莲愈伤组织提取物具有最高的没食子酸含量。
优选在步骤(c)的培养开始后4至6周将甲基茉莉酸加入到介质中。如果在4周之前加入甲基茉莉酸，则不能充分地培养莲细胞，因此不能充分地产生愈伤组织。如果在6周之后加入甲基茉莉酸，则莲细胞的量可能很大，以至于其不适合用于从莲细胞诱导愈伤组织。更优选地，可以在培养开始后5周加入甲基茉莉酸。
在根据本发明的制备方法中，可以通过过滤、热水提取、乙醇提取、浸渍提取、回流冷却提取、超声提取或超临界提取，更特别地通过热水提取进行步骤(d)中的提取，但不限于此。
在根据本发明的制备方法中，在步骤(d)中获得的提取物可以含有基于提取物的总重量0.01至10重量％，更特别地0.1至3重量％的没食子酸，但不限于此。
本发明还提供一种美白化妆品组合物，其包含作为活性成分的具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物。
所述组合物可以含有基于组合物的总重量0.1至30重量％的具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物。如果提取物的含量小于0.1重量％，则其将不显示改善的皮肤美白作用，如果提取物的含量大于30重量％，则通过增加含量来改善皮肤美白作用将是不显著的，制剂安全性和稳定性将存在问题，并且是不经济的。
当将本发明的化妆品组合物配制成糊剂、霜剂或凝胶剂时，可以使用的载体组分为动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等。
当将本发明的化妆品组合物配制成溶液剂或乳剂时，可以使用的载体组分为溶剂、增溶剂或乳化剂。例如，所使用的载体组分可以为水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
当将本发明的化妆品组合物配制成混悬剂时，可以使用的载体组分为液体稀释剂(如水、乙醇或丙二醇)、乳化剂(如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶等。
当将本发明的化妆品组合物配制成粉末剂或喷雾剂时，可以使用的载体组分为乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。特别地，当将化妆品组合物配制成喷雾剂时，其可以进一步包含推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
当将本发明的化妆品组合物配制成含表面活性剂的清洁剂时，可以使用的载体组分为脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰氨基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
当将本发明的化妆品组合物配制成含表面活性剂的清洁制剂、不含表面活性剂的清洁制剂或皂剂时，在施用于皮肤后可以将其用水洗掉、卸下或洗涤。皂剂的示例包括但不限于液体皂、粉末皂、固体皂和油皂；含表面活性剂的清洁制剂的示例包括但不限于清洁泡沫、清洁水、清洁巾和清洁包；不含表面活性剂的清洁制剂的示例包括但不限于清洁霜剂、清洁洗剂、清洁水和清洁凝胶。
本发明的化妆品组合物可以与其他化妆品组合物组合使用。此外，可以根据常规方法使用根据本发明的化妆品组合物，并且其使用频率可以根据使用者的皮肤状况或偏好而变化。
根据本发明的化妆品组合物含有作为活性成分的具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物，通过从莲组织诱导愈伤组织，然后在含有特定浓度的甲基茉莉酸的介质中培养愈伤组织，然后通过提取而获得所述莲愈伤组织提取物。由于该提取物，化妆品组合物通过抑制黑色素的产生而表现出优异的皮肤美白作用。
在本发明中，“莲愈伤组织”可以来源于莲的任何部分。在一个实施方案中，其可以为来源于种子叶(子叶)的愈伤组织，所述种子叶从由莲种子萌发的幼苗上切下。当将从莲的任何组织上切下的部分置于具有受控的植物生长素和细胞因子含量的介质中时，可以形成愈伤组织。
在本发明中，“莲愈伤组织培养物”是通过在特定的介质中培养莲愈伤组织而获得的。
在本发明中，“诱导子(elicitor)”是一种植物免疫活化物质，其增强植物的各种防御机制。
在本发明中，表述“含有作为活性成分的”是指化妆品组合物含有活性成分，使得其可以通过例如抑制皮肤细胞中的黑色素生成而显示出皮肤美白作用。
有益效果
根据本发明的具有增加的没食子酸(gallic acid)含量的莲愈伤组织或其提取物含有大量的没食子酸，因此通过抑制黑色素的产生而显示出皮肤美白作用。因此，本发明可以有效地用作美白化妆品组合物。
附图说明
图1显示用于分析在比较实施例1中制备的莲(Nelumbo Nucifera)愈伤组织提取物的没食子酸(Gallic acid)含量的HPLC分析的结果。
图2显示用于分析在实施例2-2中制备的莲愈伤组织提取物的没食子酸含量的HPLC分析的结果。
图3显示用于分析在没有愈伤组织诱导的情况下制备的莲提取物的没食子酸含量的HPLC分析的结果(比较实施例5至7)。
图4显示在施用含有0.5％莲愈伤组织提取物(通过用200μM甲基茉莉酸处理而获得)的冻干物的霜剂后，测量皮肤亮度(L值)的变化的结果。
图5显示在施用含有0.5％莲愈伤组织提取物(通过用200μM甲基茉莉酸处理而获得)的冻干物的霜剂后，测量皮肤黑色素指数的变化的结果。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例详细地描述本发明。
然而，以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
参考实施例：莲种子的获得
在该实施例中，从位于韩国庆尚南道咸安郡伽倻邑的咸安博物馆获得30粒莲种子，所述莲种子是在2009年从咸安郡的城山城堡出土的约700岁的莲子(可追溯到韩国的高丽王朝)种植后在3年期间(2010年至2012年)收获的。
实施例1：莲愈伤组织的制备
将灭菌的莲(Nelumbo Nucifera)种子播种在不含激素的MS(Murashige-Skoog)基础固体介质(Murashige和Skoog 1962，Duchefa，Cat No.M0221)上，并在25℃至28℃在长日照条件(18小时)下发芽。
用锋利的刀将附着在发芽幼苗上的子叶切出约3-5cm，并置于MS基础固体介质(pH5.8)上，通过向MS基础固体介质中加入40.0g/L蔗糖、5-10.0g/L琼脂、0.5mg/Lα-萘乙酸和1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤而获得所述MS基础固体介质(Murashige和Skoog 1962，Duchefa，Cat No.M0221)。约2周后，从下胚轴产生带有愈伤组织的芽(shoot)，将其用生根介质传代培养，同时维持愈伤组织。
在通过向MS基础固体介质中加入植物生长调节物质(向MS基础固体介质中加入40.0g/L蔗糖、5-10.0g/L琼脂、0.5mg/Lα-萘乙酸和1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤)而制备的上面描述的介质上，在25℃进行培养持续4周。在培养5周时，将甲基茉莉酸(Methyl Jasmonicacid)以100μM、200μM和400μM的浓度加入到介质中，然后进行培养。
实施例2：莲愈伤组织提取物的制备
收获如上面所描述获得的每个愈伤组织，用水洗涤数次，并在真空冷冻干燥器(Ilshin，Cat no.LP-50)中干燥3天。将1kg干燥的莲愈伤组织置于容器中，向其中加入100L纯化水，然后在90至120℃热水提取48小时。提取后，通过过滤去除固体，从而制备莲愈伤组织提取物。
将通过分别在含有100μM、200μM和400μM甲基茉莉酸的介质中培养而获得的莲愈伤组织提取物分别命名为实施例2-1、实施例2-2和实施例2-3。
比较实施例1至4：根据诱导子处理的比较实施例的制备
以与上面实施例1和2中所描述的相同的方式，通过莲愈伤组织制备和热水提取，来制备莲愈伤组织提取物，只是不加入诱导子甲基茉莉酸，或者用水杨酸(salicylicacid，SA)代替甲基茉莉酸以100μM、200μM和400μM的浓度加入到介质中。
通过在不含甲基茉莉酸的介质中培养而获得的莲愈伤组织提取物被命名为比较实施例1，通过分别在含有100μM、200μM和400μM水杨酸的介质中培养而获得的莲愈伤组织提取物被分别命名为比较实施例2、比较实施例3和比较实施例4。
比较实施例5至7：使用各种莲的部位不经愈伤组织诱导制备比较实施例
从韩国咸安收集莲种子和叶子。将莲叶子在55℃干燥8小时，并在混合器中研磨，并将750ml水作为提取溶剂加入到50g研磨的材料中，然后提取6小时。将所得提取物命名为比较实施例5。
为了获得比较实施例6和7，将莲种子切割并分离为种子胚和种子肉，并向其中加入水，然后提取6小时。然后，加入1％过滤辅助剂，然后过滤，然后在80℃干燥。将莲种子胚的水提取物命名为比较实施例6，并将莲种子肉的水提取物命名为比较实施例7。
实验实施例1：使用不同种类和浓度的诱导子制备的莲愈伤组织提取物中没食子 酸含量的增加的分析
为了检查莲愈伤组织提取物中的没食子酸含量是否根据诱导子的种类和浓度而增加，通过HPLC测量在实施例2和比较实施例1至4中制备的每种莲愈伤组织提取物中的没食子酸含量。
具体地，将0.1g在上面实施例2-1、2-2和2-3中制备的每种莲愈伤组织提取物的冻干物溶解在纯化水中，从而获得10ml各样品溶液。此外，将10mg没食子酸(C7H6O5：170.12)标准品溶解于纯化水中至100ml的终体积，然后将0.5ml溶液再次溶解于纯化水中至100ml的终体积，并稀释为1/2和1/4，从而获得标准溶液。通过HPLC分析20μl上面描述的每种样品溶液和标准溶液。
使用Agilent 1260Infinity(安捷伦，美国)进行HPLC分析。所使用的柱子为CAPCELL PAK C18UG120(250mm x 4.6mm；5μm)。作为流动相，使用0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)和0.1％乙腈(acetonitrile；B)的混合物。在35分钟内以恒定梯度将B的含量从0％增加至90％。流速为1.0ml/min，UV检测器的检测波长设定为270nm。通过HPLC测量的每种莲愈伤组织提取物的没食子酸含量示于图1和图2和下表1中。
[表1]
作为结果，如图1和图2所示，在比较实施例1中制备的莲愈伤组织提取物中未检测到没食子酸(图1)，而在实施例2-2中通过用甲基茉莉酸处理制备的莲愈伤组织提取物中检测到没食子酸(图2)。
此外，如上表1所示，HPLC的结果表明，没食子酸的峰不仅未出现在比较实施例1中制备的莲愈伤组织提取物中，而且也未出现在用水杨酸处理的比较实施例2至4中制备的莲愈伤组织提取物中，表明通过用水杨酸处理获得的莲愈伤组织提取物中也未检测到没食子酸。
然而，显示在实施例2-1至2-3中通过甲基茉莉酸处理制备的莲愈伤组织提取物具有增加的没食子酸含量。特别地，显示通过在含有200μM甲基茉莉酸的介质中培养而制备的莲愈伤组织提取物(实施例2-2)具有最高的没食子酸含量。
实验实施例2：从每个莲的部位不经愈伤组织诱导而制备的提取物中的没食子酸 含量的分析
为了测量实施例2-2和比较实施例5至7的提取物样品的没食子酸含量，进行HPLC分析。
使用Agilent 1260Infinity(安捷伦，美国)进行HPLC分析。所使用的柱子为CAPCELL PAK C18UG120(250mm x 4.6mm；5μm)。作为流动相，使用0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)和0.1％乙腈(acetonitrile；B)的混合物。在35分钟内以恒定梯度将B的含量从0％增加至90％。流速为1.0ml/min，UV检测器的检测波长设定为270nm。通过HPLC测量的比较实施例5至7的每种提取物的没食子酸含量示于图3中。
[表2]
作为结果，显示在实施例2-2中制备的莲愈伤组织提取物中检测到没食子酸(参见图2)，而在没有愈伤组织诱导的情况下制备的比较实施例5至7的提取物中未检测到没食子酸(参见图3)。实施例2-2和比较实施例5至7的没食子酸含量示于上表2中。
实验实施例3：具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的美白作用的测试
为了评价在上述实施例2中通过甲基茉莉酸处理而制备的具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的美白作用，使用B16F1黑素细胞评价提取物对抑制黑色素生成的作用。
具体地，从ATCC(American Type Culture Collection)获得B16F1黑素细胞(小鼠来源的细胞)，并用于该实施例中。将B16F1黑素细胞以每孔2×105个细胞的密度分配到6孔板中，附着于每个孔，然后以不引起毒性的浓度分配。然后，用300μg/ml的在比较实施例1中制备的莲愈伤组织提取物的冻干物和300μg/ml的在实施例2中制备的具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的冻干物中的每一种处理细胞，并将细胞在CO2温育箱中于37℃温育72小时。作为对照，使用10nM的α-黑素细胞刺激激素(α-melanocyte-stimulatinghormone，α-MSH)，并以与测试物质相同的方式温育。温育72小时后，用胰蛋白酶-EDTA使细胞分离，计数，然后通过离心收集。使用Lotan方法(Lotan，Cancer Res.，40：3345-3350,1980)的改进进行细胞中黑色素的定量。将细胞丸块用PBS洗涤一次，然后向其中加入1ml匀浆缓冲液(50mM磷酸钠，pH6.8，1％Triton X-100，2mM PMSF)，并通过涡旋持续5分钟使细胞裂解。将1N NaOH(10％DMSO)加入到通过离心(在3,000rpm持续10分钟)获得的细胞过滤液中，以提取黑色素。将提取的黑色素溶解，通过酶标仪在490nm处测量其吸光度，然后定量，并测量蛋白质的量。
通过计算每单位蛋白质的黑色素的量，并通过使用以下等式1计算相对于对照的变化，来评价样品中的黑色素生成(％)。结果如表3所示。
[等式1]
黑色素生成(％)＝B/A*100
A：对照孔中的黑色素的量(对照)/总蛋白质；
B：含有莲愈伤组织提取物的孔中的黑色素的量(实施例)/总蛋白质。
[表3]
作为结果，如上表3所示，比较实施例1的莲愈伤组织提取物的冻干物显示出约3％的黑色素合成抑制作用，这是不显著的。与此相比，在具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的冻干物当中，在实施例2-1和2-2中通过用100μM或200μM的甲基茉莉酸作为诱导子处理而制备的提取物抑制约20％的黑色素合成。然而，用400μM甲基茉莉酸作为诱导子处理的组显示增加的黑色素合成，并且认为该结果是由于高细胞毒性导致细胞数量减少，因此黑色素合成似乎相对增加。
实验实施例4：对人皮肤的美白作用的测试
在24名健康的20-60岁女性中，评价含有0.5％莲愈伤组织提取物(通过用200μM甲基茉莉酸处理而制备)的冻干物的霜剂的美白改善作用。用清洁剂清洗每个入选受试者的面部，然后使受试者保持在恒温恒湿条件下的等候室(温度：22±2℃，湿度：50±10％)中持续30分钟，以使皮肤表面温度和湿度适应测量空间的环境。
使用含有0.5％莲愈伤组织提取物的冻干物的霜剂和安慰剂霜剂，进行美白作用测试。在第一次访问时，将测试霜剂和对照霜剂随机地分配到面部的左右区域，并测量皮肤亮度。此后，将霜剂制剂在早晨和晚上施用于左右面部区域。
在使用每种霜剂4周和8周后，使用CM-2600d(美能达，日本)定量地测量皮肤亮度(L值)，并通过使用血红素测试仪(Mexameter)和窄带反射分光光度计(Narrow-bandreflectance spectrophotometer)，通过测量由探针(probe)以568nm(绿色)、660nm(红色)和880nm(红外线)发射并经皮肤反射的光来评价皮肤黑色素指数。
L值为亮度参数(brightness parameter)，L值中的L表示亮度(brightness)。L值以0到100的数字表示。
在访问时进行仪器评价，并用色度计(Chromameter)测量测试区域三次，并将测量值取平均值。使用以下等式2计算使用色度计测量的皮肤亮度的增加率：
[等式2]
L值的增加率(％)＝((施用样品后的L值)-(施用样品前的L值))/(施用样品前的L值)*100
作为结果，如图4所示，在施用含有0.5％的霜剂8周后测量的L值(平均值)从施用前的59.8增加至施用8周后的61.8(增加3.4％)。如根据正态性检验通过配对样品t-检验(Paired samples t-test)所测试，施用8周后的值的P值(P-value)小于0.05，表明该值增加至统计学显著水平。
此外，如图5所示，皮肤黑色素指数(平均值)从施用前的197.7降低至施用8周后的174.9(降低11.8％)。如根据正态性检验通过配对样品t-检验(Paired samples t-test)所测试，施用8周后的黑色素指数的P值(P-value)小于0.05，表明该值增加至统计学显著水平。
制剂实施例：制备制剂以确认化妆品组合物的稳定性
为了确认含有具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的化妆品组合物的稳定性，根据以下制剂实施例1至3制备含有上述实施例2-2的莲愈伤组织提取物的冻干物的制剂(增溶制剂、精油制剂和霜剂制剂)。
制剂实施例1)增溶制剂的制备
[表4]
<制备方法>
(1)将水相和增溶相的各组分均匀混合并溶解。
(2)将增溶相加入水相并与水相混合，然后增溶。
(3)将添加物I(含有在实施例2-2中通过用200μM甲基茉莉酸处理而制备的莲愈伤组织提取物的冻干物的相)增溶，加入并混合，然后加入添加物II。
制剂实施例2)精油制剂的制备
[表5]
<制备方法>
(1)将水相和油相的各组分加热，均匀混合并混合。
(2)在75℃，将油相加入至水相中，然后乳化。
(3)在50℃将添加物相I(含有在实施例2-2中通过用200μM甲基茉莉酸处理而制备的莲愈伤组织提取物的冻干物的相)加入并混合，然后向其中加入添加物相II。
制剂实施例3)霜剂制剂的制备
[表6]
<制备方法>
(1)将水相和油相的各组分加热，均匀混合并溶解。
(2)在75℃，将油相加入至水相中，然后乳化。
(3)在50℃将添加物相I(含有在实施例2-2中通过用200μM甲基茉莉酸处理而制备的莲愈伤组织提取物的冻干物的相)加入并混合，然后向其中加入添加物相II。
实验实施例5：含有具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的化妆品组合 物的稳定性的评价
1)具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的原料稳定性的评价
为了检查原料稳定性，将制剂实施例1)至3)的增溶制剂、精油制剂和霜剂制剂在4℃、30℃、45℃和日光的条件下储存12周。然后，根据与实验实施例1中所描述相同的方法，通过HPLC分析观察具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的冻干物的没食子酸含量的时间依赖性变化，结果示于下表7中。
[表7]
作为结果，如上表7中所示，在所有的增溶制剂、精油制剂和霜剂制剂中，具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的冻干物的活性成分没食子酸在高温和日光条件下高度稳定。
2)含有具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的化妆品组合物的制剂稳 定性的评价
为了检查制剂稳定性，将制剂实施例1至3的增溶制剂、精油制剂和霜剂制剂在4℃、30℃、45℃和日光的条件下储存12周。然后，通过视觉评价和感官评价观察颜色、气味和制剂的变化，结果示于下表8至10中。在这方面，根据以下标准评价颜色、气味和制剂的变化。
<评价标准>
无变化：○；
轻微变化：△；
显著变化：X。
[表8]
[表9]
[表10]
作为结果，如上表8至10所示，增溶制剂、精油制剂和霜剂制剂在高温和日光条件下都是高度稳定的。
实验实施例6：含有具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的化妆品组合 物的皮肤刺激性的评价
为了评价含有具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的化妆品组合物的皮肤刺激性，评价制剂实施例3的霜剂制剂的皮肤刺激性。
具体地，将预定量(20μl)的含有具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的冻干物的霜剂制剂(在制剂实施例3中制备)施用于30名成年人每个人的背部5x 20cm区域持续24小时，然后去除。在1小时和24小时后，用肉眼观察皮肤状况的变化，结果示于下表11中。在这方面，根据以下标准评价皮肤状况的变化。
<用于评价皮肤状况的标准>
0：无变化；
1：极轻微变化；
2：轻微变化；
3：轻微严重变化；
4：严重变化；
5：极严重变化。
<表11>
作为结果，如上表11所示，含有具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的冻干物的霜剂制剂也没有皮肤刺激性。

Claims (13)

1.一种莲(Nelumbo Nucifera)愈伤组织提取物，其具有增加的没食子酸(Gallicacid)含量，其通过在含有甲基茉莉酸(Methyl Jasmonic acid)的介质中培养而获得。
2.根据权利要求1所述的莲愈伤组织提取物，其中甲基茉莉酸的浓度为100至400μM。
3.根据权利要求1所述的莲愈伤组织提取物，其中没食子酸含量比在不含甲基茉莉酸的介质中培养的莲愈伤组织的没食子酸含量增加至少10倍。
4.根据权利要求1所述的莲愈伤组织提取物，其中没食子酸含量为基于提取物的总重量的0.01至10.0重量％。
5.根据权利要求1所述的莲愈伤组织提取物，其中莲愈伤组织来源于阿罗红莲的种子。
6.一种美白化妆品组合物，其包含通过在含有甲基茉莉酸(Methyl Jasmonic acid)的介质中培养而获得的具有增加的没食子酸(Gallic acid)含量的莲(Nelumbo Nucifera)愈伤组织、其裂解物、其提取物和其培养物中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的美白化妆品组合物，其中莲愈伤组织、其裂解物、其提取物和其培养物中的至少一种的量为基于组合物的总重量的0.1至30.0重量％。
8.一种用于增加莲愈伤组织或其提取物的没食子酸含量的方法，所述方法包括在含有甲基茉莉酸(Methyl Jasmonic acid)的介质中培养莲愈伤组织的步骤。
9.一种用于制备具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使莲(Nelumbo Nucifera)种子发芽；
(b)从发芽的莲组织中诱导出莲愈伤组织；
(c)在含有甲基茉莉酸的介质中培养莲愈伤组织；和
(d)提取具有增加的没食子酸含量的莲愈伤组织培养物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述方法中处理的甲基茉莉酸的浓度为100至400μM。
11.根据权利要求9所述的方法，其中通过所述方法获得的提取物的没食子酸含量比在不含甲基茉莉酸的介质中培养的莲愈伤组织的没食子酸含量增加至少10倍。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述莲为阿罗红莲。
13.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(c)的培养开始后4至6周将甲基茉莉酸加入到介质中。
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