KR101959811B1 - 지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지충이와 다실불레기말을 혼합추출한 후, 발효하여 발효추출물을 제조하고, 이를 다시 반방짜유기에서 숙성함으로써 주름개선, 보습 및 미백활성이 우수한 지충이와 다실불레기말의 혼합발효추출물을 제조하는 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물{Method for preparing fermented extract of Sargassum thunbergii and Colpomenia expansa and cosmetic composition containing the same}
본 발명은 지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 주름개선 및 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 지충이와다실불레기말을 1차 발효한 후, 발효물을 반방짜유기 소재의 그릇에서 숙성함으로써 주름개선, 보습 및 피부미백활성을 증대시킨 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.
최근 현대인들의 경제수준이 향상되고 수명의 연장과 사회생활의 참여도가 높아지면서 다양한 연령층에서 피부 미용에 대한 관심이 높은 수준으로 증가하고 있다. 피부노화 과정을 지연시키고 미백을 통해 깨끗하고 건강한 피부를 유지하고자 하는 목적에 따라 많은 미용 관련 화장품 및 식품이 개발되고 있고, 특히 피부 주름형성 완화와 미백을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 피부는 인체의 일차방어막으로서 체내의 기관을 온도 및 습도변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해주며, 체온조절 등의 생체항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 피부를 구성하는 세포외부로부터 가해진 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍, 자외선, 환경오염물질, 급격한 기온의 변화 등과 같은 세포를 손상시키는 세포손상자극들에 의하여 세포내의 다양한 생화학적 변화가 유도되면 피부외관에 기미, 주근깨, 잡티, 탄력손실, 각질화, 주름생성과 같은 피부의 노화 및 멜라닌의 과도한 생성을 촉진시키게 된다.
각질형성세포에 존재하는 결합체는 표피에서 가시층 각질형성 세포간 결합과 세포내 케라틴으로 구성된 장력섬유를 구성하는 중간세섬유 세포골격(intermediate filament cytoskeleton)에 고정되어, 세포로 하여금 외부적인 기계적 자극으로부터 손상되지 않도록 보호하는 역할을 한다. 이 결합체는 구조가 견고하여 발달 과정 중 표피세포의 중층화나 소기관의 구조 유지에 중요한 역할을 하게 된다. 결합체는 전자현미경 소견상 세포질내 판(plaque)과 세포막 사이의 코어(core)로 구성된 특징적인 형태를 보인다. 생화학적으로 분석해보면 판은 4가지 단백으로, 코어는 4가지당단백으로 구성되어 있으며, 중요구성 성분을 보면 판에는 플라코글로빈(plakoglobin)과 데스모플라킨(desmoplakin)등이 있고, 코어에는 데스모글레인(desmoglein)과 데스모콜린(desmocollin) 등이 있다. 데스모콜린은 아형으로 3종류가 알려져 있고, 데스모콜린 1과 3은 주로 피부에 분포하고 있으나, 데스모콜린 2는 다른 조직에도 산재하고 있다고 알려져 있다.
피부의 탄력성이나 부드러움, 촉촉함 등의 느낌은 피부 각질층에 존재하는 수분에 의해 유지되므로, 건강한 피부를 위해서 보습은 매우 중요한 역할을 하고, 특히 HA(hyaluronic acid)는 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성천연 물질로 피부에서 보습 작용의 역할을 한다. HA는 인간의 피부에도 존재하며 보습 작용뿐만 아니라 다양한 생리적 작용을 조절하고, 피부는 증발된 수분으로 인한 수분부족현상으로 피부 탄력 저하, 잔주름이 형성되어 급격한 노화가 진행되므로 HA를 합성하는 HAS(hyaluronan synthase)의 발현 역시 중요하다.
멜라닌 생성 생성 경로에 영향을 미치는 인자 중에는 Advanced glycation end products(AGEs) 반응 혹은 non-enzymatic glycation 반응이 있다. 당화 반응(glycation)은 당과 단백질의 비효소적인 반응으로 환원당의 카르보닐기(carbonyl)와 단백질의 유리 아미노기인 리신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)과 반응하여 초기 당화 생성물인 시프 염기(schiff base)를 형성하고 이렇게 형성된 화합물들이 계속적으로 재배열 교차 결합 등의 일련 반응을 통하여 갈색의 화합물(Browning)인 비가역적 최종당화산물(Advanced glycation end products, AGEs)을 생성하는 반응이다. AGEs가 생성될 때 수용체인 receptor for AGE(RAGE)가 receptor site에 작용한다. AGE는 RAGE와 결합한 후에 멜라닌 합성 과정에서 중요한 전사조절인자인 Microphthalmia associated transcription factor(MITF)를 촉진하여, 멜라닌 생성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 효소 티로시나제(tyrosinase)의 발현을 촉진한다. 최종적으로 멜라닌 합성이 생성된다. 합성된 멜라닌색소는 멜라닌세포의 수지상돌기(dendrite)를 통하여 인접세포인 각질세포(keratinocyte)로 전달되며, 전달된 멜라닌색소는 각질세포를 통하여 피부 내 여러 부위에 분포하게 된다.
주름개선과 미백 등과 같은 효과를 얻기 위해서 이전부터 아스코르빈산, 알부틴 또는 이들의 유도체 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔는데, 이러한 물질은 안전성 문제로 화장료에 배합시 부작용에 대한 문제로 그 사용이 제한되고 있다. 또한 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었기 때문에, 본 발명자는 효소 활성이 아닌 세포 내 현상에 의해 mRNA 발현량을 조절하고자 노력하였다.
이에 본 발명자들은 천연소재 지충이와 다실불레기말로부터 화장품으로의 응용 가능성을 확인하고자 연구하였으며, 그 결과 이들을 혼합하여 발효 추출한 후 반방짜유기를 사용하여 숙성하는 경우 주름개선, 보습 및 미백활성이 증대되어 우수한 피부개선효과를 가지는 추출물을 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 10-2015-0124740 (2015.11.06.) 대한민국 공개특허 10-2016-0054727 (2016.05.17.)
본 발명은 지충이와 다실불레기말을 혼합 발효 추출한 후, 발효물을 다시 반방짜유기에서 숙성함으로써 주름개선, 보습 및 미백활성이 증진된 혼합발효추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따르면, (A)건조된 지충이와 다실불레기말을 혼합한 후 정제수로 추출하는 단계; (B)상기 추출물에 낫또균(Bacillus subtilis var. natto)을 접종하고 30~45℃에서 3~5일간 발효하는 단계; (C)발효물을 90~100℃에서 실활시키는 단계; 및 (D)발효물을 반방짜유기 용기에서 7~14일간 4~25℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법이 제공된다.
상기 (A)단계에서, 지충이와 다실불레기말은 건조중량으로 1:1~5의 비율로 혼합하는 것이며, 더욱 바람직하게는 1:3로 혼합하는 것이다. 상기 (D)단계에서 발효물을 반방짜유기 용기에서 10일간 12℃에서 숙성하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물을 조성물 전체 중량의 0.05~20중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 화장료 조성물은 주름개선용, 보습용 또는 미백용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물은 천연 추출물을 함유하여 안전하며 그 상승효과에 의하여 우수한 주름개선, 보습 및 미백 효과를 나타내므로, 이를 주름개선, 보습 및 미백용 화장료 조성물의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명 소재인 갈조식물 모자반과에 속하는 지충이(Sargassum thunbergii)는 우리나라 전 연안에 널리 분포하고 있는 갈조류로 조간대 하부에 뚜렷한 군락을 이루며 자란다. 어린 식물은 사료로 이용되고 있으나 그 외에는 활용이 비교적 낮은 해조류이다. 지금까지 지충이에 대한 연구로는 항균, 항염증 등의 생리활성 및 norisoprenoid 화합물들인 (+)-epiloliolide, (-)-loliolide, apo-9'-fucoxanthinone 등의 물질이 함유되어 있다고 보고되어 있다.
갈조식물 고리매과 다실불레기말 (Colpomenia expansa)은 주로 조간대 하부의 바위 위나 해조에 착생하여 공모양 또는 불규칙한 모양으로 전세계에 분포한다. 다실불레기말을 이용한 생리활성 연구로는 신경세포 독성의 억제효과와 골 형성에 미치는 영향 등이 보고되어 있다.
본 발명의 추출물 제조에는 반방짜유기가 사용된다. 반방짜유기는 구리와 주석이 78:22로 혼합된 동합금으로 이루어지며, 주물 유기 기법으로 그릇을 U자 모양으로 만든 다음 여러 차례 불에 달구어 가면서 오목하게 패어진 곱돌 위에 놓고 궁그름대라는 공구로 오근(오목한) 부분을 방짜식으로 늘여 가면서 만든다. 주조기법과 방짜기법을 절충한 방법으로 제작된 유기이다. 보온·보냉 효과가 좋아 음식의 맛을 살려 주는 기능을 지니고, 항균효과가 있어 식기로 널리 사용되고 있다.
본 발명에 따르면, (A)건조된 지충이와 다실불레기말을 혼합하고 정제수로 추출하는 단계; (B)추출물에 낫또균(Bacillus subtilis var. natto)을 접종하고 30~45℃에서 3~5일간 발효하는 단계; (C)90~100℃에서 실활시키는 단계; 및 (D)발효물을 반방짜유기 용기에서 7~14일간 4~25℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법이 제공된다.
각 단계를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저 지충이와 다실불레기말을 혼합하고 용매로 추출하여 혼합추출물을 제조한다. 본 발명의 일 구체예에 다르면 지충이와 다실불레기말을 건조 중량으로 1:1~5 비율로 혼합하여 정제수로 추출한다. 지충이와 다실불레기말을 1:3으로 혼합하여 추출하는 경우에 주름개선 및 미백활성이 더욱 우수하였다.
이어서, 상기 추출물에 미생물을 접종하여 발효시킨다. 바람직하게는 상기 추출물에 낫또균(Bacillus subtilis var. natto)을 접종하고 30~45℃에서 3~5일간 발효시킨다. 더욱 바람직하게는 35℃의 항온에서 3일간 발효시킨다. 낫또균을 사용하여 상기 조건에서 발효시키는 경우에 피부주름 및 미백활성이 가장 우수하였다.
이와 같이 발효공정을 진행한 후, 90~100℃에서 발효균을 실활시킨다. 이어서 상기 발효물을 반방짜유기 용기에 담아 숙성시킨다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 발효물을 반방짜유기 용기에서 7~14일간 4~25℃에서 숙성시킨다. 더욱 바람직하게는 12일간 10℃에서 숙성한다.
이와 같이 반방짜유기 용기에 담아 숙성시켜 제조되는 지충이와 다실불레기말의 혼합발효추출물은 주름개선 및 미백 효과가 더욱 증진되는 것을 확인할 수 있었다.
활성성분으로서의 상기 지충이와 다실불레기말의 혼합발효추출물은 화장료 조성물 전체중량에 대하여 0.05~20중량% 함유된다. 상기 혼합발효추출물은 그 자체로서 procollagen, desmocollin 발현을 증가시키는 주름개선효과와, Hyaluronan Synthase-3 발현을 증가시키는 보습효과뿐만 아니라, MITF, tyrosinase 발현을 억제하는 미백효과가 우수하므로 주름개선, 보습 및 미백용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.
또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.
[실시예]
이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 반방짜유기 그릇에서 후숙성한 혼합발효추출물 제조
건조된 지충이와 다실불레기말을 1:3의 중량비로 혼합한 뒤 10배 중량의 정제수에 넣고 70℃에서 3시간 동안 환류 추출하였다. 추출액에 1×106 CFU/mL의 낫또균을 접종한 후 35℃의 항온에서 3일간 발효하였다. 상기 발효물을 90~100℃에서 30분 동안 실활시킨 후 상온으로 냉침하였다. 이 후 상기 발효물을 여과지(Qualitive Filter Paper No.2, 5~8㎛)를 이용하여 여과하였다. 그리고 반방짜유기 그릇에 넣고 12일간 10℃에서 숙성시켰다. 숙성시킨 발효 추출물을 60℃ 이하에서 감압 농축하여 지충이와 다실불레기말의 혼합발효추출물을 제조하였다.
제조예 1: 반방짜유기 그릇에서 후숙성한 발효추출물 제조
지충이와 다실불레기말의 혼합물 대신 건조된 지충이를 10배 중량의 정제수에 넣어 추출하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 하여 지충이 발효추출물을 제조하였다.
제조예 2: 반방짜유기 그릇에서 후숙성한 발효추출물 제조
지충이와 다실불레기말의 혼합물 대신 건조된 다실불레기말을 10배 중량의 정제수에 넣어 추출하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 하여 지충이 발효추출물을 제조하였다.
비교예 1: 반방짜유기 후숙성과정을 거치지 않은 발효추출물 제조
건조된 지충이와 다실불레기말을 1:3의 중량비로 혼합한 뒤 10배 중량의 정제수에 넣고 70℃에서 3시간 동안 환류 추출하였다. 추출액에 1×106 CFU/mL의 낫또균을 접종한 후 35℃의 항온에서 3일간 발효하였다. 상기 발효물을 90~100℃에서 30분 동안 실활시킨 후 상온으로 냉침하였다. 이 후 상기 발효물을 여과지(Qualitive Filter Paper No.2, 5~8㎛)를 이용하여 여과 후 추출물을 60℃ 이하에서 감압 농축하여 지충이와 다실불레기말의 혼합발효추출물을 제조하였다.
비교예 2: 항아리 후숙성과정을 거친 발효추출물 제조
건조된 지충이와 다실불레기말을 1:3의 중량비로 혼합한 뒤 10배 중량의 정제수에 넣고 70℃에서 3시간 동안 환류 추출하였다. 추출액에 1×106 CFU/mL의 낫또균을 접종한 후 35℃의 항온에서 3일간 발효하였다. 상기 발효물을 90~100℃에서 30분 동안 실활시킨 후 상온으로 냉침하였다. 이 후 상기 발효물을 여과지(Qualitive Filter Paper No.2, 5~8㎛)를 이용하여 여과하였다. 그리고 발효물을 항아리에 넣고 12일간 10℃에서 숙성시켰다. 항아리에서 후숙성시킨 발효 추출물을 60℃ 이하에서 감압 농축하여 지충이와 다실불레기말의 혼합발효추출물을 제조하였다.
시험예 1: 세포 독성 여부 확인
세포 독성 여부를 확인하기 위해 HaCat 또는 B10F16 melanoma 세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 5×105 cells/well 의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예, 비교예 및 실시예에서 제조한 추출물을 시료농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎖씩 첨가한 후(3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Moleculardevice Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 1에 나타내었다.
세포생존율(%)=시료첨가군의흡광도/대조군의흡광도×100
농도
(㎍/㎖)		 세포 생존율(%)
실시예 1 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2 Adenosine Arbutin
0 100 100 100 100 100 100 100
50 100 100 100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 100 100 100
500 100 100 100 100 100 100 100
1000 99.7 99.9 99.3 98.9 99.4 99.1 99.5
상기 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 상기 실시예, 제조예 및 비교예의 추출물과 주름개선 대조군인 adenosine, 미백 대조군인 arbutin 시료 모두 500㎍/㎖ 농도에서 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.
시험예 2: Procollagen발현율 증가 효과 확인
HaCat 세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 5×105 cells/well 의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 실시예 및 제조예, 비교예의 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 HaCat세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPE Ⅰ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler (GenePro, Hangzhoubioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mMdNTP, 10 pmol primer(F: AGCCAGCAGATCGAGAACAT, R:TCTTGTCCTTGGGGTTCTTG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95℃ 5분 1cycle/95℃ 1분/51℃ 2분/72℃ 1분 28 cycle 증폭, 72℃에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 아래 식에 따라 계산하였으며 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 HaCat 세포를 사용하였다.
Procollagen 발현율(%)=(시료 procollagen 발현양)/(대조군 procollagen 발현양)×100
시료사용농도
(㎍/㎖)		 Procollagen 발현율(%)
실시예 1 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2 Adenosine
50 55.37 46.78 46.98 40.18 44.18 37.81
100 65.08 54.31 57.01 46.42 51.48 43.30
500 94.54 76.23 80.87 61.40 72.73 57.71
1000 160.02 137.70 146.94 91.19 113.10 84.64
상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 실시예 1은 제조예 1~2, 비교예 1~2, 대조군인 adenosine과 비교하여 높은 procollagen 발현율을 나타내어, 우수한 주름개선효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
시험예 3: desmocollin 발현율 증가 효과 확인
HaCat 세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 5×105 cells/well의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO2배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 실시예, 제조예 및 비교예의 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 HaCat세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 desmocollin 유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler(GenePro, Hangzhoubioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mMdNTP, 10 pmol primer (F:AGTGTGAGTTTGTTCATCACAGGTC,R:CCATGGCCTCACAGCCTTTA), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95℃ 5분 1cycle/95℃ 1분/51℃ 2분/72℃ 1분 28 cycle 증폭, 72℃에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 desmocollin의 발현율은 아래 식에 따라 계산하였으며 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 HaCat 세포를 사용하였다.
Desmocollin발현율(%)=(시료 desmocollin 발현양)/(대조군 desmocollin 발현양)×100
시료사용농도
(㎍/㎖)		 Desmocollin 발현율(%)
실시예 1 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2 Adenosine
50 128.48 119.68 121.05 114.51 118.22 110.13
100 149.68 139.52 141.49 132.83 137.49 128.41
500 184.10 171.05 176.64 162.05 168.97 155.37
1000 211.72 195.82 201.17 183.12 193.47 177.28
상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물인 실시예 1은 제조예 1, 2의 발효추출물, 비교예 1, 2의 혼합발효추출물이나 대조군인 adenosine과 비교하여 높은 desmocollin 발현율을 나타내었다.
시험예 4: Hyaluronan Synthase-3 발현 증가효과 확인
HaCat 세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 5×105 cells/well의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 실시예 및 비교예의 추출물을 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 HaCat 세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 hyaluronan synthase-3 유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler(GenePro, Hangzhoubioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mMdNTP, 10 pmol primer(F:AGTGTGAGTTTGTTCATCACAGGTC,R:CCATGGCCTCACAGCCTTTA), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95℃ 5분 1cycle/95℃ 1분/51℃ 2분/72℃ 1분 28 cycle 증폭, 72℃에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 hyaluronan synthase-3의 발현율은 아래 식에 따라 계산하였으며 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 HaCat 세포를 사용하였다.
hyaluronan synthase-3 발현율(%)=(시료 hyaluronan synthase-3 발현양)/(대조군 hyaluronan synthase-3 발현양)×100
시료사용농도
(㎍/㎖)		 hyaluronan synthase-3 발현율(%)
실시예 1 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2 Adenosine
50 133.08 128.90 129.47 123.94 127.34 118.58
100 139.54 133.19 135.05 128.56 132.93 122.11
500 144.73 137.54 139.56 132.70 135.99 127.48
1000 149.87 141.73 143.18 137.54 140.79 132.16
상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물인 실시예 1은 지충이, 다실불레기말 각각의 발효추출물인 제조예 1, 2나 반방짜유기 후숙성과정을 거치지 않은 비교예 1, 2의 혼합발효추출물에 비하여 우수한 보습효과를 나타내었다. 실시예 1의 본 발명 혼합발효추출물은 대조군인 adenosine과 비교하여도 매우 높은 hyaluronan synthase-3 발현율을 나타내었다.
시험예 5: MITF 및 Tyrosinase 발현 억제 효과 확인
B16F10 melanoma 세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 5×105 cells/well 의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음 시료를 농도별로 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간동안 5% CO2 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos.32: 512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자를 선택하여 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용하였다. 각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 5에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(OligodT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃, 5분 변성 후 Moloney murine leukemiavirus(M-MLV) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭 하였으며 총 반응액은 5㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100pmol, 1.0㎛, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5 mM, MgCl2(PCR 완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units 이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며 95℃ 2분 95℃ 30초 60℃ 30초 72℃ 1분 72℃ 5분 30~40사이클로 수행 하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍 Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현 양을 확인했다.
프라이머이름 염기서열
GAPDH Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
MITF Forward : AACCGACAGAAGAAGCTGGA
Reverse : ACAAGTTCCTGGCTGCAGTT
Tyrosinase Forward : TTATGCGATGGAACACCTGA
Reverse : ACTGGCAAATCCTTCCAGTG
발현억제율(%)=((시료무첨가-시료첨가) 발현양)/시료첨가발현양×100
시료사용농도
(㎍/㎖)		 MITF 발현 억제율(%)
실시예 1 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2 Arbutin
50 70.14 66.42 67.09 61.16 65.90 54.85
100 74.35 70.98 71.75 65.14 70.05 58.58
500 77.33 73.69 74.47 68.07 72.99 61.40
1000 81.58 78.97 79.66 72.02 77.15 65.08
상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 실시예 1은, 제조예 1, 2, 비교예 1~2, 대조군 arbutin과 비교하여 높은 MITF 발현 억제율을 나타내었다.
시료사용농도
(㎍/㎖)		 Tyrosinase 발현 억제율(%)
실시예 1 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2 Arbutin
50 72.46 69.25 70.39 63.54 68.76 58.86
100 75.35 72.64 73.14 66.40 71.57 61.63
500 79.88 77.81 78.32 70.72 76.08 65.82
1000 83.87 72.47 76.97 74.61 80.04 69.57
또한, 상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 본 발명 혼합발효추출물은 제조예 1, 2의 발효추출물, 비교예 1, 2의 혼합발효추출물에 비하여 우수한 티로시나제 발현억제율을 나타내었다. 또한, 대조군인 arbutin과 비교하여도 매우 높은 tyrosinase 발현 억제율을 나타냄을 확인하였다.
이로써, 본 발명의 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물인 실시예 1은, 지충이, 다실불레기말 각각의 발효추출물인 제조예 1, 2, 반방짜유기 후숙성과정을 거치지 않은 비교예 1, 2의 혼합발효추출물에 비하여, 그리고 대조군인 알부틴(arbutin)에 비하여 매우 우수한 피부미백활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
제형예 1: 지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물을 함유하는 세럼의 제조
지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물(실시예 1)을 함유한 세럼을 하기의 표 8의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
번호 원 료 함량(중량%)
1 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물(실시예 1) 1.0
2 밀납 1.0
3 폴리솔베이트 60 1.5
4 솔비탄세스퀴올레이트 0.5
5 미네랄 오일 10.0
6 소르비탄스테아레이트 0.5
7 친유형모노스테아린산 글리세린 1.0
8 스테아린산 1.5
9 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 1.0
10 프로필렌글리콜 3.0
11 카르복시폴리머 0.1
12 트리에탄올아민 0.1
13 페녹시에탄올 적량
14 정제수 To 100
제형예 2: 지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물을 함유하는 크림의 제조
지충이 및 다실불레기말 혼합발효추출물(실시예 1)을 함유한 크림을 하기의 표 9의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
번호 원 료 함량(중량%)
1 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물(실시예 1) 1.0
2 시어버터 2.0
3 폴리솔베이트 60 1.5
4 솔비탄세스퀴올레이트 0.8
5 미네랄 오일 10.0
6 디메치콘 3.0
7 소르비탄스테아레이트 0.5
8 친유형모노스테아린산 글리세린 1.0
9 세테아릴알코올 2.0
10 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 1.0
11 프로필렌글리콜 3.0
12 카르복시폴리머 0.25
13 트리에탄올아민 0.25
14 페녹시에탄올 적량
15 정제수 To 100
시험예 6: 제형안정도 확인
상기 제형예 1, 2에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인 하였다. 결과는 표 10에 나타내었다.
온도조건 안정성 확인(변색, 변취 및 분리)
제형예 1 제형예 2
실온(25) 0 0
냉장(4) 0 0
항온(50) 0 0
<제형 안정 등급>
0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화
상기 표에서 나타낸 바와 같이 제형예 1, 2 모두 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃) 조건하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않아 안정함이 확인되었다.

Claims (7)

  1. (A)건조된 지충이와 다실불레기말을 혼합한 후 정제수로 추출하는 단계;
    (B)상기 추출물에 낫또균(Bacillus subtilis var. natto)을 접종하고 30~45℃에서 3~5일간 발효하는 단계;
    (C)발효물을 90~100℃에서 실활시키는 단계; 및
    (D)발효물을 반방짜유기 용기에서 7~14일간 4~25℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (A)단계에서 지충이와 다실불레기말은 건조중량으로 1:1~5의 비율로 혼합하는 것임을 특징으로 하는 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (D)단계에서 발효물을 반방짜유기 용기에서 10일간 12℃에서 숙성하는 것임을 특징으로 하는 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물의 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 의하여 제조되는 지충이와 다실불레기말 혼합발효추출물을 조성물 전체 중량에 대해서 0.05~20중량% 함유하는 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름개선용 임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 보습용 임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부미백용 임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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