KR20090096256A - 발효 푸코잔틴 제조법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효 미생물을 이용하여 갈조류로부터 푸코잔틴(Fucoxanthin)을 추출하는 방법과 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 다시마, 미역, 모자반, 톳 등의 갈조류를 바실러스 속 균류를 이용한 발효를 통해 푸코잔틴을 높은 수율로 수득하고 이를 주요 활성성분으로 0.001 내지 30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 이는 피부 보습효과, 자극완화 효과, 미백효과, 주름개선효과, 아토피 개선효과가 있는 다기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 의하면 발효 푸코잔틴 추출물은 보습효과가 탁월할 뿐만 아니라 피부 잔주름 개선효과, 미백 효과, 아토피 개선 효과가 있어 이 물질을 이용하여 각종 기능성 화장료를 제조할 수 있다.

fucoxanthin, 갈조소, 발효 미생물, 보습, 주름 개선, 아토피 개선

Description

발효 푸코잔틴 제조법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 {A method for producing extract of fermented fucoxanthin and Cosmetic composition containing thereof}

본 발명은 발효 미생물을 이용하여 갈조류로부터 얻은 푸코잔틴(Fucoxanthin)을 추출하는 방법과 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서 보다 상세하게는 다시마, 미역, 모자반, 톳 등의 갈조류를 바실러스 속 균류를 이용하여 발효를 통해 푸코잔틴을 높은 수율로 수득하고 이를 주요 활성성분으로 0.001 내지 30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 피부 보습효과, 미백효과, 주름개선효과, 아토피 개선효과가 있는 다기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

일반적으로 해양에서 서식하고 있는 식물체인 해조류는 그 색상에 따라 녹조류 (Green Algae, Chlorophyta), 홍조류(Red Algae, Rodophyta), 갈조류(Brown Algae, Phaeophyta), 및 남조류(Blue-green Algae)로 구분된다. 갈조류에는 미역,다시마, 모자반, 톳 등이 있으며, 홍조류에는 김, 우뭇가사리, 돌가사리, 해인초 등이 있으며 녹조류에는 파래, 청각, 청태, 콜로렐라, 해캄, 반달말 등이 있으며, 남조류에는 흔들말 등이 있다.

상기한 해조류들은 엽록소 이외에도 여러 종류의 색소들을 포함하고 있으며, 예를 들어 홍조류에는 적청색 색소인 피코빌린(Phycobilin)이 함유되어있고, 갈조류에는 갈색 색소인 푸코잔틴(Fucoxanthin)과 카로틴(Carotene)이 함유되어 있다.

특히, 갈조류에 함유된 푸코잔틴은 천연 카로티노이드로서 항산화, 항암 및 항돌연변이 작용이 베타 카로티노이드보다 우수하다는 특성이 학술지를 통해 발표되고 있다. 이러한 푸코잔틴의 특성으로 인하여 현재 갈조류에서 추출된 푸코잔틴을

포함하는 카로티노이드는 임상적, 영양학적 및 공업적 분야에서 널리 사용될 전망이다.

인체에 있어서 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다.

이러한 피부는 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분된다. 표피층은 각질세포와 멜라닌세포로 구성되는데, 피부 최외곽의 각질세포층은 외부환경과 직접 접촉하기 때문에 물리적, 화학적 혹은 물질의 투과에 대한 강한 저항성이 요구되며, 인체로부터 외부로 수분이 손실되는 것을 막아줌과 동시에 자체로도 적당한 수분을 보유함으로써 유연성을 유지하여야 한다.

일반적으로 피부의 수분량은 진피층에서는 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 각질세포층에서는 약 10 내지 30%가 된다. 진피층에서 공급된 물은 주로 수동적 확산에 의해 각질층 상부로 이동하며 최종적으로는 외부로 배출된다. 이를 경피수분 손실(Trans Epedermal Water Loss : TEWL)이라 하며, 이러한 경피수분 손실을 적절한 수준으로 유지시켜주는 것이 각질세포층의 지질막 성분인 피지성분과 표피지질이라고 알려져 있다. 그리고, 각질세포층에는 천연보습 인자 (Natural Moisturizing Factor : NMF)라고 하는 친수성의 수분 보유능을 가진 물질이 존재하여 피부의 보습에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 각질세포층의 수분이 10 내지 30% 정도가 유지되면 피부는 매끄럽고 부드러우며, 신체 보호기능을 정상적으로 발휘하게 된다.

그러나, 각질세포층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다. 예를 들어, 건성피부의 경우에는 각질세포의 결집력이 약화되어 피부표면으로부터 비늘조각과 같이 각질세포가 허옇게 벗겨져 나오는 스케일링(Scaling) 현상이 나타나는 바, 이와 같이 피부가 건성화되는 것은 각질세포층의 수분함량이 정상피부에 비해 적기 때문이다. 이 밖에, 건강한 피부라 할지라도 혹독한 외부환경 즉, 바람, 추운 날씨, 햇빛, 세안, 면도 등에 의해 수분 부족현상이 일어나 피부상태가 나빠지기도 한다.

따라서, 피부의 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분, 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용되었다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기(OH 기)가 3개 이상인 글리세린, 솔리톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기(OH 기)가 2개인 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강 해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있으며, 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 그 보습능력에 한계가 있었다. 각질층의 수분을 보유할 수 있는 능력은 피지성분과 아미노산, 젖산, 요소 및 무기염 등으로 이루어진 천연보습인자(NMF)에 의해 조절되어지며 피부 외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고 보습효과가 높은 물질의 개발이 화장품에서 중요한 연구과제 중 하나이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 보습 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora

mukul)추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase) 억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단(Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다.

이에, 본 발명자들은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 갈조소인 푸코잔틴(fucoxanthin)을 선정하였으나 갈조류로부터 푸코잔틴을 추출하는 일반적인 방법에서는 갈조류로부터 푸코잔틴을 건조, 추출하는 과정에서 유효한 푸코잔틴이 분해, 소실될 뿐만 아니라 유기용매 등을 제거하는 과정에서 또한 분해 소실되어 그 수율이 저조한 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 발효 미생물인 바실러스 속 균류와 유산균을 이용하여 갈조류를 발효하여 유효한 푸코잔틴을 높은 수율로 수득하고 이들로부터 추출물을 제조하여 피부 보습 효과, 피부 자극 완화 효과, 미백효과, 주름개선효과, 아토피 개선 효과, 항염효과를 측정한 결과 우수하므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명의 목적은 미역이나 모자반, 톳, 다시마 등의 갈조류로부터 푸코잔틴을 높은 수율로 수득할 수 있도록 한 갈조류를 이용한 푸코잔틴의 추출방법을 제공하고 또한 이를 주요활성 성분을 함유하는 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 피부 보습효과, 자극완화 효과, 미백효과, 주름개선효과, 아토피 개선효과, 항염효과 등의 우수한 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 해양에서 채취하여 충분히 세척한 생체의 갈조류를 분쇄하고 상기 분쇄물에 발효미생물을 투입하여 상온에서 7일간 발효하여 유효성분을 추출함을 특징으로 하는 갈조류를 이용한 푸코잔틴의 추출방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

갈조류로부터 푸코잔틴을 높은 수율로 얻기 위하여 본 발명에서는 먼저 해양에서 채취하여 충분히 세척한 생채의 갈조류를 분쇄하는 분쇄단계를 거치게 된다.

갈조류로는 일반적으로 알려진 미역, 다시마, 모자반, 톳 등에서 선택되는 것을 사용할 수 있으며, 이들은 수확 즉시 충분히 세척한 다음 생채로 분쇄하는 것이 좋다. 이것은 갈조류를 태양 건조하는 경우 갈조류에 함유되어 있는 유효성분인 푸코잔틴이 분해되어 소실되기 때문이며, 따라서 높은 수율로 푸코잔틴을 얻기 위해서는 채취한 갈조류를 즉시 세척하여 생체로 분쇄하는 것이 바람직하다. 발효 푸코잔틴을 만들기 위하여 바실러스속 균주를 사용하였다. 바실러스 균주는 그람양성의 미생물이며, 내생포자 형성이 가능하고, 장간균(rod shape)의 형태를 가지고 있다. 본 발명에서는 호기적 또는 통성 혐기적인 조건에서 생육이 가능하도록 하였으며 생육조건으로는 갈조류 분쇄물을 미세하게 만든 후 이 분쇄물을 통상적인 미생물 배양액에 10g/1L를 첨가하였다. 발효조건은 약 37도에서 생육하게 하였으며, pH는 5~7에서 생육하게 하였다.

본 발명에서 사용한 발효 푸코잔틴은 다음과 같이 하여 얻었다. 위와 같은 조건으로 배양한 후 발효조에서 약 7일간 배양하였다. 배양액을 얻은 후 이 액을 0.25uM의 여과지를 이용하여 여과하였다. 이 여액은 다시 10일간 저온 숙성 시킨 후 여과하여 본 발명에 사용되어졌으며 사용하기 전에 최종 고형분의 농도를 10g/L가 되게 유지하였다.

제조된 발효 푸코잔틴은 통상적인 기초 화장료, 다시 말하면 유연 화장수(스킨), 영양화장수(밀크로션), 영양크림, 맛사지 크림, 엣센스, 팩등에 첨가되어 시용되는 데 이때 첨가량은 그 건조 중량에 대하여 0.0001∼20중량%, 바람직하게는 0.001∼10중량%를 화장료에 첨가한다. 이때 0.0001%미만일 때는 그 효과가 나타나기 어렵고 20% 이상 일 때는 피부에 자극을 유발할 가능성이 높으며 제형의 안정화에도 큰 영향을 미칠 수 있다.

아래의 실시예 및 실험예 들은 본 발명의 내용을 설명하나, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 발효 푸코잔틴 제조

갈조류로는 일반적으로 알려진 미역, 다시마, 모자반, 톳 등에서 선택되는 것을 사용하였으며, 이들은 수확 즉시 충분히 세척한 다음 생채로 분쇄한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 Bacillus 속 균주 배양액에 첨가하였다. 여기에 탄소원으로 포도당을 첨가하였으며, 펩톤과 NaCl을 추가로 첨가하여 배양하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 37도, pH 5-7로 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25uM 여과지를 이용하여 최종 여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4도의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 액을 다시 0.25uM의 여과기를 이용하여 최종 여과하였다. 여과가 완료되면 본 발명에서는 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 60℃정도에서 감압농축 또는 동결 건조하여 얻는 것을 특징으로 한다. 상기농축단계에서의 온도조건은 매우 중요한데 만일 추출액의 농축온도가 70℃를 초과할 경우 추출액에 함유된 유효성분인 푸코잔틴이 분해되어 소실되게 되는 문제점이 있으 므로 70℃를 넘지 않는 온도에서 추출액을 농축시킨다.

이와 같이 동결 건조하여 얻어진 본 발명에 따른 발효 푸코잔틴은 단독으로 또는 다른 재료와 혼합하여 통상적인 기초 화장료, 다시 말하면 유연 화장수(스킨), 영양화장수(밀크로션), 영양크림, 맛사지 크림, 엣센스, 팩 등을 포함한 다양한 분야에서 사용될 수 있다. 그런데 전술한 농축단계에서 얻어진 농축물을 그대로 건조할 경우 푸코잔틴 이외에 소량의 불순물이 함유되어 있으므로 이러한 문제를 해소하기 위하여 건조하기 전 혹은 건조 후 정제단계를 거쳐서 보다 정제된 푸코잔틴을 생산하여 이용할 수도 있다.

푸코잔틴의 확인은 황색분획물을 DPPH (1,1-Diphenyl-2- Picrylhydrazyl)와 반응시키면 확인할 수 있으며, 얻어진 분획물은 푸코잔틴이 분해되는 것을 방지하기 위하여 빛이 없는 암실에서 섭씨 40도의 낮은 온도에서 감압농축하여 고순도의 푸코잔틴을 얻는 것이 바람직하다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 미역이나 모자반, 톳, 다시마 등의 갈조류로부터 유효성분인 푸코잔틴의 손실을 최소화하면서 비교적 간단한 절차에 의하여 높은 수율로 추출물을 얻을 수 있는 이점이 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

물로 깨끗이 세척한 생체 다시마 2kg(건조중량 200g)을 브렌더(Blender)에 수회 세절하고 300메쉬를 이용하여 미세하게 만든 후 위에서 설명한 데로 바실러스를 이용 하여 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25uM 여과지를 이용하여 최종 여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4도의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 액을 다시 0.25uM의 여과기를 이용하여 최종 여과하였다. 여과가 완료되면 본 발명에서는 상기 추출단계에서 얻어진 추출액을 농축조로 이송하여 60℃정도에서 감압농축 또는 동결 건조하여 발효 푸코잔틴을 추출하였다.

<비교예 1>

건조된 분말 다시마 220g(수분 10%를 제외하면 200g임)를 2ℓ 삼각플라스크에 넣고 75% 에탄올을 1000㎖선까지 충분히 넣고 암소에 두면서 10분 간격으로 흔들어 12시간 동안 추출하고 농축하여 농축물 25g를 얻고 이를 회전 감압 농축기로 건조시켜 건조물의 수득량과 수율을 하기 표 1에 나타내었다.

표 1

구분	건조중량	수득량	수율(%)
실시예 1	200g	97g	48.5%
비교예 1	200g	13.4g	6.7%

상기 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명에 따라 생체 다시마를 사용하여 추출한 실시예 1의 경우 건조 다시마를 사용하여 일반적인 추출방법으로 유효성분을 추출한 비교예 1에 비하여 그 수율이 매우 우수함(약 7배)을 확인할 수 있다.

<실시예 2>

실시예 2: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 다른 항산화제 즉, 레티놀과 BHT를 비교샘플로 하여, NBT법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정함으로써 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서,

1. 0.05M Na2CO3 ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl2 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

억제율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

항산화 효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2과 같다.

[표 2]

시료명	처리농도(%)	항산화효과(%)
실시예 1	0.1	95
Retinol	0.1	93
BHT	0.1	90

0.1% 농도에서 시험한 시료 모두에서 우수한 항산화 효과를 나타내었고, 푸코잔틴 추출물은 retinol과 BHT와 유사하거나 우수한 항산화 효과를 가지는 것을 확인하였다.

실시예 3: DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물과 토코페롤과 같은 항산화제를 비교 샘플로 하여 DPPH법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서,

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 3과 같다.

억제율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

[표 3]

시료명	처리농도(%)	항산화효과(%)
실시예 1	0.01	90
녹차추출물	0.01	51
토코페롤	0.01	49

실험 결과 표 3에서와 같이 푸코잔틴 추출물은 0.01% 농도에서 녹차추출물과 토코페롤보다 더 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

실시예 4: in vitro MMP-1 inhibition assay

기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성은 생화학적 모델에서 측정하였는데 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접합된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 한다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰큘라 프루브 사). 클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트내에 공급하였다.

돼지 피부로부터 정제하고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl2 및 0.2mM 나트륨 아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응 완충액은 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트(몰큘라 프로브스)를 이용하였다. 푸코잔틴 추출물은 상기 반응 완충액 내에 용해시켰다. 이는 4; 2; 0.4; 0.2; 0.1%(w/v)에서 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다. 각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물(control)도 동일하게 항온처리 하였다. 또한 각각의 실험 조건에서 Blank, 이하 '효소 비함유 blank'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재하에서 항온처리 하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기(여기:485nm, 방출 505nm)로 측정하였다. '효소 비함유 blank' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플당 형광 단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타내었다.

결론적으로 선택된 실험 조건하에서 0.04 내지 4%(v/v)에서 테스트된 푸코잔틴 추출물은 투여랑 의존성으로 항 콜라게나제/젤라티나제 활성을 보유하였다.

[표 4]

실험샘플	저해율
	0.02 %(처리농도)		0.04 %(처리농도)
실시예 1	43		76
Retinol	0		6
녹차추출물	51		59

실험결과 푸코잔틴 추출물은 0.04% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 76%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과 보다 우수하게 나타내었다.

실시예 5: 자외선 조사 후 푸코잔틴 추출물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대 가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에

같은 시간동안 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다.

일차 항체(MMP-1(Ab-5) 단일클론 항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론 항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 푸코잔틴 추출물은 20% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과이다(표 5).

[표 5]

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-	-
실시예 1	0.1	23
Retinol	0.1	17

실시예 6 : B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 실험하였다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호:6323)로부터 분양받아 사용하였다.B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다.

셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm 에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC50값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

[표 6]

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(IC50)
실시예 1	0.1	0.09 %
알부틴	0.1	0.3 %
하이드로퀴논	0.1	0.07 %
유용성 감초 추출물	0.1	0.1 %

실험 결과 푸코잔틴 추출물의 IC50값은 0.09%로 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 7 : 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1×10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프 (Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 푸코잔틴 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다.

수학식 4에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 5에 의하여 계산하였다.

세포생존율(%) = [(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) = [1-(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

[표 7]

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
실시예 1	0.013	35
	0.025	63

실험결과 푸코잔틴 추출물은 자외선에 의한 세포 독성을 0.013% 농도에서 35% 완화하여 자외선에 의한 세포독성에 대해 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

실시예 8 : 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5×104개씩 넣고 24시간동안 부 착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프 (Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지 (DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 푸코잔틴 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕취하여 IL-1α를 정량함으로서 참나물 추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 6에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) = [1-(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

[표 8]

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 1	0.013	37
	0.025	69

실험결과 푸코잔틴 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.013% 농도에서 37% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 8).

실시예 9: 항균력 시험(Paper Disc Test)

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확 인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 준비한 균배양액을 BHI고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%; agar1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다.

실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(W/v)로 희석하여 직경 8㎜의 paper disc에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. Paper disc 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 푸코잔틴 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 18 ㎜인 것으로 나타났다.

실시예 10 및 비교예 2

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 9에 나타낸 바와 같다. 우선 표 9에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 10, 비교예 2)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타 (Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

* 미백효능 평가 기준

-3: 매우 악화 -2: 악화 -1: 약간 악화 0: 변화 없음

1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선

[표 9]

원료		실시예 10	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실 알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가) 알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	푸코잔틴 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	적량	적량

주)단위: 중량%

[표 10]

	피부색의 밝기 변화(ΔL)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 10	비교예 2	실시예 10	비교예 2	실시예 10	비교예 2
평균값	6.52	3.23	2.7	1.4	3.3	2.6

표 10에서 나타낸 바와 같이 푸코잔틴 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

실시예 11

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 잔주름 개선효과와 피부미용효과를 비교실험을 행하여 평가하였다. 실시예 10 및 비교예 2에서 제조된 크림을 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 잔주름 완화효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교한다.

표 11은 실시예 10에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름 감소율을 비교예 2의 크림을 사용한 실험자와 비교한 것이다. 표 11에서 나타난 바와 같이 푸코잔틴 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 눈주위 피부에서 피부 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

[표 11]

	실시예 10		비교예 2
	사용 전	2개월 사용 후	사용 전	2개월 사용 후
평균 잔주름 깊이	0.187	0.154	0.186	0.181
사용전 대비 주름 감소율(%)		17.6 %		2.7 %

n=20, p＜0.01

실시예 11 및 비교예 3∼6

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 푸코잔틴 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 보습효과를 비교예 3~6과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 12에 나타내 바와 같다. 우선 표 12에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 11 , 비교예 3∼6)을 제조한다. 실험자 20명을 대상으로 하박부에 실시예 12, 비교예 3∼6을 바르고, 약 90분 후에, 바르기 전과 바른 후의 보습능을 Corneometer(CM 820)로 △Hydration을 평가하였다.

[표 12]

원료		실시예 11	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6
가	스테아릴 알콜	8	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4	4
	2-옥틸도데실 알콜	6	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가) 알콜에스테르	3	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2	2	2	2
나	푸코잔틴 추출물	5	-	-	-	-
	글리세린	-	-	5	-	-
	Na-히알루론산염	-	-	-	5	-
	1,3-부틸렌글라이콜	-	-	-	-	5
	정제수	적량	적량	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

[표 13]

구분	실시예 11	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6
보습제 종류	푸코잔틴추출물	-	글리세린	Na-히아루론산염	1,3-부틸렌글라이콜
코네오미터 (△Hydration)	19	6	12	8	11

표 13에서 나타낸 바와 같이 푸코잔틴 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 보습효과가 우수함을 알 수 있다.

본 발명은 발효 미생물을 이용하여 갈조류로부터 얻은 푸코잔틴(Fucoxanthin)을 추출하는 방법과 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 다시마, 미역, 모자반, 톳 등의 갈조류를 바실러스 속 균류와 유산균을 이용하여 발효를 통해 푸코잔틴을 높은 수율로 수득하고 이를 주요 활성성분으로 0.001 내지 30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 피부 보습효과, 자극완화 효과, 미백효과, 주름개선효과, 아토피 개선효과, 항염효과가 있는 다기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 의하면 발효 푸코잔틴 추출물은 보습효과가 탁월할 뿐만 아니라 피부 잔주름 개선효과, 여드름방지효과, 피부 자극 완화 효과가 있어 이 물질을 이용하여 각종 기능성 화장료를 제조할 수 있다.

Claims (9)

1. 갈조류로부터 발효 미생물을 이용하여 푸코잔틴의 추출, 정제, 생산 방법
2. 청구항 1항에 있어서 생산된 푸코잔틴 및 이를 함유하는 화장료 조성물
3. 제1항 또는 제2항에 의해 제조된 푸코잔틴을 조성물 총중량에 대해 0.001 ∼30.0중량%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제3항에 있어서,

   상기 화장료 조성물은 피부 보습용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제3항에 있어서,

   상기 화장료 조성물은 자극 완화용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제3항에 있어서,

   상기 화장료 조성물은 피부 미백용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제3항에 있어서,

   상기 화장료 조성물은 주름 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 제3항에 있어서,

   상기 화장료 조성물은 아토피 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
9. 제3항에 있어서,

   상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W) 또는 유중수(W/O)형의 에멀젼, 연고의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.