피부는 나이를 먹음에 따라 다른 생물과 같이 노화현상을 일으키며, 성장기가 멈춘 시기의 피부를 왕성한 상태의 피부 구조 재구축에 의하여 재생하는 것은 거의 불가능에 가깝지만, 이미 생성된 주름에 대해서는 보다 적극적인 개선이 가능하여, 보다 탄력적이고 매끄러운 피부로 가꿀 수 있는 것으로 밝혀지고 있다.
최근 우리나라에서는 의료, 공중위생 혜택이 개선됨에 따라 고령화 사회가 급속히 도래하고 있고, 실제로 4명중 1명이 65세 이상인 고령화 사회의 도래가 예측되고 있다. 이에 따라, 생활의 질적인 향상이 도모되고 있으며, 젊음의 유지에 대한 욕구도 증가하고 있어, 외모 특히 피부에서 가장 먼저 나타내게 되는 노화를 지연시키고 예방하기 위하여 여러 영역에서 많은 연구가 진행되고 있으며, 특히, 화장품 제조분야에서는 미백, 주름 개선 등의 기능성을 강조하는 화장품, 특히 항 주름 화장료에 대한 요구가 증가하게 되었다.
이와 관련하여, 지금까지 알려진 항주름제로는, 건조한 피부를 촉촉히 함으로써 건조한 피부에 부수되는 각화의 이상이 정상으로 회복되도록 하여 주름을 개선시키는 보습제 형태, 콜라겐 생합성을 증가시킴으로써 피부의 탄력을 증진시켜 피부의 주름을 개선시키는 물질, 항산화효과를 갖는 물질 및 경피 수분 증발을 억제시키는 물질 등이 있다.
이 중, 항주름 효과를 갖는 보습제로서는, 히아루론산 또는 소듐콘드로이틴설페이트, 젖산을 들 수 있고, 의약품에 많이 사용되는 레티노인산도 항주름효과가 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나, 레티노인산은 피부가 붉어지고 자외선에 의한 민감성 반응을 나타내는 부작용등이 보고되었으며, 6개월 이상 계속 사용하여야만 효과가 나타난다는 문제점이 있다. 또한, 알파히드록시산도 항주름제로 공지되어 있으나, 이것 또한 가려움, 홍반, 자외선에 의한 민감성 반응등의 피부자극 부작용이 수반되어 제품의 안전성 측면을 만족시킬 수 없으므로, 화장품으로서의 가치가 떨어진다는 문제점이 있다.
한편, 피부는 여러 가지 중요한 기능을 가지고 있는데, 그 중에서도 대표적인 것이 태양광의 자외선으로부터 신체를 보호하기 위하여 멜라닌 생성을 억제하는 기능이 있는데, 멜라닌은 피부 세포의 일종인 멜라노사이트에서 생성되고, 피부 표면에 분포되어 인체에 유해한 자외선을 차단하는 자연적인 스크리닝 능력을 가지고 있다. 멜라닌 생성 기저에는 멜라노사이트에서 합성되는 티로시나제라는 효소가 있는데, 티로시나제는 티로신이라는 아미노산을 기질로 하여 도파(DOPA)를 거쳐 도파 퀴논(Dopaquinone)을 생성시키며, 도파퀴논으로부터 여러 단계의 산화 축합 반응으로 흑색색소인 멜라닌이 생성된다. 이미 아스코르빈산(특개평4-9320), 하이드로퀴논(특개평6-192062), 코지산(특개56-7710), 알부틴(특개평4-9315) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백화장료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서 안정성이 좋지못해 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이며, 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체레벨과 유사한 멜라노마 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코지산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 소량 함유한 화장료를 실온에서 수주일간 보관하면 갈변 현상이 발생한다. 알부틴도 세포독성을 일으키는 등 안전성 문제가 지적되고 있다. 이에 비해, 천연물들은 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 성분들을 가지고 있다.
이하, 본 발명에 따른 피부미백용 한방 화장료 조성물에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 측백엽 추출물, 산초 추출물 및 호장근 추출물을 함유하는 피부미백용 한방 화장료 조성물에 관한 것으로, 일 구현예에 따르면, 상기 측백엽 추출물, 산초 추출물 및 호장근 추출물은 각각 50~70중량부, 20~40중량부, 5~15중량부일 수 있으며, 좀 더 바람직하게는, 측백엽 열수추출물의 증류액 55~65중량부, 산초 열수추출물의 증류액 25~35중량부, 호장근 열수추출물 7~12중량부일 수 있다.
여기서, 상기 측백엽 추출물과 산초 추출물만을 함유하는 경우 또는, 측백엽 추출물과 산초추출물의 함량을 50∼70중량부 및 20∼40중량부 미만으로 함유할 경우, 피부미백의 효과가 미미하고, 호장근 추출물의 함량이 5∼15중량부 초과로 함유할 경우, 세포독성을 나타낸다. 따라서, 상기 범위 내에서 좀 더 바람직한 미백효과가 나타날 수 있다.
또한, 측백엽 추출물과 산초 추출물만을 함유하는 경우 또는 측백엽 추출물과 산초 추출물의 함량이 50∼70중량부 및 20∼40중량부 초과할 경우, DPPH를 이용한 항산화 시험에 의한 자유라디칼 생성의 감소가 미미하여 주름개선 효과가 미미하고, 호장근 추출물의 함량이 5∼15중량부 초과로 함유할 경우, 세포독성을 나타낸다. 따라서, 상기 범위 내에서 좀 더 바람직한 주름개선효과가 나타날 수 있다.
또한, 본 발명은, (a) 측백엽 및 산초를 각각 80 내지 100℃로 열수추출하는 단계; (b) 상기 수득된 각각의 열수추출물을 다시 80 내지 100℃로 가열하여 휘발되는 증류성분들을 냉각관을 이용하여 각각의 증류액 50 내지 70중량부 및 30 내지 50중량부를 수득하는 단계; 및 (c) 호장근을 열탕 증류기에서 80 내지 100℃로 가열하여 얻은 열수추출물 5 내지 15 중량부와 상기 (b)단계에서 얻은 증류액들을 혼합하는 단계를 포함하는 피부미백용 한방 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
이에 제한되는 것은 아니나, 일 구현예로써, (a) 측백엽 및 산초를 각각 30 내지 70중량부 및 10 내지 50중량부로 혼합하여 4 내지 8시간 동안 80 내지 100℃로 열수추출하는 단계; (b) 상기 수득된 열수추출물을 다시 4 내지 8시간동안 80 내지 100℃로 가열하여 휘발되는 증류성분들을 냉각관을 이용하여 증류액만을 수득하는 단계; 및 (c) 호장근을 열탕 증류기에서 4 내지 8시간동안 80 내지 100℃로 가열하여 얻은 열수추출물 5 내지 15 중량부와 상기 (b)단계에서 얻은 열수추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 피부미백용 한방 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 가열 온도가 80℃ 미만의 경우, 유효 성분이 제대로 추출되지 않을 뿐 아니라, 오랜 시간이 걸리고, 100℃ 초과일 경우 추출 시간은 단축되지만, 유효성분의 안정성에 문제가 있어, 80 내지 100℃가 바람직하다.
여기서, 상기 열수 추출시간이 4시간 미만인 경우, 유효성분의 추출양이 적어 효능이 만족스럽지 못하고, 8시간 이상일 경우, 유효 성분의 성질이 변질되어 만족스러운 효능을 얻을 수 없다.
본 발명에 따른 피부미백용 한방 화장료 조성물의 일 구성성분인 측백엽은 측백나무과 식물인 측백의 여린 가지와 잎으로, 측백엽에는 휘발유플라본류케르시트린탄닌, 이소피마릭산(isopimaric acid) 및 비타민 C 등이 함유되어 있다. 혈액응고시간을 뚜렷하게 단축시키며, 기침을 가라앉히고 담(淡)을 제거하여 천식을 진정시키고 항균항결핵 작용을 하며, 어느 정도 진정시키고 혈압을 낮추는 효능이 있다. 또한, 화장품에서 주로 항균방부 작용을 한다.
연구에 따르면, 신선한 측백을 60% 알코올에 담갔다가 7일 후에 여과하여 매일 3차례씩 탈모 부위에 발랐는데, 13차례의 임상실험(모두 앞이마정수리에서 뒤통수에 이르는 탈모로 원형탈모증은 해당사항이 없음) 결과 치료 후에 모두 모발이 자라났다. 꾸준히 발라주면서 적당히 약물의 농도를 진하게 조절하면, 모발이 비교적 조미하게 자라면서 쉽게 빠지지 않는다. 또한 측백엽은 원형탈모증을 치료하는데도 쓰이고, 항균작용을 하므로 다른 항균식물과 배합되어 방부제로도 쓰인다. 측백엽이 화장품에 쓰일 때는 주로 알코올에 우려낸 것과 달인 것을 사용하며, 측백엽으로 만든 트임방지크림은 트임을 방지하고 동상을 예방하여 피부를 부드럽게 한다.
본 발명에 따른 피부미백용 한방 화장료 조성물의 일 구성성분인 산초는 초피나무(Zanthoxylum piperitum DC.) 또는 기타 동속식물(산초과 Rutaceae)의 과피로 씨를 될 수 있는 대로 제거한 것이다. 중국에서는 청초(靑椒, Z. schinifolium Siebold et Zucc.), 花椒(화초, Z.bungeanum Maxim.)의 과피를 쓴다. 중국의 청초는 한국과 일본 각지에 흔히 자생하는 산초나무로 초피나무의 과피와는 형태, 성분이 서로 다르고 맛이 불쾌하여 약용으로는 부적당하다. 화초를 중국에서는 우량품으로 하고 있으나 이 역시 초피나무의 과피와는 성분면에서 차이가 있다. 산초의 성상은 2~3분과로 이루어진 삭과로 각 분과는 편구형으로서 2편으로 갈라지고 각 조각(片)의 지름은 약 5mm이다. 과피의 바깥면은 어두운 황적색~어두운 적색으로 유실(油室)에 의한 많은 오목한 작은 점이 있고 안쪽면은 엷은 황백색이다. 횡단면은 현미경으로 보면 바깥쪽표피와 이에 접하는 1 세포층 중에는 적갈색의 탄닌을 함유하고 과피 내부에는 지름 약 500㎛에 이르는 유실이 있고 군데군데 나선 문도관을 주로 하는 유관속이 산재하고 안쪽은 석세포층으로 되어 있고 안쪽 표피세포는 아죽 적다. 특이한 냄새가 있고, 맛은 맵고 혀를 마비시킨다.
본 발명에 따른 피부미백용 한방 화장료 조성물의 일 구성성분인 호장근은 전국 각처의 풀밭이나 길가에서 자라는 대형의 마디풀과로, 호장근 80g을 짙게 끓여 20일간 계속 복용하면 혈중의 지질을 감소시켜 어혈을 몰아낸다고 알려져있다. 또한, 황달성 간염에 사용하면 항균소염, 이뇨작용을 하고 이외에도 풍습성동통, 황혈, 수종, 월경 불순 등에 효과가 있다.
또한, 열수 추출시 일정 온도 이상에서 휘발되는 증류성분을 냉각 회수하면, 정유성분, 방향족 성분, 및 항산화 성분이 풍부한 열수 증류 분획을 확보할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 본 발명의 피부미백용 한방 화장료 조성물의 제조
본 발명에 따른 피부미백용 한방 화장료 조성물을 수득하기 위하여, 측백엽 600g, 정제수 20L를 넣고 열탕 증류기에서 4 내지 8시간 정도, 80 내지 100℃로 가열하여 열수 추출물을 얻었다. 산초의 열수 추출물도 위와 동일한 방법으로 얻었다. 상기 수득된 열수 추출물을 각각 다시 4 내지 8시간동안 80 내지 100℃로 가열하여 휘발되는 증류성분들을 4 내지 10℃의 냉수 냉각관을 이용하여 10L의 맑은 증류액만을 획득하였다. 호장근 1500g을 정제수 20L에 넣고 열탕 증류기에서 4 내지 8시간 정도, 80 내지 100℃로 가열하여 열수 추출물을 얻었다. 이 추출액과 위에서 얻은 각각의 열수 추출물의 맑은 증류액을 하기 표 1과 같이 혼합하여 제조하였다.
[표 1]
실험예 1: 본 발명에 따른 한방 화장료 조성물의 세포 독성 시험
(1) 인간 각질형성 세포 배양
인간 각질형성 세포인 HaCaT 세포주(Cell Lines Service, Germany)는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신 처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 × 103 cells/cm2으로 계대 배양하였다. 세포의 배양에는 10% Fetal Bovine Serum (FBS, GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA)과 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대 배양을 위하여 75 T-flask (NUNC, Cat. No. 156499, Danmark)가 사용되었으며, 하기한 세포 독성 시험을 위해서는 24 웰 플레이트 (NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)가 사용되었다.
(2) 세포 독성 시험
MTT 분석법은 살아있는 세포에서만 활성을 보이는 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용을 이용하여 최종적으로 포르마잔(formazan)이라는 색소 산물을 형성시켜 그것을 측정함으로 시험물질의 세포 독성 정도를 측정하는 방법이다.
도 1 에 나타난 바와 같이, 10% 함유된 경우 대조군(C)에 비해서 146± 1.37 %의 증식 정도를 보였고, 또한 5%, 1%, 0.5%, 및 0.1% 처리시 각각 146.9± 1.78%, 130± 3.9%, 113.8± 2.82%, 및 121.1± 2.47%로 대조군에 비해 세포증식능을 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 피부미백용 한방 화장료 조성물을 장기간 사용하여도 세포독성에 의한 피부 자극이 유발되지 않음을 알 수 있었다.
도 1 에 나타난 바와 같이, 10% 함유된 경우 대조군(C)에 비해서 146±1.37 %의 증식 정도를 보였고, 또한 5%, 1%, 0.5%, 및 0.1% 처리시 각각 146.9±1.78%, 130± 3.9%, 113.8± 2.82%, 및 121.1± 2.47%로 대조군에 비해 세포증식능을 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 피부미백 및 주름개선용 한방 화장료 조성물을 장기간 사용하여도 세포독성에 의한 피부 자극이 유발되지 않음을 알 수 있었다.
실험예 2: 본 발명에 따른 한방 화장료 조성물의 DPPH를 이용한 항산화 시험
화합물 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH, Sigma D9132-1G, USA)는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 한방 조성물과 일정 비율로 혼합하여 생성된 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지를 확인하였다. 에탄올을 0.2 ml에 에탄올로 제조된 0.1 mM DPPH 용액 0.5 ml 및 정제수를 이용하여, 최종농도가 10% ∼ 0.1% 되도록 실시예 1에서 제조한 한방 조성물을 0.3ml을 첨가하였다. 10초간 강하게 볼텍싱(vortexing) 하고, 냉암소에서 30분간 보관한 다음, ELISA를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
도 2에서 나타난 바와 같이, 정제수를 사용한 대조군(C)과 비교하여 10% 처리시 반응계의 DPPH 자유라디칼이 38.06%, 5% 처리시 24.75%, 1% 처리시 7.78 %, 0.5% 처리시 4.51%, 0.1% 처리시 2.9% 감소됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 1 내지 10%의 높은 함량 사용하여도 세포 독성이 적으면서 유의적인 항산화능으로 미백 효과와 항주름 효과를 나타내었다.
실험예 3: 본 발명에 따른 한방 화장료 조성물의 L-DOPA를 이용한 미백 시험
본 발명에 따른 피부미백 및 주름개선 한방 화장료 조성물의 산화반응에 대한 저해 효과를 알아보기 위해, 멜라닌 (melanin)을 합성하는 주요 효소인 티로시나아제 (tyrosinase)의 L-3,4-dihydrophenylalanine (L-DOPA) 산화 반응을 억제하는 정도를 시험하였다.
100 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (sodium phosphate buffer, pH 7.0) 0.85 ml에 버섯 티로시나아제 0.05 ml, 및 실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 한방 조성물을 10%에서 0.5%까지 혼합하였다. 강하게 교반한 후, 37℃ 항온조에서 6분간 반응시켰다. 반응 후 기질이 되는 L-DOPA 0.05 ml을 첨가하여 강하게 교반하고 추가적으로 1분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 전체 반응계에서 약 0.2 ml을 취하여 96 웰플레이트 (well plate)에 옮기고, 효소결합면역흡수법 (ELISA)을 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 산화 저해능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조구의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다. 반응계 내에 5%에서 0.1%까지의 본 발명의 한방 화장료 조성물을 첨가할 경우 그 효소적 산화반응의 저해 정도를 도 3에 나타내었다.
도 3 에서 나타난 바와 같이, 정제수를 사용한 대조군(C)에 비하여 5% 처리시 31.86 ± 0.47%, 1% 처리시 10.29 ± 1.03%, 0.5% 처리시 7.66 ± 2.69%, 및 0.1% 처리시 1.8 ± 1.6%의 산화 반응 저해능을 확인하였다. 상기 결과를 통하여 본 발명에 따른 한방 조성물이 효소에 의해서 매개되는 산화 반응에 대한 저해도 가능하고, 티로시나아제의 L-DOPA 산화 저해 능력이 입증됨으로써 미백 소재로 응용가능함을 뒷받침해주었다.
실험예 4: 본 발명에 따른 한방 화장료 조성물의 잔존 생균 시험을 통한 정균능
본 발명에 따른 피부미백 및 주름개선 효과를 갖는 한방 화장료 조성물이 자발적 정균능을 통하여, 첨가되는 방부제 처리 없이 미생물의 천이를 억제할 수 있는지를 확인하였다.
실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 한방 조성물 내 발생 가능한 생균의 수를 확인하기 위하여, 상기 한방 조성물을 제조한 직후와 30일간 상온에서 방치한 후 생균수 확인 시험을 실시하였다. 제조된 한방 조성물 0.1 ml을 레틴 한천배지 (Difco, USA)에 도말하고, 30℃에서 48시간동안 배양하여 세균의 존재를 확인하였으며, 0.1ml을 사브로우드 덱스트로즈 한천배지 (Difco, USA)에 도말하고 25℃에서 72시간동안 배양하여 진균의 존재를 확인하였다.
도 4 에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 한방 조성물 제조 직후 세균(A)과 진균(B)의 존재를 한천 배지에 도말 후 배양하는 방법으로 확인한 결과 생균이 존재하지 않았으며, 상온에서 30일간 방치 후에도 세균(C)과 진균(D)이 존재하지 못하였음을 확인할 수 있었다. 따라서, 상온에서 장기간 보관으로도 방부제의 첨가 없이 미생물의 천이를 억제하는 본 발명에 따른 한방 조성물의 정균능은 세균 및 진균등의 비정상적 천이를 억제함으로써 미백 및 항주름 효과를 가능하게 할 수 있다.