KR20040047486A

KR20040047486A - 해조류로부터 fucoxanthin색소의 추출 및 색소제재 제조방법

Info

Publication number: KR20040047486A
Application number: KR1020020075723A
Authority: KR
Inventors: 김선재; 김영수; 순 택 정
Original assignee: 김선재; 김영수
Priority date: 2002-11-28
Filing date: 2002-11-28
Publication date: 2004-06-05

Abstract

후코크산틴을 디클로로메탄에 용해하고 드라이아이스 상에서 오존반응을 행하였다. 오존반응에 의해 생성된 산화개열산물은 실리카겔 크로마토그라피를 행하여 분획하고, 포토다이오드어레이 검출기를 이용하여 역상칼럼과 질얄분석계를 이용하여 분석하였다. 후코크산틴으로부터 생성된 카르보닐화합물로 중앙개열산물, 아포-14', 아포-12', 아포-10', 아포-8' 그리고 아포-6'이 동정되었다. 후코크산틴을 톨루엔 및 튜윈40 수용액에 용해하고 37도에서 자동산화시킨 결과, 다수의 카르보닐 화합물이 생성되었다. 후코크산틴의 자동산화에 의해 생성된 카르보닐 화합물의 대부분은 오존반응에 얻어진 산화개열산물이 나타내는 고속액체크로마토그라피상의 거동과 분광학적 특성이 서로 잘 일치하였다. 이러한 결과는 실험실 상의 산화적 조건하에서 후코크산틴 자동산화에 의해 산화개열산물이 생성되었다. 이를 분리정제하는 기술과 색소제재화 기술을 서술한다.

Description

해조류로부터 fucoxanthin색소의 추출 및 색소제재 제조방법{Preparation of Oxidative Cleavage and Extraction of Fucoxanthin from Sea-weed(Brown algae)}

카로테노이드는 장쇄의 공액이중결합을 특징으로 하는 일군의 색소의 총칭이다. 자연계에서는 약 600종류의 카로테노이드가 존재하지만 대부분은 탄소수 40개의 이소프랜 골격으로 구성되어 있는 화합물이다. 카로테노이드를 구조형태로 분류하면, 산소분자를 함유하지 않은 탄화수소 카로테노이드 (카로텐류 및 리코펜류 등)와 산소를 함유하는 카로테노이드(크산토필류)로 분류된다. 또한 이오논환의 유무에 의해 환상 카로테노이드(카로텐류 및 크산토필류)와 비환식 카로테노이드(리코펜 및 피토엔류)로 분류할 수 있다. 최근의 연구동향은 천연 카로테노이드 및 그 대사산물 등이 독특한 생리기능, 특히 암 및 노화를 일으키는 질병의 예방이라는 관점에서 그 중요성이 인식되고 있다. 자연계 등에 함유되어 있는 카로테노이드는 리코펜, 루테인, 뉴로스포렌, 제타 카로텐, 베타 카로텐, 피토플루엔 그리고 피토엔등의 카로테노이드로 구성되어 있는것으로 보고되고 있다.

최근에 암, 동맥경화, 당뇨병등의 질병을 일으키거나 노화촉진 원인물질 가운데 한가지로 알려진 활성산소에 대하여 그 소거활성을 천연의 항산화제 및 카로테노이드을 대상으로 검정하였는데, 후코크산틴이 토코페놀에 비해 약 100배, 베타 카로텐에 비해서는 약 2배 더 강하게 나타냈다고 보고되고 있다. 후코크산틴이 암세포의 성장억제 그리고 자궁암, 유방앙, 폐암세포의 성장억제 작용 등이 있음이 보고되고 있고 토마토를 소재로 한 식품이 전립선암 생성의 억제에 영향을 미친다는 연구 등이 활발히 이루어지고 있어 미역 중에 함유되어 있는 후코크산틴에 대해 관심이 집중되고 있다.

후코크산틴은 크로모피타, 규조류 및 갈조류등에 함유되어 있는카로테노이드의 하나로 구조내에 옥시게닌산, 하이드록실, 카르보닐, 에폭시 그리고 카르복실기를 가지고 있는 독특한 구조로 되어 있다. 후코크산틴의 생물학적 활성은 항종양 및 항산화활성에 대해서 보고가 되고 있지만 생체계에서의 연구는 미비하다. 본 발명에서는 미역 중에 함유되어 있는 후코크산틴을 추출하고 용매분획, 크로마토그라피 수법을 이용하여 색소를 정제하고 얻어진 후코크산틴 색소를 분광학적특성 등을 조사하여 천연색소 이용의 기초자료로 이용하고자 하였다.

도 1은 해조류로부터 fucoxanthin색소의 추출 방법

후코크산틴은 미역 추출물에 대하여 메탄올과 디클로로메탄올 용매로 하여 결정화하여 얻었다. 미역 추출물로부터 결정화로 얻어진 후코크산틴에 대하여 역상 컬럽이 장착된 고속액체크로마토그라피를 이용, 정제하였다. 즉 후코크산틴 30몰을디클로로메탄에 용해하고 질소가스로 완전히 휘발시켰다. 고형물에 대하여 아세톤 500 리터로 용해하여 50리터씩 10회 고속액체크로마토그라프에 주입하였다. 분석 컬럼은 TSK-GEL ODS 120Ts (4.6 ×250 mm), 검출기는 MCPD-3600 photodiode array detector (Otsuka Electronics Co. Ltd., Osaka, Japan) 그리고 유속은 1.0 mL/min의 조건으로 하였다. 용출용매는 0.1% 암모늄아세테이트 함유 메탄올 : 에틸아세테이트(70 : 30, v/v)로 하였다. 용출되어 나오는 후코크산틴의 피크를 분취하여 질소가스로 용매를 완전히 휘발시키고 얻어진 후코크산틴 획분에 대하여 재차 고속액체크로마토그라피를 행하여 전체 피크면적으로 계산하여 후코크산틴의 순도를 결정하였다.

후코크산틴의 카르보닐 화합물의 표준품을 얻기 위하여 후코크산틴을 dry ice 상에서 오존반응시켜 카르보닐 화합물을 얻었다. 오존은 8W 자외선 램프가 장착된 오존발생기(Matsui MO-5A, Matsui Co. Tokyo, Japan)를 이용하여 260 ml/min의 속도로 발생시켰다. 후코크산틴(2.0 mM)을 디클로로메탄에 용해시킨 후 오존과 반응을 시키고 후코크산틴 농도가 초기에 비해 10%정도 감소되는 시점에서 오존반응을 중지하였다. 반응용액은 회전강압농축기로 농축하고 질소로 완전히 용매를 휘발시킨 후 실리카겔컬럼 (Kieselgel, 30-70 mesh, bed volumn 80 ml, Merck, Darmstadt, Germany)을 이용하녀 크로마토그라피를 행하였다. 실리카겔 크로마토그라피는 시료를 헥산 :에틸아세테이트(99 : 1, v/v)로 용해한 후 컬럼에 주입하고 600 mL를 용출하였다. 이어 헥산 : 에틸아세테이트(95 : 5, v/v) 600 mL로 용출하여 이 획분을 오존에 의한 카르보닐 화합물 획분으로 하였다. 얻어진 각각의 산화개열산물은 역상컬럼-고속액체크로마토그라피를 통하여 각각의 피크를 분취한 후 용출용매를 완전히 휘발시키고 앰플에 분말상으로 -80도에서 보관하고 후코크산틴 산화개열산물의 표준품으로 하였다.

후코크산틴의 자동산화는 한델남등의 방법에 따라 톨루엔 및 5% 튜윈 40 중에서 행하였다. 유기용매 중의 자동산화는 후코크산틴(50 μM)을 톨루엔 1 mL로 용해하고 시험관 내에서 37도, 24시간 동안 황색등 하에서 정치하여 자동산화시켰다. 수용액 중의 자동산화는 5% 튜윈 40의 아세톤용액 1 mL와 디클로로메탄에 용해된 후코크산틴(50 μM)을 시험관에 넣어 혼합하고 질소가스로 휘발시켰다. 용매가 완전히 제거된 고형물에 대해 초순수 1 mL로 용해하였다. 후코크산틴이 함유된 튜윈 40 수용액은 황색등하에서 37℃, 24시간 진탕시키면서 자동산화시켰다. 각각의 자동산화 반응액에 0.02% 토코페놀 1 mL를 첨가하여 반응을 정지시키고 추출 및 분석할 때까지 -80도에서 보관하였다.

자동산화에 의해 후코크산틴으로부터 생성되는 카르보닐 화합물의 추출을 위해 먼저 자동산화 반응액 1 mL에 대하여n-hexane 2 mL로 3번 추출하였다. 모아진 헥산 층을 회전감압농축기를 이용하여 농축하고 질소가스로 완전히 휘발시켰다. 용매가 완전히 제거된 고형물을 헥산 : 에틸아세테이트(99 : 1, v/v) 300 μL로 용해하고 Bond Elut solid phase cartridge(SI 100 mg, Varian, Harbor, USA)에 주입하였다. 시료가 주입된 카트리지에 헥산 : 에틸아세테이트(99 : 1, v/v) 1 mL로 용출하고 이어 헥산 : 에틸아세테이트(95 : 5, v/v) 3 mL로 용출하였다. 얻어진 용출액을 농축한 후 아세트니트릴 200 μL로 용해하여 그 중 100 μL를 고속액체크로마토그라피 분석을 위해 사용하였다.

후코크산틴 및 그 산화개열산물의 고속액체크로마토그라피의 분석컬럼은 전처이컬럼인 Pelliguard LC-18(2 ×20 mm, Tosoh, Co., Tokyo, Japan)이 장착된 TSK-GEL ODS 80Ts (4.6 ×250 mm, Tosoh, Co.)를 사용하였으며 검출기는 MCPD-3600 photodiode array detector (Otsuka Electronics Co. Ltd., Osaka, Japan), 유속은 1.0 m/min의 조건으로 하였다.

후코크산틴의 분석을 위한 용출용매는 0.1% 암모늄아세테이트 함유 메탄올 : 에틸아세테이트(70 : 30, v/v)를, 카르보닐 화합물의 분석을 위한 용출용매는 0.1% 암모늄아세테이트 함유 아세트니트릴 : 메탄올 : 물(75 : 15 : 10, v/v/v)와 0.1% 암모늄아세테이트 함유 메탄올 : 에틸아세테이트(70 : 30, v/v)의 두 용매를 10분간 그라디언트시켜 분석하였다.

후코크산틴의 오존반응으로부터 생성된 카르보닐 화합물의 동정을 위하여 고속액체-질량분석기로 분석을 행하였다. 각각의 카르보닐 화합물의 양이온 질량스펙트라는 APCI-MS interface(Hitachi Co., Tokyo, Japan)가 장착된 M-1200 AP 질량스팩트럼과 고속액체 크로마토그라피 시스템인 L-7100을 이용하여 얻었다.

후코크산틴의 농도는 후코크산틴의 extintion coefficient 값(ε=185480)을 이용하여 결정하였다. 정제된 후코크산틴(1 nmol)에 대하여 고속액체크로마토그라프 주입량(50μL)이 0.4∼20 피코몰이 되도록 희석하여 고속액체크로마토그라프를 행하였고 농도와 피크면적의 상관관계를 이용, 검량선을 작성하였다. 그리고 Fucoxantinal의 정량은 extintion coefficient(ε=56888)을 이용, 상기와 동일한방법으로 검량선을 작성하였다.

후코크산틴을 고속액체크로마토그라피로 정제하여 순도 99.5%의 후코크산틴에 대하여 디클로로메탄에 용해시키고 오존반응을 행하였다. 이렇게하여 얻어진 산화개열산물 획분에 대하여 고속액체크로마토그라피를 행한 결과, 산화개열산물이 다량 생성되었으며 그 중 8개의 피크를 후코크산틴의 카르보닐계 산화개열산물로 인정하였다. 본 실험 조건에서의 용출시간은 피크 1은 6.23분, 피크 2는 7.32분, 피크 3은 8.02분, 피크 4는 9.34분, 피크 5는 11.06분, 피크 6은 11.57분, 피크 7은 12.57분 그리고 피크 8은 12.82분으로 나타난다. 또한 각각의 피크에 대하여 photodiode array dectector를 이용하여 분광학적 특성을 조사한 결과, 피크 1은 340 nm, 피크 2는 365 nm, 피크 3은 400 nm, 피크 4는 420 nm, 피크 5는 445 nm,피크 6은 460 nm, 피크 7은 470 nm 그리고 피크 8은 490 nm에서 최대흡수극대를 나타내어 다양한 흡수극대를 나타내고 있음을 알 수 있었다.

후코크산틴의 산화개열산물의 동정을 위하여 고속액체-질량분석기를 이용하여 분석한 결과 각각의 [M+H]⁺ion이 피크 1은 m/z 219, 피크 2는 m/z 259, 피크 3은 m/z 285, 피크 4는 m/z 311, 피크 5는 m/z 351, 피크 6은 m/z 377, 피크 7은 m/z 417 그리고 피크 8은 m/z 443으로 나타난다. 도 3은 피크 3의 mass spectrum을 나타낸 것이며 [M+H]⁺ion이 m/z 285를 나타내고 있다. 그 밖의 피크들의 질량스펙트라는 도 3에 제시한 것 처럼 각각이 뚜렷한 결과를 나타냈으며, 본 논문에서는피크 3의 질량스펙트럼을 그 예로 제시하였다.

후코크산틴의 산화개열산물을 분광흡광광도계와 고속액체-질량분석기를 통하여 그 구조를 분석한 결과, 피크 3은 후코크산틴 중앙의 이중결합이 개열하여 생성된 중앙개열산물인 것으로 판단되었다. 피크 1과 피크 5는 후코크산틴의 C₁₁과 C₁₂의 이중결합이 개열되어 생성된 것으로 피크 1은 단쇄의 화합물(C₁₅알데하이드)로 3,7,11-trimethyl-2,4,6,10-dodecatetraen-1-al이며 피크 5는 피크 1의 장쇄의 화합물인 apo-12' 화합물로 판단된다. 피크 2와 피크 4는 후코크산틴의 C₁₃과 C₁₄의 이중결합이 개열되어 생성된 것으로 피크 2는 단쇄의 화합물(C₁₈-케톤)인 6,10,14-trimethyl-3,5,7,9,13-pentadecapentaen-2-one이며 피크 4는 피크 2의 장쇄의 화합물로 apo-14' 화합물로 판단되었다. 그리고 피크 6은 apo-10', 피크 7은 apo-8' 그리고 피크 8은 apo-6'로 판단되었다. 후코크산틴을 톨루엔 및 5% 튜윈 40 수용액 중에 37도, 24시간 동안 자동산화시키고 고속액체크로마토그라피를 행한 결과, 도 5에 나타낸 것과 같이 후코크산틴의 자동산화 생성물이 다수 생성되었다. 톨루엔 중에서 생성된 카르보닐 화합물은 도. 5(A)에 나타낸 것처럼 각각의 피크 중에 피크 1∼8의 용출시간이 각각 6.24분, 7.31분, 8.05분, 9.30분, 11.07분, 11.57분, 12.55분 그리고 12.81분으로 나타나 후코크산틴을 오존반응에 의해 얻어진 산화개열산물인 피크 1∼8의 고속액체크로마토그라피의 용출위치와 잘 일치하였다. 그러나 5% 튜윈 40 수용액 중에서는 도 5(B)에 나타낸 것 처럼 피크 1∼6의 산화개열산물만이 후코크산틴을 오존반응에 의해 얻어진 산화개열산물과 일치하였다. 그리고5% 튜윈 40 수용액중의 자동산화 과정에서 피크 7과 8은 검출이 되지 않았으며 이 화합물은 자동산화과정 중 상대적으로 미량으로 생성되기 때문에 검출되지 않은 것으로 생각되었다. 그리고 톨루엔 및 5% 튜윈 40 수용액 중의 자동산화에 의해 생성된 산화개열산물의 스펙트라는 후코크산틴을 오존반응하여 얻어진 산화개열산물의 피크 1∼8과 동일한 스펙트라를 나타냈다.

베타 카로텐의 경우 산화개열산물의 생성반응은 디옥시게네이스에 의해 베타 카로텐의 중앙의 이중결합이 산화된 2분자의 레티날이 생성하는 중앙개열 이외에 베타 카로텐의 여러 이중결합 부위를 산화시키는 무작위개열이 알려져 있다. 그 중 무작위 개열반응은 여러 종류의 조직호모지네이트에서 비특이적으로 나타나며 효소가 촉매한다고 보고되어 있다. 그리고 베타 카로텐이 효소적 또는 비효소적인 개열에 의하여 레티날 및 아포카로테날이 생성되며 이것은 레티논산로 변환된다고 한다. 그리고 생성된 레티논산은 레티노이드 리셉터의 리간드로 작용하여 다양한 생물활성을 나타낸다고 한다. 이러한 보고들은 본 연구에서의 비효소계인 자동산화를 통하여 후코크산틴으로부터도 무작위 개열에 의하여 여러종류의 단편을 갖는 화합물이 생성된 결과의 근거가 되고 있으며 실제로 후코크산틴의 무작위 개열에 의하여 단쇄의 화합물인 3,7,11-trimethyl-2,4,6,10-dodecatetraen-1-al(피크 1) 그리고 6,10,14-trimethyl-3,5,7,9,13-pentadecapentaen-2-one(피크 2)가 생성됨 동시에 apo 형으로도 생성되는데 아포형은 자동산화 과정 중에 점차적으로 중앙개열산물로 개열된다고 생각된다(도 1). 이와같이 생성된 이들 대사산물이 생체내에서 어떻게 거동하는지 그리고 생성된 대사산물이 어떤 생물활성을 나타내는지에 대해서는 추후 심도있는 연구가 필요하리라 생각한다.

한편 후코크산틴과 중앙개열산물의 정량을 시도하였는데 각각의 extintion coefficient 값을 이용하여 농도를 결정하고 검량선을 작성하였다. 이렇게 작성된 검량선은 다양한in vitro또는in vivo실험에서 후코크산틴과 중앙개열산물의 함량을 측정할 수 있으며 그 밖의 중앙개열산물의 정량을 위하여 문헌에 제시된 extinction coefficient(ε) 값은 아포-12'이 84700, 아포-10'이 101000, 아포-6'이 108290로 보고되어 있어 이 값들을 이용 농도를 결정한 후 정량이 가능하리라 생각된다.

미역 carotenoid인 fucoxanthine은 생체 및 가공식품 형태로 인간이 섭취하게 되며 혈장 및 기관에 미량으로 흡수되며 대사되어진다. 따라서 중앙개열산물의 산화개열산물의 본체확인 및 생체 내의중앙개열산물과 그 대사산물의 정량법의 확립은 생체내에서 lycopene 및 그 대사산물이 나타내는 생물활성의 측정에 있어 중요한 요소가 될 수 있다고 생각한다.

Claims

갈조류로부터 Fucoxanthin 및 Peridinin의 추출, 정제, 생산 방법
청구항 1항에 있어서 생산된 Fucoxanthin 및 Peridinin의 산화개열산물의 오존처리기작, 추출 및 정제, 생산방법