JP2019510828A - 没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物、その製造方法及びそれを含有する美白用化粧料組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）含有量が増大したハスカルスまたはその抽出物及びその製造方法に関する。本発明に係るハスカルス抽出物は、没食子酸が多量に含まれており、優れた美白効果を有するため、化粧料組成物として有用に使用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、没食子酸含有量が増大したハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）カルス抽出物およびその製造方法に関する。また、前記抽出物を含む、優れた皮膚美白効果を有する化粧料組成物に関する。

皮膚の黒化（Ｍｅｌａｎｉｓｍ）は、内的・外的な要因に対する皮膚細胞の反応によって発生するもので、代表的な要因は、皮膚の紫外線への露出である。つまり、皮膚が紫外線にさらされるとチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）が活性化され、これは、皮膚組織に存在するアミノ酸の一種であるチロシンに作用してドーパ（ｄｏｐａ）を生成させる。その後、再びドーパキノン（ｄｏｐａｑｕｉｎｏｎｅ）を生成させる酸化プロセスにより皮膚の色素細胞であるメラノサイト（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）内のメラノソーム（Ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ）においてメラニンという重合体が合成される。このメラニンは、皮膚の角質形成細胞であるケラチノサイト（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）に受け渡され、角質化プロセスにより皮膚の表面に到達し、紫外線から皮膚を保護する役目をする。

メラニンは、人体に欠かせない紫外線吸収剤であり、タンパク質、脂質、核酸などの生体成分を変形させる様々なラジカルを除去するのに効果的なフリーラジカル消去剤の役割を果たす。しかしながら、メラニンが局所的に過剰に合成されるか皮膚病変および老化に伴って皮膚の生理機能が低下すると、メラニンが皮膚の表面に沈着し、シミ、そばかすができるなど様々な色素沈着を引き起こす。

このような皮膚黒化の原因とメカニズムが解明されているから、皮膚黒化過程に関与するチロシナーゼの活性阻害効果を有する物質を化粧料に配合する方法、あるいはメラニンの生成過程中の一部の反応を阻害することにより、メラニンの生成を減少させる方法が、皮膚黒化を防止するために一般的に使用されている。この目的のために使われている代表的な物質としては、アルブチン、アスコルビン酸、ハイドロキノンなどがある。しかしながら、アルブチンの場合、優れたチロシナーゼ活性阻害作用を有する一方、化粧品に配合時に変色や経時変化に伴う効力が低下するなどの安定性に問題がある。さらに、アルブチンは皮膚刺激性が大きいため、使用上の制限がある。アスコルビン酸は、チロシナーゼ活性阻害効果が低く、分子自体の安定性が低いため、メラニン生成抑制剤として適していないという問題がある。ハイドロキノンは、皮膚への刺激が高く安全性に問題があるので、現在、化粧品に配合時に、その使用が制限されるという問題がある。

一方、天然由来の植物抽出物に様々な生理活性を示す有効成分が含有されていることが明らかになって、美白物質を代替して適切な美白効果を示す植物抽出物への関心が生じている。

美白効果を示す植物抽出物を見出すための一環として、ハス抽出物の利用に関する研究（大韓民国登録特許第０８２８１９３号）がある。しかし、その場合、ハスを直接栽培する過程が必要なので時間的にも空間的にも制約があり、単純な抽出では十分な活性を有する有効成分が得られないという問題があった。

また、上記限界を克服するためにハスカルスの利用に関心が高まっている。しかしながら、一般的なハスカルス抽出物は、低濃度では効果が発揮せず、実際、ヒトの皮膚への臨床試験に際して美白効果が微弱であるという問題があった。

大韓民国登録特許第０８２８１９３号

そこで、本発明者らは、美白効果を最大限に発揮させたハスカルス抽出物を得るための研究を行い、その結果、ハス組織から誘導されたハスカルスをメチルジャスモン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有する培地で培養して、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を製造し、前記没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物から優れた美白効能を確認することにより、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明が解決しようとする課題は、没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）の含有量が増大したハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）カルスまたはその抽出物を提供することである。

また、本発明が解決しようとする他の課題は、ハスカルスまたはその抽出物の没食子酸含有量を増大させる方法を提供することである。

また、本発明が解決しようとするまた他の課題は、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を製造する方法を提供することである。

また、本発明が解決しようとするまた他の課題は、前記没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を有効成分として含有する美白用化粧料組成物を提供することである。

上記課題を解決するために、本発明は、没食子酸含有量が増大したハスカルスまたはその抽出物及びその製造方法、並びに前記抽出物を含む、優れた皮膚美白効果を有する化粧料組成物を提供する。

以下、本発明についてより具体的に説明する。

本発明は、没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）の含有量が増大したハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）カルスまたはその抽出物を提供する。

ハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）は、池で栽培される多年生植物である。根は横に広がって、円柱形であり、節が多く、秋に先端部が特に太くなる。葉は根茎から出てきて水面より高く上がっており、円形に近い形をして、葉脈が四方に広がっており、直径は４０ｃｍ程度であり、水に濡れにくく、葉柄に突起のようなとげがある。７月から８月にかけて紅色、または白色の花が咲き、直径は１５〜２０ｃｍである。花茎には葉柄のようにとげが生えており、先端に１つの花がついている。１０月に実が熟し、形は楕円形で、長さ約２ｃｍで、食用である。ハスの実または種子を蓮子、ハスの成熟した種子の緑色の胚芽を蓮子芯、ハスの成熟した種子の白い中身を蓮肉、ハスの雄蕊を蓮鬚、ハスの葉を荷葉、根茎（地下茎）を藕、根茎の節部を藕節という。ハスの葉である荷葉は下痢、頭痛、めまい、吐血、産後の淤血治療、夜尿症、解毒作用に使われるものとして知られている。

本発明で使用されるハスカルスは、「阿羅紅蓮（アラホンリョン）」と呼ばれるハスの種子から誘導されたものであるが、これに限定されるものではない。「阿羅紅蓮」とは、
韓国の慶尚南道の咸安郡にある城山山城で発掘された約７００年前のハスの種から育ったハスであり、咸安蓮花ともいう。阿羅紅蓮は、韓国の高麗時代の仏教絵画に見られる花びらが長く色が薄い鮮紅色の花である。花びらをすぼめてから再び広げるたびに色がますます薄れていき、終わりは花びらの先端にだけ濃い鮮紅色をしていることが特徴である。花びらの根もとは真っ白な色で、先の方へ行くにつれてだんだん濃い鮮紅色になっており、さらに長い花びらのシンプルでありながらも優雅な形をしていることから、今のハスとは比較にならない孤高の姿を誇っている。

前記カルス（Ｃａｌｌｕｓ）とは、植物体から切り取った組織をオーキシン含有の培地で培養したり、ある種類の植物に傷をつけたり、傷口をオーキシンで処理する際に生じる特殊な組織または細胞塊をいう。一般に、カルスは、正常な器官形成や組織分化を引き起こす能力を失った無定形の組織または細胞塊であって、ほとんど実質細胞となっている。広い意味では、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの感染によって生じる植物の腫瘍組織をも含むことがある。

つまり、植物内の細胞は、増殖するとすぐ方向が決められて特定の組織だけでなく器官を規則的に構成する。しかしながら、組織培養により形成された未分化細胞塊であるカルスは、外部からの様々な植物成長ホルモンなどの刺激が与えられると、その時まで維持されてきた制御が解除され、細胞がランダムに増殖すると考えられる。

脱分化によって得られたカルスを、同じ組成を有する液体培地に入れて振とう培養すると、細胞は別々に離れて懸濁状態で増殖し続ける。このカルスや培養細胞は、新しい培地で継代培養することにより、永久的に分裂および増殖することができるから、植物全体が老化して死んでいく分化細胞とは本質的に異なる。約数世代にわたって継代培養したカルスまたは培養細胞を、様々な植物の成長ホルモンが除去された固形培地に塗布しておくと、芽と根が出てきて個体植物が復元される。この再生植物は、１つの培養細胞の分裂および増殖から由来し、その培養細胞は、胚軸または他の組織から由来する。

本発明において、「ハスカルス」はハスのどの部位から誘導されたものであっても可能である。一実施形態として、ハス種子の発芽した幼苗から切り取った子葉（双葉）から誘導されたカルスであり得る。ハスの任意の組織からその一部を切り取ってオーキシンおよびサイトカイニンの含有量を調節した培地に載置しておくと、カルスが形成され得る。

本発明において、「ハスカルス培養物」は、ハスカルスを培地で培養したものである。前記培地は、当該技術分野においてカルス培養に一般的に使われている培地であれば、制限なく使用可能である。

前記没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）は、ガルス酸または没食子酸とも呼ばれ、下記化学式１で表される構造を有する。

前記没食子酸は、植物細胞の正常な代謝過程で副産物として生産され、細胞内の特殊な場所に蓄積される二次代謝産物の一種である。没食子酸は、美白効果があることが知られている。

本発明において、前記没食子酸含有量が増大したハスカルスは、メチルジャスモン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有する培地でハスカルスを培養して製造することができる。前記没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物は、メチルジャスモン酸を含有する培地でハスカルスを培養した後に抽出して製造することができる。

前記メチルジャスモン酸は、二次代謝産物である没食子酸含有量を高めるために使用される誘導因子である。ハスカルスを１００〜４００μＭのメチルジャスモン酸を含有する培地で培養することができ、具体的には１００〜２５０μＭのメチルジャスモン酸を含有する培地で培養することができ、より具体的には、２００μＭのメチルジャスモン酸を含有する培地で培養することができるが、これらに限定されるものではない。培地に含有されるメチルジャスモン酸の濃度が１００μＭ未満である場合、生理活性物質の含有量の変化に大きな影響がない一方、メチルジャスモン酸の濃度が４００μＭを超える場合には、ハスカルスが褐変してカルスの維持が難しい。

本発明において、「誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）」は、植物の各種防御メカニズムを増加させる植物免疫活性物質である。

前記没食子酸の含有量が増大したハスカルスまたはその抽出物は、没食子酸を抽出物総重量に対して０．０１〜１０重量％含有することができ、より具体的には０．１〜３重量％を含有することができるが、これらに限定されるものではない。

前記没食子酸の含有量が増大したハスカルス、その溶解物、その抽出物またはその培養物は、組成物に含ませてもよい。

本発明において、「溶解物」は、カルスを化学的または物理的方法などで溶解して得られた細胞溶解物を意味し、「抽出物」は、カルスを溶媒に溶かして分離した物質であり、蒸留または蒸発を利用して濃縮することができる。また、「培養物」は、培養液および／または培養されたカルスを含む物質である。

本発明の一実施形態において、ハスカルスをメチルジャスモン酸を含有する培地で培養して抽出したハスカルス抽出物において没食子酸の含有量が増大していることが示された。特に、メチルジャスモン酸２００μＭを含有する培地で培養したハスカルス抽出物が最も高い没食子酸含有量を有することが示された。

本発明の一実施形態において、メチルジャスモン酸を含有する培地で培養したハスカルス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）抽出物における没食子酸含有量は、メチルジャスモン酸非含有の培地で培養したハスカルスのそれに比べて１０倍以上増大していることが示された。

また、本発明は、以下の段階を含む、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の製造方法を提供する：
（ａ）ハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）種子を発芽させる段階；
（ｂ）前記発芽されたハス組織からハスカルスを誘導する段階；
（ｃ）前記ハスカルスをメチルジャスモン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有する培地で培養する段階；および
（ｄ）前記没食子酸含有量が増大したハスカルス培養物を抽出する段階。

本発明の製造方法において、前記段階（ｂ）において、ハスの種子を発芽させてカルスを誘導するために、適切な培地を選択することができる。当該技術分野でカルス培養に一般的に使われている培地であればいずれも制限なく使用することができる。植物においては、通常、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地、Ｂ５培地などを主に使用し、例えば、ＭＳ基礎固体培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、１９６２、Ｄｕｃｈｅｆａ社、Ｃａｔ Ｎｏ． Ｍ０２２１）の組成（１Ｌ基準時）は、ＮＨ₄ＮＯ₃ １６５０ｍｇ、ＫＮＯ₃ １９００ｍｇ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ４４０ｍｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３７０ｍｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １７０ｍｇ、ＫＩ ０．８３ｍｇ、Ｈ₃ＢＯ₃ ６．２ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ２２．３ｍｇ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ８．６ｍｇ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．２５ｍｇ、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０．０２５ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２７．８ｍｇ、Ｎａ₂ＥＤＴＡ・２Ｈ₂Ｏ ３７．３ｍｇ、ミオイノシトール（Ｍｙｏｉｎｏｓｉｔｏｌ）１００ｍｇ、ニコチン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ）０．５ｍｇ、塩酸ピリドキシン（Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ）０．５ｍｇ、塩酸チアミン （Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ）０．５ｍｇ、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）２ｍｇ、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）３００００ｍｇである。

本発明の一実施形態において、ハス種子からカルスを誘導するための培地として、前記ＭＳ基礎固体培地にスクロース４０．０ｇ／Ｌ、寒天（Ａｇａｒ）５〜１０．０ｇ／Ｌ、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）０．５ｍｇ／Ｌ、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）１．０ｍｇ／Ｌを含有する培地を用いることができる。ここで、前記培地のｐＨは５．５〜６．０である。より具体的にはｐＨ５．７〜５．８である。

本発明の製造方法において、前記段階（ｃ）において、二次代謝産物である没食子酸含有量を高めるために、ハスカルスを１００〜４００μＭのメチルジャスモン酸を含有する培地で培養することができ、具体的には１００〜２５０μＭのメチルジャスモン酸を含有する培地で培養することができ、より具体的には、２００μＭのメチルジャスモン酸を含有する培地で培養することができるが、これらに限定されるものではない。

前記メチルジャスモン酸を含有する培地は、当該技術分野でカルス培養に一般的に使われている培地であればいずれも制限なく使用可能である。

本発明の一実施形態において、一般的なハスカルス抽出物に比べて、誘導因子としてメチルジャスモン酸を含有する培地で培養して得られたハスカルス抽出物の没食子酸含有量が増大することが示された。特に、メチルジャスモン酸２００μＭを含有する培地で培養して得られたハスカルス抽出物の没食子酸含有量が最も高いことが示された。

前記段階（ｃ）において培養開始日から４乃至６週目にメチルジャスモン酸を培地に添加することが好ましい。メチルジャスモン酸を４週目よりも早く添加した場合には、ハス細胞が十分に培養されていないため、没食子酸を含有するカルスが十分に生成されていない可能性があり、メチルジャスモン酸を６週目よりも遅く添加した場合には、ハス細胞の量が多いため、ハス細胞をカルス化するには適していない可能性がある。より好ましくは、培養開始日から５週目にメチルジャスモン酸を培地に添加することができる。

本発明の製造方法において、前記段階（ｄ）における抽出方法としては、ろ過法、熱水抽出、エタノール抽出、浸漬抽出、還流冷却抽出、超音波抽出、超臨界抽出が挙げられ、より具体的には熱水抽出が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の製造方法において、前記段階（ｄ）により得られた抽出物は、没食子酸を抽出物の総重量に基づいて０．０１〜１０重量％を含有することができ、より具体的には０．１〜３重量％を含有することができるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明は、没食子酸の含有量が増大したハスカルス抽出物を有効成分として含有する美白用化粧料組成物を提供する。

前記組成物において没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物は、該組成物の総重量に基づいて、０．１〜３０重量％で含有することができる。前記抽出物の含有量が０．１重量％未満である場合には、皮膚美白改善効果が奏されず、３０重量％を超過する場合には、含有量増加による皮膚美白改善効果増大の程度が微々たるものであり、剤形上の安全および安定性に問題があり、経済的ではない。

本発明の化粧料組成物において、剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として、動物性油脂、植物性油脂、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。

本発明の化粧料組成物において、剤形が溶液または乳液である場合は、担体成分として、溶媒、可溶化剤または乳化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが用いられる。

本発明の化粧料組成物において、剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液体希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの乳化剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガカントなどが用いられる。

本発明の化粧料組成物において、剤形がパウダーまたはスプレーである場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーである場合は、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルなどの高圧ガスを含むことができる。

本発明の化粧料組成物において、剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコール硫酸、脂肪族アルコールエーテル硫酸塩、スルホンコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリニウム誘導体、サルコシン酸、脂肪酸アミ
ドエーテル硫酸塩、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられる。

本発明の化粧料組成物において、界面活性剤含有クレンジング剤形、界面活性剤非含有クレンジング剤形、又は石鹸である場合、皮膚に塗布した後、拭き取るか、外すか、水で洗うこともできる。例えば、前記石鹸は、液状石鹸、粉石鹸、固形石鹸及びオイル石鹸であり、これらに限定されるものではない。前記界面活性剤含有クレンジング剤形は、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングタオルおよびクレンジングパックであり、これらに限定されるものではない。前記界面活性剤非含有クレンジング剤形は、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングウォーターおよびクレンジングゲルであり、これらに限定されるものではない。

本発明の化粧料組成物は、本発明以外の他の化粧料組成物と組み合わせて使用することができる。また、本発明に係る化粧料組成物は、通常の使用方法により使用することができ、使用者の皮膚状態又は好みによってその使用回数を異ならせることができる。

本発明に係る化粧料組成物は、ハス組織からカルスを誘導した後、特定の濃度のメチルジャスモン酸を含有する培地でカルスを培養して抽出した、没食子酸の含有量が増大したハスカルス抽出物を有効成分として含有する。化粧料組成物は、この抽出物によってメラニン生成を抑制することにより、優れた皮膚美白効果を発揮する。

本発明において、「ハスカルス」はハスの任意の部位から誘導されたものであっても可能であるが、一実施形態を挙げれば、ハス種子の発芽された幼苗から子葉を切り取って誘導したカルスであってもよく、ハスの任意の組織からその一部を切り取ってオーキシンおよびサイトカイニンの含有量を調節した培地に載置しておけば、カルスが形成されることがある。

本発明において、「ハスカルス培養物」は、ハスカルスを特定の培地で培養したものである。

本発明において、「誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）」は、植物の各種防御メカニズムを増加させる植物免疫活性物質である。

本発明において、「有効成分として含有する」とは、化粧料組成物が、例えば、皮膚細胞のメラニン生成を抑制することにより、皮膚美白効果を奏することができるような有効成分を含有することを意味する。

本発明による没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）含有量が増大したハスカルスまたはその抽出物は、没食子酸が多量に含まれているため、メラニン生成を抑制して皮膚美白効果を発揮する。したがって、本発明は、美白用化粧料組成物として有用に使用可能である。

比較例１により製造されたハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）カルス抽出物の没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）含有量をＨＰＬＣにより分析した結果である。 実施例２−２により製造されたハスカルス抽出物の没食子酸含有量をＨＰＬＣにより分析した結果である。 カルス化されていないハス抽出物（比較例５〜７）の没食子酸含有量をＨＰＬＣにより分析した結果である。 ハスカルス抽出物（２００μＭメチルジャスモン酸処理）凍結乾燥物０．５％含有クリームを顔面に塗布し、皮膚明度（Ｌ ｖａｌｕｅ）の変化を測定した結果である。 ハスカルス抽出物（２００μＭメチルジャスモン酸処理）凍結乾燥物０．５％含有クリームを顔面に塗布し、皮膚のメラニン数値の変化を測定した結果である。

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を具体的に例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

参考例：ハス種子の入手
本実施例においては、ハスのうち２００９年韓国の慶尚南道の咸安郡にある城山山城で発掘された約７００年前の高麗時代のハス種子を栽培して、２０１０〜２０１２年の３年間にわたって収穫したハス種子３０粒を慶尚南道の咸安郡の伽ヤ邑（カヤウプ）にある咸安博物館から入手して使用した。

実施例１．ハスカルスの製造
無菌処理したハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）の種子をホルモンが添加されていないＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）基礎固体培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、１９６２、Ｄｕｃｈｅｆａ社、Ｃａｔ Ｎｏ． Ｍ０２２１）に播種して、２５〜２８℃で１８時間の日長条件（長日）下で発芽させた。

発芽した幼苗についた子葉を鋭いナイフで３〜５ｃｍ程度切り取り、ＭＳ基礎固体培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、１９６２、Ｄｕｃｈｅｆａ社、Ｃａｔ Ｎｏ． Ｍ０２２１）にスクロース４０．０ｇ／Ｌ、寒天５〜１０．０ｇ／Ｌ、α−ナフタレン酢酸０．５ｍｇ／Ｌおよび６−ベンジルアミノプリン１．０ｍｇ／Ｌを含有したｐＨ５．８のＭＳ基礎固体培地に置かれた。約２週後に子葉からカルスと共に新芽（ｓｈｏｏｔ）が生成されて、ルーチン選別培地で継代培養しながらカルスを維持した。

上記で製造された、ＭＳ基礎固体培地にスクロース４０．０ｇ／Ｌ、寒天５〜１０．０ｇ／Ｌ、α−ナフタレン酢酸０．５ｍｇ／Ｌおよび６−ベンジルアミノプリン１．０ｍｇ／Ｌの植物生長調節物質を添加した培地で２５℃の培養条件下で４週間培養し、その後、培養５週目にメチルジャスモン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）をそれぞれ１００μＭ、２００μＭ、４００μＭの濃度で培地に添加して培養した。

実施例２．ハスカルス抽出物の製造
上記で得られたそれぞれのハスカルスを収穫して複数回水洗し、真空凍結乾燥機（Ｉｌｓｈｉｎ、Ｃａｔ ｎｏ．ＬＰ−５０）で３日間乾燥させた。乾燥したハスカルス１ｋｇを容器に入れ、１００Ｌの精製水を入れた後、９０〜１２０℃で４８時間熱水抽出した。抽出後ろ過して固形分を除去し、ハスカルス抽出物を製造した。

メチルジャスモン酸１００μＭ、２００μＭ、４００μＭを含有する培地で培養したハスカルスをそれぞれ実施例２−１、実施例２−２、実施例２−３と称した。

比較例１乃至４．誘導因子処理による比較例の製造
誘導因子であるメチルジャスモン酸を添加しなかったり、メチルジャスモン酸の代わりにサリチル酸（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ、ＳＡ）１００μＭ、２００μＭ、４００μＭをそれぞれ培地に添加することを除いては、上述した実施例１及び２と同様の方法で
ハスカルスを製造し、熱水抽出してハスカルス抽出物を製造した。

メチルジャスモン酸非含有培地で培養したハスカルス抽出物を比較例１と称し、サリチル酸１００μＭ、２００μＭまたは４００μＭを含有する培地で培養したハスカルス抽出物を、それぞれ比較例２、比較例３または比較例４と称した。

比較例５乃至７．ハスの部位別非カルス化比較例の製造
ハスの花の種およびハスの葉は、咸安郡地域で得られた。ハスの葉を５５℃で８時間乾燥させ、ミキサーで粉砕して、重量５０ｇに抽出溶媒としての水７５０ｍｌを加えて６時間抽出した。得られた抽出物を比較例５と称した。

比較例６および７を得るために、蓮子を切ってそれぞれ蓮子芯、蓮肉に分離し、これに水を加えて６時間抽出した。その後、１％濾過助剤を投入して濾過した後、８０℃で乾燥させた。蓮心の水抽出物は比較例６と称し、蓮肉の水抽出物は比較例７と称した。

実験例１．誘導因子の種類および濃度によるハスカルス抽出物の没食子酸含有量の増大の確認
誘導因子の種類および濃度によるハスカルスの没食子酸含有量の増大有無を確認するために、前記実施例２および比較例１乃至４により製造されたハスカルス抽出物に対してＨＰＬＣにより没食子酸含有量を測定した。

具体的には、前記実施例２−１、２−２および２−３で製造されたハスカルス抽出物の凍結乾燥物０．１ｇをそれぞれ精製水で溶解して、１０ｍｌの各検液を得た。また、没食子酸（Ｃ₇Ｈ₆Ｏ₅：１７０．１２）標準品１０ｍｇを精製水で１００ｍｌになるように溶解した後、このうち０．５ｍｌを精製水で１００ｍｌになるよう再度溶解し、１／２、１／４に希釈して標準液を得た。前記検液及び標準液のそれぞれ２０μｌを用いてＨＰＬＣ分析を行った。

ＨＰＬＣによる分析では、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を用いた。カラムは、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０ ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍを用いた。移動相としては、０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＦＡ）と０．１％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ；Ｂ）との混合溶液を用い、３５分に渡ってＢの含有量を０％から９０％に所定の勾配で増加させながら進行した。流速は毎分１．０ｍｌであり、紫外線検出器の検出波長は２７０ｎｍに設定した。ＨＰＬＣにより測定したハスカルス抽出物のそれぞれの没食子酸含有量を、図１、図２および表１に示した。

その結果、図１及び図２に示すように、前記比較例１により製造されたハスカルス抽出物では没食子酸が検出されていないのに対し（図１）、実施例２−２のメチルジャスモン酸で処理されたハスカルス抽出物では没食子酸が検出されることが確認された（図２）。

また、前記表１に示すように、比較例１により製造されたハスカルス抽出物だけでなく、サリチル酸で処理された比較例２乃至４に対するＨＰＬＣの結果からも、没食子酸を示すピークが見られないため、サリチル酸で処理されたハスカルス抽出物からも没食子酸が検出されていないことが確認された。

一方、メチルジャスモン酸で処理して製造されたハスカルス抽出物である実施例２−１乃至２−３では、没食子酸含有量が増大することが確認されており、特に２００μＭのメチルジャスモン酸を含有する培地で培養したハスカルス抽出物（実施例２−２）の没食子酸含有量が最も高いことが確認された。

実験例２．非カルス化されたハス部位別抽出物の没食子酸含有量の確認
前記実施例２−２および比較例５乃至７の抽出サンプルにおける没食子酸含有量を測定するためにＨＰＬＣ分析を行った。

ＨＰＬＣによる分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を用いて行った。カラムは、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０
２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５ｕｍを用いた。移動相としては、０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＦＡ）と０．１％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ；Ｂ）との混合溶液を用い、３５分にわたってＢの含有量を０％から９０％に所定の勾配で増加させた。流速は毎分１．０ｍｌであり、紫外線検出器の検出波長は２７０ｎｍに設定した。比較例５乃至７の抽出物のそれぞれの没食子酸含有量は、ＨＰＬＣにより測定されて図３に示した。

その結果、実施例２−２により製造されたハスカルス抽出物では没食子酸が検出されるのに対し（図２参照）、カルス化していない比較例５乃至７の抽出物では没食子酸が検出されていないことが確認された（図３を参照）。実施例２−２および比較例５乃至７の没食子酸含有量は、前記表２に示した。

実験例３．没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の美白効果の確認
前記実施例２で製造されたメチルジャスモン酸処理により没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の美白効果を確認するために、Ｂ１６Ｆ１メラニン形成細胞に対するメラニン生成抑制効果を確認した。

具体的には、Ｂ１６Ｆ１メラニン形成細胞は、マウスから由来した細胞群であって、Ａ
ＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られて使用した。前記Ｂ１６Ｆ１メラニン形成細胞を６ウェルプレートに各ウェル当たり２×１０⁵の濃度で株分けし、細胞を付着させた後、毒性を誘発しない濃度で株分けした。その後、前記比較例１により製造されたハスカルス抽出物の凍結乾燥物３００ｕｇ／ｍｌと、実施例２により製造された没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の凍結乾燥物３００ｕｇ／ｍｌと、を処理して、７２時間にわたって３７℃の条件、ＣＯ₂インキュベーターで培養した。対照群としてメラニン細胞刺激ホルモン（α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、α−ＭＳＨ）１０ｎＭを用い、実験群と同様に培養した。７２時間培養後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥がし、細胞数を測定した後、遠心分離して細胞を回収した。細胞内のメラニンの定量は、ロータン（Ｌｏｔａｎ：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４０：３３４５−３３５０、１９８０）の方法を変形して実施した。セルペレットをＰＢＳで１回洗浄した後、均質化バッファー液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＰＭＳＦ）１ｍｌを添加し、５分間ボルテックスして細胞を破砕した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）して得られた細胞濾液に１Ｎ ＮａＯＨ（１０％ＤＭＳＯ）を添加し、抽出されたメラニンを溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎＭでメラニンの吸光度を測定した後、メラニンを定量し、タンパク質の量を測定した。

試料のメラニン生成率（％）は、単位タンパク質当たりのメラニン量を計算して、対照に比べて変化した量を下記数学式１により計算し、その結果を下記表３に示した。

メラニン生成率（％）＝Ｂ／Ａ×１００ （式１）
Ａ：対照ウェル（対照）のメラニン量／総タンパク質
Ｂ：ハスカルス抽出物を添加したウェル（実施例）のメラニン量／総タンパク質

その結果、前記表３に示すように、比較例１によるハスカルス抽出物の凍結乾燥物では、メラニン合成阻害効果が約３％程度と微々たるものであることが確認されたのに対して、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の凍結乾燥物のうち１００μＭまたは２００μＭのメチルジャスモン酸を誘導因子として処理された実施例２−１および２−２では、メラニン合成阻害効果が約２０％程度であることが確認された。一方、４００μＭメチルジャスモン酸を誘導因子として処理された群では、数値上でメラニン合成が増加した結果が得られたが、これは細胞毒性が高いために細胞の数が減少し、これにより相対的にメラニン合成が増加したように見えることが確認された。

実験例４．人体の皮膚に対する美白効果試験
健康な２４人の２０〜６０歳の女性を対象として、ハスカルスの抽出（２００μＭメチルジャスモン酸処理）の凍結乾燥物０．５％含有クリームの美白改善効果を確認した。選定された対象者の顔面をクレンザーで洗顔した後、室温２２±２℃、湿度５０±１０％の
恒温恒湿条件の待合室で３０分間安静にして皮膚表面の温度および湿度を測定空間の環境に適応できるようにした。

ハスカルス抽出物の凍結乾燥物０．５％含有クリームおよびプラセボクリームを用いて美白効果実験を行った。最初の訪問に際し、顔面左／右ランダムに実験クリームと対照クリームを割り当て、皮膚明度を測定した。その後、所定のクリーム剤形は、左／右区分して朝／夜に用いた。

各クリームの使用４週および８週経過後に、ＣＭ−２６００ｄ（Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｊａｐａｎ）を用いて皮膚明度（Ｌ−ｖａｌｕｅ）を定量的に測定した。皮膚のメラニン値は、ＭｅｘａｍｅｔｅｒおよびＮａｒｒｏｗ−ｂａｎｄ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いてプローブ（ｐｒｏｂｅ）から５６８ｎｍ（緑）、６６０ｎｍ（赤）、８８０ｎｍ（赤外線）の光を放出して、皮膚からの反射光を測定して評価した。

前記Ｌ−ｖａｌｕｅは明度パラメータ（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）であり、Ｌ−ｖａｌｕｅのＬは明度（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）を示す。Ｌ−ｖａｌｕｅは０から１００までの数で表示する。

機械的評価は、訪問時に実施し、試験部位を色彩輝度計（Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ）にて３回測定した後、平均値を求めて評価を行った。色彩輝度計（Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ）を用いて測定した皮膚明度の増加率は、下記の数学式２により点数化した。

Ｌ−ｖａｌｕｅの増加率（％）＝[（試料適用後のＬ−ｖａｌｕｅ）−（試料適用前のＬ−ｖａｌｕｅ）]／（試料適用前のＬ−ｖａｌｕｅ）×１００（式２）

その結果、図４に示すように、ハスカルス抽出物０．５％含有クリームを塗布してから８週間経過後の皮膚明度の測定値は、使用前の平均値５９．８から使用８週間経過後の６１．８に３．４％増加し、また、正規性検定によりパラメトリック法である対応サンプルｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｔ−ｔｅｓｔ）で検定したとき、使用８週間後の値のＰ−ｖａｌｕｅが０．０５未満であることから、前記測定値が統計的に有意なレベルまで増加したことが確認された。

また、図５に示すように、皮膚のメラニン値は、使用前の平均値１９７．７から使用８週間経過後１７４．９に１１．８％減少し、また、正規性検定によりパラメトリック法である対応サンプルｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｔ−ｔｅｓｔ）で検定したとき、使用８週間後の値のＰ−ｖａｌｕｅが０．０５未満であることから、前記測定値が統計的に有意なレベルまで減少したことが確認された。

剤形例：化粧料組成物の安定性を確認するための剤形の製造
没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を含有する化粧料組成物の安定性を確認するために、前記実施例２−２によるハスカルス抽出物の凍結乾燥物を含有する剤形（可溶化剤形、エッセンス剤形、クリーム剤形）を、下記の剤形例１）乃至剤型例３）に基づいて製造した。

剤形例１）可溶化剤型の製造

＜製造方法＞
（１）水相と可溶化相とをそれぞれ均一に混合および溶解させた。
（２）水相に可溶化相を入れて混合し、可溶化させた。
（３）添加Ｉは、実施例２−２の、２００μＭのメチルジャスモン酸で処理されたハスカルス抽出物の凍結乾燥物を含有した相であって、可溶化した後に投入して混合した後、添加ＩＩを混合して完了した。

剤形例２）エッセンス剤型の製造

＜製造方法＞
（１）水相と油相とを加温してそれぞれ均一に混合および溶解させた。
（２）７５℃で水相に油相を入れ、混合して乳化させた。
（３）添加Ｉは、実施例２−２の、２００μＭメチルジャスモン酸で処理されたハスカルス抽出物の凍結乾燥物を含有した相であって、５０℃で投入して混合させた後、添加ＩＩを混合した。

剤形例３）クリーム剤形の製造

＜製造方法＞
（１）水相と油相とを加温してそれぞれ均一に混合および溶解させた。
（２）７５℃で水相に油相を入れ、混合して乳化した。
（３）添加Ｉは、実施例２−２の、２００μＭのメチルジャスモン酸で処理されたハスカルス抽出物の凍結乾燥物を含有した相であって、５０℃で投入して混合させた後、添加ＩＩを混合した。

実験例５．没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を含有する化粧料組成物の安定性の確認
１）没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の原料の安定性の確認
原料の安定性を確認するために、前記剤形例１）乃至剤型例３）の可溶化剤形、エッセンス剤形、クリーム剤形を４℃、３０℃、４５℃、日光の条件下で１２週間保管した後、前記実験例１と同じ方法でＨＰＬＣ分析を行い、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の凍結乾燥物の没食子酸成分の経時変化を観察し、その結果を下記表７に示した。

その結果、前記表７に示すように、可溶化剤形、エッセンス剤形およびクリーム剤形のいずれも高温条件および日光条件下で、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の凍結乾燥物の有効成分である没食子酸の安定性が優れていることが確認された。

２）没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を含有する化粧料組成物の剤形の安定性の確認
剤形の安定性を確認するために、前記剤形例１）乃至剤型例３）の可溶化剤形、エッセンス剤形、クリーム剤形を４℃、３０℃、４５℃、日光の条件下で１２週間保管した後、目視及び官能評価により色、臭い、剤形の変化を観察し、その結果を下記表８乃至表１０に示した。このとき、色、臭い、剤形の変化の程度は下記の評価基準に基づいて分類して評価した。

＜評価基準＞
変化無し：○
やや変化有り：△
著しい変化有り：×

その結果、前記表８乃至表１０に示すように、可溶化剤形、エッセンス剤形およびクリーム剤形のいずれも高温条件および日光条件下で安定性が優れていることが確認された。

実験例６．没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を含有する化粧料組成物の皮膚刺激性の確認
没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を含有する化粧料組成物の皮膚刺激性を確認するために、前記剤形例３）のクリーム剤形の皮膚刺激性に対する評価を実施した。

具体的には、成人３０人を対象として、背中に、５×２０ｃｍサイズの、前記剤形例３で製造した没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の凍結乾燥物を濃度依存的に含有するクリーム剤形の所定量（２０μｌ）を、２４時間貼付した後、取り除き、１時間、２４時間経過した後に目視で皮膚状態の変化を判読し、その結果を表１１に示した。このとき、皮膚状態の変化の程度は、下記の皮膚状態の評価基準に基づいて分類して評価した。

＜皮膚状態の評価基準＞
０：変化無し
１：極めて僅かな変化有り
２：やや変化有り
３：やや激しい変化有り
４：激しい変化有り
５：極めて激しい変化有り

その結果、前記表１１に示すように、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物を含むクリーム剤形においても皮膚刺激がないことが確認された。

Claims (13)

1. メチルジャスモン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有する培地で培養して得られた没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）の含有量が増大したハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）カルス抽出物。
2. 前記メチルジャスモン酸の濃度は、１００乃至４００μＭであることを特徴とする請求項１に記載のハスカルス抽出物。
3. 前記没食子酸の含有量は、メチルジャスモン酸非含有の培地で培養したハスカルスのそれに比べて１０倍以上増大していることを特徴とする請求項１に記載のハスカルス抽出物。
4. 前記没食子酸の含有量は、抽出物の総重量に基づいて０．０１乃至１０．０重量％であることを特徴とする請求項１に記載のハスカルス抽出物。
5. 前記ハスカルスは、阿羅紅蓮の種子から誘導されることを特徴とする請求項１に記載のハスカルス抽出物。
6. メチルジャスモン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有する培地で培養して得られた没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）の含有量が増大したハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）カルス、その溶解物、その抽出物及びその培養物のうちいずれか１つ以上を含む美白用化粧料組成物。
7. 前記ハスカルス、その溶解物、その抽出物及びその培養物のうちいずれか１つ以上は、組成物の総重量に基づいて０．１乃至３０．０重量％で含まれることを特徴とする請求項６に記載の美白用化粧料組成物。
8. メチルジャスモン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有する培地でハスカルスを培養する段階を含むハスカルス又はその抽出物の没食子酸含有量の増大方法。
9. 下記の段階を含む、没食子酸含有量が増大したハスカルス抽出物の製造方法：
   （ａ）ハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ Ｎｕｃｉｆｅｒａ）種子を発芽させる段階；
   （ｂ）前記発芽されたハス組織からハスカルスを誘導する段階；
   （ｃ）前記ハスカルスをメチルジャスモン酸を含有する培地で培養する段階；および
   （ｄ）前記没食子酸含有量が増大したハスカルス培養物を抽出する段階。
10. 前記方法で処理されたメチルジャスモン酸の濃度は、１００乃至４００μＭであることを特徴とする請求項９に記載のハスカルス抽出物の製造方法。
11. 前記方法による抽出物の没食子酸含有量は、メチルジャスモン酸非含有の培地で培養したハスカルスのそれに比べて１０倍以上増大していることを特徴とする請求項９に記載のハスカルス抽出物の製造方法。
12. 前記ハスは、阿羅紅蓮であることを特徴とする請求項９に記載のハスカルス抽出物の製造方法。
13. 段階（ｃ）において、培養開始日から４乃至６週目にメチルジャスモン酸を培地に添加することを特徴とする請求項９に記載のハスカルス抽出物の製造方法。

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