KR102249418B1 - 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 캘러스 배양에 적합한 배양조건이 형성된 캘러스 유도용 배지에서 배양하여 캘러스 형성을 유도하고, 배양된 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면, 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 캘러스 배양에 적합한 배양조건이 형성된 캘러스 유도용 또는 증식용 배지에서 배양하여 대량 생산한 뒤 이를 이용하여 멜라닌 형성세포의 활성을 저해하는 효능을 갖는 캘러스 유효성분을 추출하여 피부 미백용 조성물을 확보함으로써 인체에 안전하고 미백효능을 갖는 화장품 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물{Skin Whitening Composition Containing Active Ingredient Extracted From Callus}

본 발명은 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 붉나무 잎에 공생하는 진딧물이 생장하면서 벌레집의 일종인 오배자를 형성하는 과정에서 상처부위에 형성되는 캘러스라는 물질로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 피부 속 기저층에 존재하는 멜라닌은 티로시나제(산화효소, tyrosinase)로 티로신(아미노산, tyrosine)을 수산화(hydroxylation)시킨 뒤 도파(L-3,-dihydroxy-L-phenylalani-ne, DOPA)를 만들고 이후에 티로신의 촉매에 의해 산화된다. 이후 도파퀴논(DOPA quinone)을 생성하고 일련의 반응을 통해 DOPA chrome, 5,6-dihydroxyindole, indole 5,6-quinone을 만든 후 최종적으로 멜라닌이 합성된다. 멜라닌을 합성하는 과정 중 티로시나제 효소는 멜라닌 합성의 속도조절단계인 티로신 기질을 도파(DOPA)로 전환하고 이후 도파퀴논(DOPA quinone)으로의 전환을 매개한다. 따라서 티로시나제 활성 억제제를 찾는 연구가 피부 미백제의 개발에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있다. 또한, 멜라닌은 멜라노사이트라는 색소세포에서도 합성되는 단백질 복합체로 피부와 머리카락의 색을 결정짓고 빛의 흡수와 산란을 통해 UV광선에 의한 세포손상과 독성 약물의 흡수 등 여러 중요한 작용을 수행한다. 그러나 자외선 노출에 의한 멜라닌의 과잉 생산은 피부 노화의 원인으로 기미, 주근깨 등을 형성하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 인해 세포의 사멸과 피부암을 유발하기도 한다. 이러한 이유로 멜라닌을 억제하기 위한 연구가 많이 진행되며, 현재까지 알려진 멜라닌 생성 저해제로는 하이드로퀴논 (hyeroquinone), 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 아젤라익산(azelaic acid), 아스코르빈산(ascorbic acid; vitamin C)등이 있다. 하지만 피부안정성과 제형 안정성의 문제로 제한된 양만 사용되고 있으며, 그 기전에 관해서 아직까지 완전히 규명되지 않았다.

오배자(Galla Rhois)는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 붉나무(Rhus chinensis)에서 진딧물(Melaphis chinensis)의 산란에 의해 생긴 벌레집의 일종이다. 이는 매미목의 진딧물과의 곤충인 오배자 면충(하얀 솜털이 붙어 있는 것처럼 보이는 해충)이며 야산에 기생하는 붉은 나무의 새잎에 기생함으로써 형성된 충영(식물체에 곤충이 산란 기생하여 그 결과로 생긴 이상 발육된 부분)으로 일본, 중국과 함께 우리나라 각지에 분포한다. 또한, 오배자는 문합, 백충창이라고도 말하며 생김 모양에 따라 화부자, 목부자, 이부자, 부자라고도 불린다. 오배자의 성분에는 탄닌(tannin)이 50∼70%로서, 주성분은 penta-m-digalloyl-β β-glucose 이고, 유리 갈산(gallic acid), 지방, 수지 및 전분도 포함되어 있다. 함유 유기물로는 말릭에시드(malic acid), 타르타르산(tartaric acid), 시트르산(citric acid) 및 플라보노이드 글루코시드(flavonoid glucoside) 등이 있다. 한편, 오배자의 약리 효과 연구에서는 항암 효과, 장내 세균 억제효과, 항당뇨 효과가 알려져 있고 이들 약효의 주성분은 갈산 메틸 에스테르(gallic methylester)임이 보고 되었다. 오배자의 약리작용과 관련된 주된 화합물로는 갈로타닌(gallotanin)류와 트리테르페노이드(triterpenoid) 화합물 등이 알려져 있다. 또한 오배자는 지혈작용이 있어 약재로 사용되며 건선이나 종기 및 피부염 등의 외상에 외용재로 사용되고 있다. 최근에는 항균효과에 집중 연구되고 있으며 항산화, 항혈전 및 항바이러스 등이 보고되고 있다. 이 같은 오배자의 항산화 및 항염에 대한 연구는 다수 보고되고 있으나, 추출된 분획물 수준에서 멜라닌생성 억제에 관한 연구는 거의 보고되지 않고 있다.

따라서 본 발명에서 제시하는 오배자 추출물의 항산화 활성과 미백 활성의 실험을 통한 결과들은 오배자로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

대한민국공개특허 제10-2019-0067287호(공개일 2019.06.017) 대한민국등록특허 제10-2012366호(등록일 2019.08.13)

본 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서,

본 발명의 목적은 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 캘러스 배양에 적합한 배양조건이 형성된 캘러스 유도용 또는 증식용 배지에서 배양하여 캘러스 형성을 유도하고, 배양된 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 제공되는 본 발명의 일실시 예에 따른 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물은 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 캘러스 배양에 적합한 배양조건이 형성된 캘러스 유도용 배지에서 배양하여 캘러스 형성을 유도하고, 배양된 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 캘러스 유도용 배지는 MS(Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)의 혼합물인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)이 각각 0.2-0.8 mg/L, 0.2-0.8 mg/L 및 0.05-0.15 mg/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)이 각각 0.5 mg/L, 0.5 mg/L 및 0.1 mg/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.

이에 더하여 상기 수크로스는 25-33 g/L, 상기 젤라이트(gelrite)는 1.8-2.8 g/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 상기 수크로스는 30 g/L, 상기 젤라이트 (gelrite)는 2.3 g/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 캘러스 유도용 배지는 캘러스 유도율을 향상시키기 위하여 시트르산(citric acid) 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 붉나무 캘러스는 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분획물을 얻는 메탄올 추출법을 적용시켜 캘러스 유효성분을 추출하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 메탄올 추출법으로 추출된 캘러스 추출물을 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드용액에 넣고 상기 캘러스 추출물의 특정성분이 비드와 결합하게 한 다음 자기장을 이용하여 비드를 분리시키는 ABT(Affinity Bead Technology) 기술을 적용시켜 캘러스 유효성분을 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 캘러스 배양에 적합한 배양조건이 형성된 캘러스 유도용 또는 증식용 배지에서 배양하여 대량 생산한 뒤 이를 이용하여 멜라닌 형성세포의 활성을 저해하는 효능을 갖는 캘러스 유효성분을 추출하여 피부 미백용 조성물을 확보함으로써 인체에 안전하고 미백효능을 갖는 화장품 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 붉나무에 형성된 오배자, 오배자 단면, 오배자의 캘러스 조직배양, 캘러스 유도 사진을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 붉나무에 형성된 오배자 캘러스 추출물에 대한 분획 방법 흐름도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 붉나무 캘러스의 유효성분을 ABT(Affinity Bead Technology)기술을 적용하여 추출하는 과정을 설명하기 위한 개념도를 나타낸다.
도 4는본 발명의 일실시예에 따른 붉나무 캘러스 추출물에 대한 티로시나제(tyrosinase)의 억제 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 붉나무 캘러스 추출물에서 B16/F10 흑색종 세포(melanoma cell)의 독성 효과의 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 붉나무 캘러스 추출물에서 쥐 흑색종 (mouse melanoma) 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 붉나무 캘러스 추출물이 피부에 미백 효능을 나타내는 사진이다(좌 A : 사용 전, 우 B : 사용 후).

이하의 본 발명에 대한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예에 대한 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당업자가 본 발명을 실시하기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한 각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.

따라서 후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

발명의 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다. 또한 명세서에 기재된 "…부", "…모듈" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어 또는 소프트웨어로 구현되거나 하드웨어와 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.

일반적으로 조직배양 하고자 하는 캘러스(Callus)는 대개 살아있는 식물의 기관에서 분리해 낸 상처받은 절편의 조직으로, 식물이 상처로부터 자신을 보호하기 위해 세포가 재생(再生, regeneration)하여 이상 분열 증식된 유세포 덩어리를 말한다. 이는 식물에 기생하거나 공생하는 진딧물 따위가 자상을 주면 식물 자신을 보호하기 위해 생기는 방어물질이다.

상처 부위로부터 형성된 캘러스가 이미 분화된 절편제로부터 분화되지 않은 세포로 복귀 하는 현상을 탈분화(脫分化, de-differentiation)라고 하는데, 이는 분리된 절편체의 성숙세포가 어린 상태로 되돌아가는 회춘(回春, rejuvenation) 현상이 일어난다. 회춘된 세포는 성숙세포보다 성장과 분열능력이 더 크므로, 캘러스의 대량생산이 가능함을 보여준다.

Callus 유도배지의 조성 예시

캘러스는 절편체가 탈분화된 후 세포가 배지에 첨가되어 있는 물질의 영향을 받아 활발히 분열되어 형성되어진다. 캘러스의 형성은 외식편(explant)의 채취부위나 시기, 생리적인 상태에 따라 영향을 받는데, 내생생장 촉진물질(內生生長 促進物質) 또는 내생생장 억진물질(內生生長 抑進物質)의 함량이 식물조직의 부위 또는 계절적으로 차이가 있기 때문에 나타나는 현상이다.

절편체로부터 캘러스를 형성시키기 위해서는 생장조절제뿐만 아니라 배지의 성분, 광, 온도, 식물체의 인자형에 따라 차이가 있으나 일반적으로 생장조절제의 영향이 캘러스의 유도에 가장 큰 영향을 미친다. 생장조절제는 3가지의 경우로 구분된다.

1) 옥신(Auxin) 하나만 필요한 경우(주로 단자엽식물)

2) 시토키닌(Cytokinin) 하나만 요구하는 경우

3) 옥신(Auxin)과 시토키닌(Cytokinin) 2가지를 요구하는 경우

배지의 성분으로는 MS배지의 무기성분 또는 MS배지의 변형배지를 이용하고 탄소원으로는 설탕 또는 포도당(2~4%)을 이용한다. 광(光)은 식물의 종류에 따라 광선을 요구하거나 암흑을 필요로 하는 경우가 있다. 온도는 일반적으로 22~28℃ 이지만, 비교적 고온일 때 캘러스의 형성이 잘 이뤄진다.

캘러스의 증식은 보통 계대배양을 하여 증식시킨다. 계대배양의 배지는 캘러스를 유도할 때 배지와 유사한데, 고체배지 또는 액체배지를 이용한다.

캘러스를 장기간 계대배양을 지속하면 전형성능(全形成能, totipotency)을 지닌 세포가 기능을 발휘하지 않아 분화력(分化力)이 상실된다. 이러한 기능에는 배지조성이나 배양환경 등 여러 요인이 있지만 주된 원인은 유전정보를 상실함으로써 나타난다. 또한 캘러스 계대배양이 반복되면 습관성(habituation)이 작용하여 옥신(auxin)과 시토키닌(cytokinin)의 요구성을 잃게 되고, 생장조절제에 독립영양성이 된다.

캘러스(callus)는 계대배양이 계속되면 재생능력이 감소하거나 완전히 소실될 수 있으므로 이를 방지하기 위해 조절제를 필요로 한다. 캘러스 조직에서 조절제로 쓰이는 옥신(auxin)의 농도가 시토키닌(cytokinin)의 농도보다 높으면 배양하고자 하는 캘러스와 거리가 먼 부정근(不定根, adventitious root ; 뿌리 이외에 다른 조직에서 2차적으로 발생하는 뿌리)이 형성될 확률이 높고, 이와 반대로 시토키닌의 농도가 옥신의 농도보다 높으면 부정아(不定芽, adventitious bud ; 잎, 뿌리의 일부 등 원래 눈이 생기지 않는 기관이나 조직에 발생하는 눈)가 형성될 확률이 높다. 그러나 캘러스 조직에서 부정근, 부정아의 유도는 간단하지 않지만, 배지의 염(salt)농도가 높거나 암모늄(ammonium) 농도가 높거나 낮을 때 잘 형성되는 경우도 있다. 반대로 과량의 옥신이 첨가될 경우 잎이 뒤틀리거나, 종양을 형성하므로 적당량 사용을 권장한다.

도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 일실시 예에 따른 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물은 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 캘러스 배양에 적합한 배양조건이 형성된 캘러스 유도용 배지에서 배양하여 캘러스 형성을 유도하고, 배양된 붉나무 캘러스로부터 유효성분을 추출한 것이다.

또한, 탄닌(tannin) 함량이 높은 붉나무의 캘러스 대량 조직배양에 적합한 배양조건을 찾고자 하였다. 그 결과, 식물생장조절제의 종류와 농도, 배지의 종류, 배지 첨가물에 따라 캘러스 유도 및 증식 정도에 차이가 있음을 증명하는 실험이 있음을 확인하였고, 이 결과를 토대로 붉나무의 캘러스 증식에 적합한 배양조건을 찾게 되었다. 본 발명에서는 각 배양 조건에서의 캘러스의 생존율과 유도, 증식률, 탄닌 축적률을 측정하여 최적의 캘러스 배양 및 증식 조건을 확인하였다.

먼저, 캘러스 유도용 배지는 MS(Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 수크로스, 젤라이트(gelrite) 및 식물생장조절제를 포함한다.

그리고, 캘러스 유도용 배치에 포함되는 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)의 혼합물로 이루어진다.

여기서, 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)이 각각 0.2-0.8 mg/L, 0.2-0.8 mg/L 및 0.05-0.15 mg/L 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)이 각각 0.5 mg/L, 0.5 mg/L 및 0.1 mg/L 농도로 포함될 수 있다.

그리고, 수크로스는 25-33 g/L, 젤라이트(gelrite)는 1.8-2.8 g/L 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 수크로스는 30 g/L, 젤라이트 (gelrite)는 2.3 g/L 농도로 포함될 수 있다.

또한, 캘러스 유도용 배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962)에 수크로스, 젤라이트 및 식물생장조절제를 첨가하고 HP를 5.8로 조절한 후, 고온 고압(예컨대, 110-130℃, 20-30분간)으로 멸균하여 사용할 수도 있다.

또한, 캘러스 유도용 배지는 캘러스 유도율을 향상시키기 위하여 시트르산(citric acid) 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 더 포함할 수도 있다.

또한, 캘러스 유도용(증식용) 배지의 성분은 상기에 개시된 성분 외에도 식물의 생장에 직·간접적으로 영향을 주는 물질들을 포함할 수 있음은 당업자에게 자명하다. 예컨대, 고농도 세포 배양 및 이차 대사산물의 최종 용적생산성을 증가시키기 위해서 배지 내 고농도 탄소원(자당, 유당, 과당, 포도당 등)을 첨가할 수 있다.

이처럼 배양된 붉나무 캘러스는 도 2에 도시된 바와 같이 메탄올 추출법을 적용시켜 캘러스 유효성분을 추출할 수 있다. 즉, 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분획물을 얻는 것으로 캘러스 유효성분을 추출한다.

또한, 도 3에 도시된 바와 같이 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드용액에 붉나무 캘러스 추출물을 넣고, 붉나무 캘러스 추출물의 특정성분이 비드와 결합하게 한 다음 자기장을 이용하여 비드를 분리시키는 ABT(Affinity Bead Technology) 기술을 적용시켜 캘러스 유효성분을 추출한다.

< 실험예 1 > 붉나무 캘러스 유도 및 조직 배양

본 연구의 실험재료로는 수령이 11∼15년 경과된 붉나무의 엽축날개에 형성된 오배자 조직절편을 사용하였다. 간모(fundatrix)를 완전히 제거한 오배자의 조직절편을 70% 에탄올에 30초간 침지한 후 2%(w/v) NaOCl에 15분간 조직절편의 표면을 살균하였으며, 표면 살균된 절편은 멸균수로 3회 세척하였다.

표면이 살균된 오배자의 조직절편은 30g/L의 설탕(sucrose)이 첨가된 MS 배지에 치상하여 발아시켰다. 또한, 온실에서 재배 중인 붉나무의 유식물체를 채취하여 초대배양을 하였다. 온실에서 채취한 유식물체는 종자 소독 과정과 동일한 방법으로 살균하여 0.1mg/L의 6-벤질아데닌(6-benzyladenine, BA)과 30g/L의 설탕이 첨가된 MS 배지에 치상하였다.

캘러스의 유도

수령이 11∼15년 경과된 붉나무의 엽축날개에 형성된 오배자 조직절편을 5x5 mm 크기로 잘라 배지에 치상하여 캘러스를 유도하였다. 캘러스 유도배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962)에 수크로스 30 g/L, 젤라이트(gelrite) 2.3 g/L 및 식물생장조절제를 첨가하고 HP를 5.8로 조절한 후, 121℃에서 25분간 고압으로 멸균하여 페트리디쉬에 분주하여 사용하였다. 식물생장조절제는 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D) 단용과 2,4-D, 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 혼용, 2,4-D, NAA 및 티디아주론(thidiazuron, TDZ) 혼용으로 사용하였다. 붉나무의 잎 절편체는 페트리디쉬 당 5개씩 치상하여 4회 반복하였으며, 4주 후 생존율, 캘러스 유도율, 갈변율을 조사하였다.

그 결과, [표 1]에 나타낸 바와 같이 절편체의 생존율과 캘러스 유도율 모두 2,4-D, NAA, BA 혼용처리에서 각각 100.00%, 96.91%으로 가장 높았다. 또한, 2,4-D, NAA, BA 혼용처리에서 유도된 캘러스의 부피가 가장 컸다. 반면에, 2,4-D 단용 처리와 2,4-D, BA 혼용 처리의 경우, 2,4-D, NAA, BA 혼용처리에 비하여 캘러스 유도율이 낮아 캘러스 유도에 효과적이지 않았다.

캘러스 유도에 대한 식물생장조절제(PGRs)의 영향

PGRs (mg/L)			생존율(%)	캘러스유도율(%)
2,4-D	NAA	BA
1	0	0	89.31 ± 2.51	51.53 ± 9.72
0.5	0.5	0	65.26 ± 4.53	27.39 ± 5.21
0.5	0.5	0.1	100.00 ± 0.00	96.91 ± 3.17

식물생장조절제가 캘러스 증식에 미치는 영향

붉나무 캘러스 증식에 적합한 식물생장조절제의 종류와 농도를 구명하기 위하여 다양한 종류의 식물생장조절제를 농도별로 처리하였다.

[표 2]에 나타낸 바와 같이 붉나무 잎에 형성된 오배자의 캘러스 증식에 적합한 식물생장조절제의 종류 및 농도를 선정하기 위하여 MS 배지에 30g/L의 설탕과 2.3g/L의 젤라이트를 첨가하고 2,4-D, NAA, 6-벤질아데닌(BA), 키네틴(kinetin)을 단용 또는 혼용하여 배지에 첨가하였다. 캘러스는 페트리디시(Petri dish) 당 9개씩 치상하여 4회 반복하였으며, 암조건 배양실에서 3주간 배양하였다. 3주 후, friable 캘러스 유도율, 캘러스의 지름, 갈변율을 조사하였다.

캘러스 증식을 위한 식물생장조절제(PGRs) 처리

NO	PGRs (mg/L)
	2,4-D	NAA	BA	키네틴
1	0	0	0	0
2	1.0	0	0	0
3	2.0	0	0	0
4	1.0	0	0.1	0
5	1.0	0	0	0.1
6	0	1.0	0	0
7	0	2.0	0	0
8	0	2.0	0.1	0
9	0	2.0	0	0.1
10	0.5	0.5	0.1	0
11	0.5	0.5	0	0.1

그 결과, [표 3]에 나타낸 바와 같이 2,4-D 1 mg/L 처리군에서 분화력이 우수한 friable 캘러스 유도율이 52.73%으로 가장 높았으며, 캘러스의 지름이 2.18 cm로 부피가 가장 많이 증가하였다. 또한, 갈변율이 7.21%로 처리군 중에서 가장 낮아 캘러스 증식에 가장 적합한 처리로 선정되었다. 반면에 가장 처리군은 캘러스 색은 하얀색이었지만 캘러스가 딱딱하여 적합하지 않았다. 옥신류의 2,4-D와 NAA, 사이토키닌류의 BA 또는 Kinetin이 혼용된 처리군은 갈변율이 높아 캘러스 증식에 적합하지 않았다.

캘러스 증식에 대한 식물생장조절제의 영향

식물생장조절제 (mg/L)				Friable 캘러스 유도율 (%)	캘러스 지름 (cm)	갈변율 (%)
2,4-D	NAA	BA	키네틴
0	0	0	0	0.00 ± 0.00	0.52 ± 0.17	31.25 ± 17.09
1.0	0	0	0	52.73 ± 5.46	2.18 ± 0.23	7.21 ± 2.28
2.0	0	0	0	2.92 ± 2.17	0.97 ± 0.02	15.76 ± 3.12
1.0	0	0.1	0	26.03 ± 12.19	0.53 ± 0.03	8.93 ± 1.65
1.0	0	0	0.1	3.41 ± 3.63	0.92 ± 0.03	12.25 ± 5.17
0	1.0	0	0	0.25 ± 1.39	0.92 ± 0.03	9.28 ± 3.29
0	2.0	0	0	0.34 ± 1.37	0.97 ± 0.03	13.22 ± 4.32
0	2.0	0.1	0	28.54 ± 11.63	0.82 ± 0.03	15.72 ± 5.20
0	2.0	0	0.1	15.23 ± 3.18	0.71 ± 0.05	9.57 ± 10.29
0	0.5	0.1	0	13.56 ± 5.78	0.72 ± 0.03	12.89 ± 9.28
0	0.5	0	0.1	6.74 ± 3.53	0.72 ± 0.03	28.17 ± 7.16

배지 종류가 캘러스의 증식에 미치는 영향

붉나무 잎에 형성된 오배자의 캘러스 증식에 적합한 배지 종류를 선정하기 위하여 배지 종류를 MS (Murashige and Skoog), WPM, B5, SH로 달리 처리하였다. 모든 배지에는 1 mg/L의 2,4-D, 30 g/L의 수크로스, 2.3 g/L 의 젤라이트가 첨가되었으며, 캘러스는 페트리디쉬 당 5개씩 치상하여 5회 반복하였다. 3주 후, friable 캘러스 유도율, 캘러스의 지름, 갈변율을 조사하였다.

그 결과, [표 4]에 나타낸 바와 같이 기존에 사용하던 MS배지에서 friable 캘러스가 발생하였으며, 갈변율 형성율이 11%로 다른 처리군에 비하여 낮아 캘러스 증식에 적합하였다. 반면에 WPM 배지는 캘러스 지름이 0.32 cm로 가장 낮았다. 또한, B5 배지는 갈변율이 61%로 처리군 중에서 가장 높아 캘러스 배양에 적합하지 않았다.

캘러스 증식에 대한 배지(medium)의 영향

처리	Friable 캘러스 유도율(%)	캘러스 지름(cm)	갈변율(%)
MS	7.89 ± 3.37	2.21 ± 0.03	11.00 ± 3.23
WPM	7.12 ± 2.10	0.32 ± 0.02	33.20 ± 6.75
B5	7.53 ± 2.18	1.16 ± 0.04	61.16 ±12.31
SH	0	1.15 ± 0.03	31.07 ± 3.72

배지 내 첨가물이 캘러스의 증식에 미치는 영향

캘러스의 증식률을 향상시키기 위하여 배지 내에 시트르산(citric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 카제인 가수분해물(casein hydrosylate), 이노시톨(inositol)을 각각 1 g/L를 처리하였다. 배지는 1 mg/L의 2,4-D, 30 g/L의 수크로스, 2.3 g/L 의 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 이용하였다. 캘러스는 페트리디쉬 당 5개씩 치상하여 5회 반복하였으며, 암배양 조건으로 3주간 배양하였다. 3주 후, friable 캘러스 유도율, 캘러스의 지름, 갈변율을 조사하였다.

그 결과, [표 5]에 나타낸 바와 같이 시트르산 처리군에서 friable 캘러스 유도율, 캘러스 지름이 각각 37%, 2.57 cm로 가장 높았다. 또한, 갈변율이 5%로 가장 낮아 캘러스의 증식에 적합하였다. 아스코르브산 처리군는 시트르산 처리군 다음으로 friable 캘러스 유도율이 높고, 갈변율이 낮게 나타났다. 이노시톨과 카제인 가수분해물 처리군은 갈변율이 각각 32%, 38%로 높아서 캘러스 증식에 적합하지 않았다.

캘러스 증식에 대한 첨가제(addictives)의 영향

처리	Friable 캘러스 유도율(%)	캘러스 지름(cm)	갈변율(%)
시트르산	37.98 ± 12.56	2.57 ± 0.03	5.12 ± 2.31
이노시톨	7.57 ± 2.28	1.18 ± 0.02	32.26 ± 3.31
아스코르브산	14.69 ± 5.27	1.06± 0.02	19.23 ± 4.29
카제인 가수분해물	3.39 ± 2.75	0.85 ± 0.02	38.16 ± 15.32

< 실험예 2 > 붉나무 캘러스 유효성분 추출

붉나무 캘러스 추출

상기 실험예 1에서 유도 및 증식 시킨 붉나무 캘러스 500g를 분쇄한 후 정제수에 70%(v/v) 메탄올 수용액 1리터를 첨가하고 상온에서 24시간 동안 3회 추출한 후 액을 농축하였다. 증류수에 추출물을 현탁한 다음 핵산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(n-butanol)을 사용하여 순차적으로 분획과 추출하여 각 용매별 추출물을 얻었고 그중에 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 추출한 층을 동결 건조하여 사용하였다.

퀘르시트린 함량 및 탄닌 함량 비교

상기 실험에서 추출한 붉나무 캘러스 추출물의 퀘르시트린(quercitrin) 함량 및 탄닌(tannin) 함량을 비교하기 위해 Folin-Denis 법을 이용해 함량을 측정하였다.

먼저. 퀘르시트린 함량은 시료를 10mg/㎖ 농도로 증류수에 녹인 다음 0.2㎖을 시험관에 취하여 증류수를 첨가하여 2㎖로 만든 후, Foiln-ciocalteu's phenol reagent 0.2㎖를 첨가, 혼합하여 3분간 실온에서 반응시켰다. 여기에 Na2CO3 포화용액 0.4㎖를 가하여 혼합하고 증류수를 1.4㎖ 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, UV/VIS 분광광도계(ShimadzuU-1201,Japan)를 사용하여 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 퀘르시트린 화합물은 탄닌산(Sigma Co, USA)을 10mg/ml 농도로 증류수에 녹이고 최종 농도가 0, 37.5, 75, 150, 300㎍/㎖ 용액이 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 검량선을 작성하고, 이를 이용하여 지각 추출물의 퀘르시트린 화합물 함량을 산출하였다. 탄닌 함량은 시료 1g에 40ml 정도의 정제수를 넣고 가열 방냉시킨 후 여기에 정제수를 가해 50ml로 mass up시켜 이를 여과하고 그 침출여액을 시험용액으로 한다. 시험용액 중 1ml를 취하여 100ml volumetric flast에 넣고 여기에 정제수 75ml, Folin-Denis 시약(정제수 750ml에 Na2Wo4, H3BO4 50ml를 가해 섞은 후 1L로 mass up 50ml, 탄산나트륨 포화용액 10ml를 차례로 넣는다. 증류수 mass up하고 교반 후 30분간 정지시킨 뒤 760nm에서 비색 정량하였다. 총 탄닌 정량은 퀘르시트린과 동일하게 검량선을 작성하여 지각 추출물의 탄닌 화합물 합량을 산출하여 [표 6]에 나타내었다.

붉나무 캘러스 추출물 1%, 3%, 5%에 함유된 총 퀘르시트린 및 탄닌 함량

시료명	총 퀘르시트린 함량(mg/g)	총 탄닌 함량(mg/g)
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 1%	32.31 ± 0.39	62.84 ± 0.37
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 3%	59.39 ± 0.52	91.97 ± 0.42
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 5%	95.87 ± 0.31	129.78 ± 0.37

< 실험예 3 > 붉나무 캘러스의 멜라닌 형성 저해 및 피부 안정성 실험

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 측정(Assay)

붉나무 캘러스 추출물이 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장품 조성물로 쓰일 수 있는지를 확인하기 위하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 측정(Assay)을 통한 항산화 작용의 평가를 진행하였다. 본 발명에서 항산화작용의 지표로 사용되는 전자공여능은 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 확인하였다.

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 멜라닌 생성에서 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)의 산화가 티로시나제(Tyrosinase)의 초기 반응 속도에 영향을 준다. 그러므로 전자공여능(electron donating ability, EDA)이 있을 경우 멜라닌의 생성에 효과가 있을 것으로 예상하여 DPPH의 환원력을 이용하여 측정하였다. 실험 방법은 Blios의 실험방법을 변형하여 사용하였다. 시료 10μL에 메탄올 100μL와 0.25 mM DPPH (in MeOH) 90μL을 혼합하여 암실에서 30 min 간 반응한 다음 분광광도계를 사용하여 517 nm에서 측정하였다. 양성대조군으로 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였고 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 백분율로 나타내었다.

저해율(%) = (A-B)/A×100

A : 시료를 첨가하지 않았을 때의 흡광도

B : 시료를 첨가하였을 때의 흡광도

DPPH 측정 결과 추출물은 농도 의존적으로 소거능이 증가하였으며, 500μg/ml에서는 68.2%의 소거능을 보였다.

티로시나제 억제 효과 측정(Tyrosinase Inhibition Assay) 실험

실험예 2에서 수득한 붉나무 캘러스 추출물에 대하여 티로시나아제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 확인하고 미백 효과를 입증한 실험이다.

티로시나아제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 돕는 산화 효소이다. 본 실험예는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H.: J. Biochem., 24: 161 - 168, 1996)을 응용하여 미백효과를 입증하였다.

각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 50mM 인산 완충액(pH 6.5) 150㎕, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500units/㎖, Sigma사) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응 시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 아래의 공식에 따라 계산하였으며, IC50값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(D-C)-(B-A)/(D-C)]X100

A : 시료를 넣은 Well의 반응 전 흡광도

B : 시료를 넣은 Well의 반응 후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 Well의 반응 전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 Well의 반응 후 흡광도

그 결과 [표 7]에 나타낸 바와 같이 붉나무 캘러스 추출물의 IC50값이 낮을수록 멜라닌 억제 효과가 높은 것이므로, 붉나무 캘러스 추출물 함량이 가장 높을 때(5%)의 IC50값이 0.0327%로 나타났다. 기존에 알려진 미백제인 알부틴보다 우수한 티로시나아제 활성 억제 효과를 나타내었다.

붉나무 캘러스 추출물 함량 별 티로시나아제 저해 효과.

시료	티로시나아제 저해 효과(IC50)
2의 붉나무 캘러스 추출물 1%	0.0931%
2의 붉나무 캘러스 추출물 3%	0.0525%
2의 붉나무 캘러스 추출물 5%	0.0327%
알부틴	0.0513%

B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 합성 억제 실험

본 실험은 실험예 2에서 수득한 추출물에 대하여 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 평가한 것이다.

본 실험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시 예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6-웰 플레이트에 각 well 당

cells/㎖ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethanesulphonylflu-oride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH{10% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 포함}를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%) =

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

실험예 2에서 수득한 붉나무 캘러스 추출물을 농도별로 도포하여 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 합성 저해효과를 확인한 결과, 도 4 및 [표 8]에 나타낸바와 같이 기존의 미백제인 알부틴과 비교하여 유사한 효과를 나타내었다.

붉나무 캘러스 추출물 농도 별 멜라닌 생성 저해율.

시료명	멜라닌 합성 저해효과(%)
2의 붉나무 캘러스 추출물 1%	10%
2의 붉나무 캘러스 추출물 3%	19%
2의 붉나무 캘러스 추출물 5%	33%
알부틴 0.1%	32%

세포독성 측정

세포배양

흑색종 세포 (B16/F10 melanoma cell)에 배양에 사용하였던 배지는 10% 우태혈청 (Fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin)을 배지인 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에 가하여 사용하였다. 세포는 37 ℃와 5% CO₂₂상태에서 배양하였고, 흑색종 세포(B16/F10 melanomacell) 에 각 조건 별로 실험 도구인 96 well plate에는 5×10⁴cell/well, 배양 도구인 100 mm cell culture dish는 1×10 cell/mL와 60 mm cell culture dish는 1×10 cell/mL로 배양하였다.

세포독성 측정 (세포 생존율 측정기법, MTT assay)

붉나무 캘러스 추출물이 세포에 노출되었을 때 세포에 미치는 독성을 확인하기 위하여 세포 생존율 측정기법인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli-um bromide) assay를 진행하여 피부세포에 대한 세포독성을 평가하였다.

96-웰 시험 플레이트에 세포배양 배지(DMEM에10% FBS가 첨가된 것)에 희석된 섬유아세포(fibroblast)를

cells/㎖씩 넣고 24시간 동안 부착하였다. 각 웰에 실험예에서 수득한 붉나무 캘러스 추출물을 적절한 농도로 희석하여 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5㎎/㎖)이 함유된 세포배양 배지 200㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였다. 세포생존율(%)을 이용해 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 추출물의 농도를 정하였다.

세포생존율(%) = [(St-Bo)/(Bt-Bo)]X100

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 well의 565 ㎚ 흡광값

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 well의 565 ㎚ 흡광값

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 well의 565 ㎚ 흡광값

세포 독성 측정 결과, 도 5 및 [표 9]에 나타낸 바와 같이 피부 섬유아세포의 100% 생존 처리농도는 2의 붉나무 캘러스 추출물(5%)이 0.002% 이하로, 약간의 세포 독성을 확인할 수 있었다. 하지만 이는 일반적으로 화장품에 사용되는 농도를 고려하였을 때 피부 자극 유발 가능성이 작은 안전한 시료인 것을 말해준다.

붉나무 캘러스 추출물 함량 별 세포 생존 농도 측정 값

시료명	100% 세포 생존 농도
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 1%	0.0006%
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 3%	0.001%
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 5%	0.002%

멜라닌 억제량 측정(Melanin Contents Assay) 실험

붉나무 캘러스 추출물을 실제 멜라닌 억제량을 측정하기 위하여 멜라닌 세포에 캘러스 추출물을 처리 후 멜라닌이 생성된 양을 확인하였다. 흑색종 세포(B16/F10 melanoma cell)을 100mm cell culture dish (배양 접시)에 1×10 cell/mL의 농도로 24h 동안 배양한 후 멜라닌세포자극호르몬(α-Melanicyte stimulating hormone, α-MSH)을 10 nM 되도록 처리하였고, 4h 뒤에 붉나무 캘러스 추출물을 처리하였다. 24h 뒤에 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)로 2회 세척 후 쎌 스크리퍼(cell screaper)로 cell을 모았다. 세포벽을 녹여서 DNA가 잘 빠져나오도록 하는 역할을 하는 Lysis buffer (0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.8, 1%(v/v) triton X-100)를 1 mL 첨가한 다음 4℃ 30 min 간 반응 하였다. 반응한 용액을 13,000rpm 10min 간 원심분리 하였고, 상등액은 BCA(Bicinchoninic acid) 단백질 정량법으로 정량을 하였다. 침전물은 1 N 가성소다(NaOH)용액 1 mL 첨가한 다음, 90℃에서 1 h 반응한 뒤 단백질 양에 맞춰 희석하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 즉, 붉나무 캘러스 추출물의 미백 효과를 확인하기 위해 쥐 흑색종(mouse melanoma) 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과를 측정하였으며, 세포에 멜라닌세포자극호르몬(αα-MSH)을 처리하여 멜라닌의 발현을 유도하였고, 그 후 붉나무 캘러스 추출물을 농도별로 처리하고 멜라닌의 생합성 된 양을 측정하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 멜라닌세포자극호르몬(αα-MSH)을 단독으로 처리한 세포에서 멜라닌 발생양은 122.07%로 비 처리구에 비해 양이 증가하였고, 대조군으로 알부틴(arbutin) 500μM 처리한 곳은 96.5%까지 감소하였다. 그리고 오배자 추출물을 처리한 구간은 100μg / mL 처리 구에서는 77.2% 억제효과를 보였다.

미백효능 임상 평가

실험예 2에서 수득한 붉나무 캘러스 추출물을 함유한 크림 제형의 화장료를 사용하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 control 크림과 비교실험을 행하여 평가하였다. 실험자(20세∼35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 붉나무 캘러스 유효성분이 포함된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 붉나무 캘러스가 미첨가 된 control 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안 관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 [표 10]에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

미백 효능 육안 평가 기준 : -3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선

붉나무 캘러스 추출물 함유 크림과 미함유(control) 크림 피부색 밝기 변화.

	피부색의 밝기 변화(L)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	캘러스 함유	control	캘러스 함유	control	캘러스 함유	control
평균값	10.79	4.35	6.27	3.19	4.38	1.87

[표 10]에 나타난 바와 같이 붉나무 캘러스 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다(control(A) : 붉나무 캘러스 미함유 크림)

< 실험예 4 > ABT(Affinity Bead Technology) 적용 시 붉나무 캘러스의 유효성분 추출 효율

본 실험예는 항원항체 반응을 응용하여 마그네틱 자성 띠는 ABT를 활용 시 붉나무의 유효 성분을 효율적으로 추출할 수 있음을 증명하는 실험을 나타낸다.

ABT(Affinity Bead Technology)를 적용한 붉나무 캘러스의 유효성분 추출과정을 도 3을 참고로 하여 설명하면 다음과 같다.

먼저, 도 3의 A와 같이 붉나무 캘러스 추출물은 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드 용액에 넣고 캘러스 추출물의 특정 성분이 비드와 결합되게 한다. 여기서, 특정 성분은 피부에 유해한 성분을 포함한다. 이어, B와 같이 시험관에 자기장을 걸어 비드를 한곳에 모으고 상층액을 빼낸다. 이어, C와 같이 세정 버퍼액을 적가하고 세척한다. 이어, D와 같이 성분 물질이 분리되면 상등액을 빼낸다.

여기서, 비드의 특징을 간략히 설명하면, 비드는 원심분리, heat, 컬럼 필요없이 분리가 빠르고 수율이 높다. 보통 핵산(DNA/RNA), 단백질, 항체 등을 포획/정제하는데 사용된다. 비드사이즈는 수십㎚∼수㎛까지 추출물, 용도에 따라 다양하게 사용된다. 비드표면 리간드의 화학적 반응을 이용하여 친화력이 높다.

메탄올을 추출법을 이용했을 때 퀘르시트린과 탄닌함량과 ABT를 추가 적용했을 때의 함량을 비교 분석하였으며. 그 결과를 [표 11]에 나타내었다.

붉나무 캘러스 유효성분 추출 효율 비교 결과

	유효성분 추출 기술
	메탄올 추출		메탄올 추출 + ABT
시료명	총 퀘르시트린 함량(mg/g)	총 탄닌 함량(mg/g)	총 퀘르시트린 함량(mg/g)	총 탄닌 함량(mg/g)
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 1%	42.28 ± 0.15	67.57 ± 0.42	63.12 ± 0.27	70.25 ± 0.53
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 3%	63.37 ± 0.39	97.27 ± 0.66	87.43 ± 0.37	102.54 ± 0.21
실험예 2의 붉나무 캘러스 추출물 5%	97.46 ± 0.48	129.28 ± 0.29	108.21 ± 0.49	117.73 ± 0.42

이와 같이 본 발명은 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 캘러스 배양에 적합한 배양조건이 형성된 캘러스 유도용 또는 증식용 배지에서 배양하여 대량 생산한 뒤 이를 이용하여 멜라닌 형성세포의 활성을 저해하는 효능을 갖는 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 확보함으로써 인체에 안전하고 미백효능을 갖는 화장품 소재로 활용할 수 있게 된다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정은 균등물들로 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주 되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. MS(Murashige and Skoog)를 기본배지로 하고, 2,4-디클로로-페녹시아세트산(2,4-D), 알파-나프탈렌아세트산(NAA) 및 6-벤질아데닌(BA)이 각각 0.5 mg/L, 0.5 mg/L 및 0.1 mg/L 농도를 포함하는 식물생장조절제, 30 g/L 농도의 수크로스, 2.3 g/L 농도의 젤라이트(gelrite)를 포함하는 캘러스 유도용 배지에 붉나무 잎에 형성된 오배자의 조직절편을 배양하여 붉나무 캘러스 형성을 유도하고,
   상기 배양된 붉나무 캘러스는 메탄올로 1차 추출한 1차 추출물을 에틸아세테이트로 2차 추출한 용매 가용부로부터 멜라닌 합성 저해 분획물을 얻는 메탄올 추출법을 적용시켜 캘러스 추출물을 추출하며,
   상기 캘러스의 추출물을 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드용액에 넣고 상기 캘러스 추출물에 포함된 페놀류의 고분자물질이 비드와 결합하게 한 다음 자기장을 이용하여 비드를 분리시키는 ABT(Affinity Bead Technology) 기술을 적용시켜 캘러스 유효성분을 추출하고, 상기 추출된 붉나무 캘러스 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 캘러스 유도용 배지는 캘러스 유도율을 향상시키기 위하여 시트르산(citric acid) 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 붉나무 캘러스로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

Images