CN116918701A - 细梗蔷薇愈伤组织培养基及提取物、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细梗蔷薇愈伤组织培养基及提取物、制备方法和应用。本发明的细梗蔷薇愈伤组织培养基包括以下组分：植物组织培养的基础培养基、维生素C 1~50 mg/L、烟酰胺1~50 mg/L、传明酸1~100 mg/L和羟丙基四氢吡喃三醇0.002~0.1%。本发明的细梗蔷薇愈伤组织培养基相比现有的培养基，培养细梗蔷薇愈伤组织获得的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物在皮肤细胞抗氧化方面的功效显著提升。
Description
技术领域
本发明涉及一种细梗蔷薇愈伤组织培养基及提取物、制备方法和应用。
背景技术
植物愈伤组织细胞因其丰富的次级代谢产物，天然性，环境友好，条件可控被广泛应用于食品、药品和化妆品行业。利用植物细胞培养技术获得的抗癌成分紫杉醇，在2000年获得了FDA的批准，苹果干细胞因其保护细胞的功能被许多化妆品品牌应用。蔷薇科中的多种植物提取物被应用于食品和化妆品中，具有改善皮肤色泽，调节水油平衡，增强皮肤活力等功效。细梗蔷薇（Rosa graciliflora Rehd. et Wils）是一种稀缺的蔷薇科植物资源，主要分布在云南、四川、西藏和陕西的部分地区，它的根和果实可入药，具有提高免疫力，收敛和消肿的功效，是一种值得关注和开发的野蔷薇。
近年来多篇文献报道维生素C、烟酰胺、传明酸、羟丙基四氢吡喃三醇对皮肤具有美白、保护皮肤细胞、提亮肤色等功效，被广泛地运用于化妆品产品中。研究表明维生素C在人体皮肤中具有抗氧化，协助胶原蛋白合成的作用，可以抗老化，减少皱纹，抑制黑色素生成等。烟酰胺具有抑制皮肤表面色素沉着和美白肌肤的功效，其美白作用机理可能与其抑制黑素体由黑素细胞向角质细胞转移有关，烟酰胺在外用时能降低经皮的水分丢失，减少皮脂的分泌，增强皮肤的屏障功能，还能增加角质层的黏结性和厚度，增加角质层的成熟度。传明酸又称氨甲环酸，是一种纤溶酶抑制剂，它与异常纤溶有关能够减少失血，理论上任何对角质层形成的损伤都可能通过PA激活系统引起色素过度沉着，而传明酸可能通过抑制PA从而抑制黑色素的合成过程。羟丙基四氢吡喃三醇是从山毛榉树中提取分离得到的一种木糖的衍生物，其主要功效有促进粘多糖、蛋白多糖合成，促进胶原蛋白合成，恢复衰老皮肤中真皮-表皮连接，以及帮助真皮维持弹性，促进受损组织再生。这几种化妆品功效成分在国内外化妆品行业中应用广泛，近几年来深受大众欢迎。但是目前国内外尚无这些成分用于愈伤组织培养的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中的培养基培养细梗蔷薇愈伤组织获得的细胞提取物的护肤功效方面有待提高的缺陷，从而提供了一种细梗蔷薇愈伤组织培养基及提取物、制备方法和应用。本发明的细梗蔷薇愈伤组织培养基相比现有的培养基，本发明提供的培养基培养细梗蔷薇愈伤组织获得的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物在皮肤细胞抗氧化方面的功效显著提升。
本发明通过以下方案解决上述技术问题：
一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其包括以下组分：
植物组织培养的基础培养基、
维生素C 1~50mg/L、
烟酰胺1~50 mg/L、
传明酸1~100 mg/L和
羟丙基四氢吡喃三醇0.002~0.1%，所述百分比是指所述羟丙基四氢吡喃三醇占所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的质量百分比。
较佳地，所述维生素C在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度为3~45mg/L，例如10-20mg/L，再例如5、8、10、12、14、15、20、25、30、35或40mg/L；更佳地为8~12mg/L，例如10mg/L。
较佳地，所述烟酰胺在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度为3~45mg/L，例如10-20mg/L，再例如5、8、10、15、20、25、30、35或40mg/L；更佳地为8~12mg/L，例如10mg/L。
较佳地，所述传明酸在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度为3~95mg/L，例如18~60mg/L；再例如10、20、30、40、50、60、70、80或90mg/L；更佳地为18~22mg/L，例如20mg/L。
较佳地，所述羟丙基四氢吡喃三醇占所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的质量百分比为0.002~0.09%，例如0.002~0.005%，再例如0.003、0.005、0.006、0.007、0.008或0.009。更佳地为0.002~0.003%，例如0.002%。
较佳地，所述维生素C、所述烟酰胺、所述传明酸的质量比为：1：1：2。
较佳地，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中所述维生素C、所述烟酰胺、所述传明酸的质量浓度分别为10mg/L、10mg/L、20mg/L。
较佳地，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中所述维生素C、所述烟酰胺、所述传明酸、所述羟丙基四氢吡喃三醇的质量浓度分别为10mg/L、10mg/L、20mg/L、0.002~0.1 %。
本发明中，所述细梗蔷薇一般是指蔷薇科蔷薇属植物细梗蔷薇（Rosa. gracififlora）。
本发明中，所述基础培养基可选自本领域常规的用于植物组织培养的培养基，例如MS培养基、N6培养基、B5培养基、SH培养基或White培养基，较佳地为MS培养基。
较佳地，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基还包括冰川水，所述冰川水的水源地较佳地为喜马拉雅山，例如喜马拉雅山脉中段北坡；所述冰川水的取水口优选为日喀则岗巴县曲登尼玛冰川。
本发明中，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基按照本领域常规还可包括植物激素。
所述植物激素可选自本领域常规的植物激素，较佳地，选自α-NAA、6-BA、2,4-D和KT中的一种或多种；更佳地，为2,4-D和KT。
其中，所述α-NAA是指α-萘乙酸，为本领域常规的植物生长调节剂。
其中，所述6-BA是指6-苄氨基腺嘌呤，为本领域常规的人工合成的细胞分裂素。
其中，所述2,4-D是指2,4-二氯苯氧乙酸，为本领域常规的合成植物生长素类似物。
其中，所述KT是指激动素，是一种内源的细胞分裂素，化学名称为6-糠基氨基嘌呤（或6-呋喃甲基腺嘌呤）。
较佳地，所述植物激素在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度为3.0 ~4.0 mg/L，更佳地为3.5mg/L。
当所述植物激素为2,4-D和KT时，2,4-D在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度较佳地为3 mg/L，KT在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度较佳地为0.5 mg/L。
本发明所述的细梗蔷薇愈伤组织培养基，其pH可为本领域常规用于植物组织培养的培养基的pH，例如为5~7，较佳地为5.8。
本发明所述的细梗蔷薇愈伤组织培养基，还可按照本领域常规的培养基要求，进一步包括碳源，例如蔗糖、麦芽糖和葡萄糖中的一种或多种，较佳地为蔗糖。所述碳源的浓度可为本领域常规的培养基中碳源的浓度，例如在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度为28~35g/L，较佳地为30 g/L。
本发明所述的细梗蔷薇愈伤组织培养基，还可按照本领域常规的培养基要求，进一步包括凝固剂，例如琼脂和/或明胶，较佳地为琼脂。所述凝固剂的浓度可为本领域常规的浓度，例如在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基中的浓度为6~8 g/L，较佳地为7 g/L。
在本发明的一个较佳实施方案中，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基包括如下成分：MS、2,4-D 3.0 mg/L、KT0.5 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L、冰川水、维生素C 10mg/L、烟酰胺 10mg/L、传明酸20 mg/L、羟丙基四氢吡喃三醇 0.002%。较佳地，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基由以下成分组成：MS、2,4-D 3.0 mg/L、KT0.5 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L、冰川水、维生素C 10mg/L、烟酰胺 10mg/L、传明酸20 mg/L、羟丙基四氢吡喃三醇 0.002%。
本发明还克服了现有技术中的培养基培养的细梗蔷薇愈伤组织增殖倍率不够高且对抗UVB的护肤功效方面有待提高的缺陷，而提供了一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其可显著提高细梗蔷薇愈伤组织的增殖倍率，促进细梗蔷薇愈伤组织的生长，且对皮肤细胞（HaCaT细胞、FB细胞）抗UVB方面的功效明显提升。
本发明通过以下方案解决上述技术问题：一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其包括以下组分：植物组织培养的基础培养基、维生素C45~55mg/L。
其中，所述维生素C的浓度较佳地为 50mg/L。
其中，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基较佳地由以下组分组成：植物组织培养的基础培养基、维生素C45~55mg/L。更佳地，所述维生素C在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的浓度为50 mg/L。
本发明还克服了现有技术中的培养基培养的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物在促进皮肤细胞增殖和皮肤抗氧化作用有待提高的缺陷，而提供了一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其可在促进皮肤细胞增殖和皮肤抗氧化方面有明显提升。
本发明通过以下方案解决上述技术问题：一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其包括以下组分：植物组织培养的基础培养基、传明酸90~110 mg/L。
其中，所述传明酸较佳地为100 mg/L。
其中，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基较佳地由以下组分组成：植物组织培养的基础培养基、传明酸90~110 mg/L。更佳地，所述传明酸在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的浓度为100 mg/L。
本发明还克服了现有技术中培养基培养的细梗蔷薇愈伤组织获得的细胞提取物对皮肤细胞增殖、酪氨酸酶抑制率不够高的缺陷，而提供了一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其对皮肤细胞（HaCaT细胞、FB细胞）增殖、抑制酪氨酸酶作用明显。
本发明通过以下方案解决上述技术问题：一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其包括以下组分：植物组织培养的基础培养基、羟丙基四氢吡喃三醇 0.009~0.015%。
其中，所述羟丙基四氢吡喃三醇的浓度较佳地为0.01%。
其中，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基较佳地由以下组分组成：植物组织培养的基础培养基、羟丙基四氢吡喃三醇 0.009~0.015%。更佳地，所述羟丙基四氢吡喃三醇的浓度为0.01%。
进一步地，本发明还提供一种细梗蔷薇愈伤组织培养基的制备方法，其包括如下步骤：将所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的各成分混合，即可。
其中，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的制备方法还可根据本领域常规包括杀菌步骤，例如高温灭菌。
当所述细梗蔷薇愈伤组织培养基包括维生素C时，较佳地还包括在高温灭菌后，待温度降低至65℃以下之后，再添加所述维生素C；
或者，当所述细梗蔷薇愈伤组织培养基包括烟酰胺时，较佳地还包括在高温灭菌后，待温度降低至65℃以下之后，再添加所述烟酰胺；
或者，当所述细梗蔷薇愈伤组织培养基包括传明酸时，较佳地还包括在高温灭菌后，待温度降低至65℃以下之后，再添加所述传明酸；
或者，当所述细梗蔷薇愈伤组织培养基包括羟丙基四氢吡喃三醇时，较佳地还包括在高温灭菌后，待温度降低至65℃以下之后，再添加所述羟丙基四氢吡喃三醇；
或者，当所述细梗蔷薇愈伤组织培养基包括维生素C、烟酰胺、传明酸和羟丙基四氢吡喃三醇时，较佳地还包括在高温灭菌后，待温度降低至65℃以下之后，再添加所述维生素C、所述烟酰胺、所述传明酸和所述羟丙基四氢吡喃三醇。
进一步地，本发明还提供一种细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物，其由对培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞进行提取得到，所述培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞是由前述细梗蔷薇愈伤组织培养基对细梗蔷薇愈伤组织进行培养得到。
其中，所述培养的条件可为常规的植物愈伤组织培养的条件，较佳地为：温度20±1℃，湿度60%~75%，光照强度1500 Lx ~ 2000Lx，每天光照12小时。
所述培养的时间可为本领域常规的培养时间，较佳地为20天。
较佳地，所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的固含量为3~5 mg/mL，更佳地为3.0~4.5 mg/mL，例如3.26、3.77、3.98或4.07mg/mL。所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的固含量是指将细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物进行烘干后剩余部分的质量占细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物总质量的质量百分数。
所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中多酚的含量较佳地为3.0~4.5%，例如3.4、3.5、4.0或4.1%。所述多酚的含量是指多酚占细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的质量百分比。
所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中Vc的含量较佳地为1~2mg/kg，例如1.1、1.2、1.5或1.7mg/kg，所述Vc的含量为以细胞湿重计每1kg的所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中Vc的质量。
所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的烟酰胺含量较佳地为100~600mg/kg，例如117.6、200.8或518.6 mg/kg。所述烟酰胺的含量为以细胞湿重计每1kg的所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中烟酰胺的质量。
所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的传明酸的含量较佳地为100~500 mg/kg，例如120、216或518mg/kg。所述传明酸的含量为以细胞湿重计每1kg的所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中传明酸的质量。
其中，所述提取的方法可为本领域常规的提取方法。例如超声提取。较佳地，包括如下步骤：取新鲜的所述培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞，研磨，加入适量水后，超声、离心、取上清液，过滤，得到所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物。
其中，所述研磨的速率可为本领域常规的研磨速率，例如50~70 Hz，再例如60Hz；研磨时间可为本领域常规的研磨时间，例如50~70s，再例如60s；研磨次数可为本领域常规的研磨次数，例如1~3次，再例如2次。
其中，所述水较佳地为去离子水，所述水的体积较佳地为新鲜的所述培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞的10倍。
所述超声提取的功率可为本领域常规的超声提取的功率，例如500W；所述超声提取的时间可为本领域常规的提取时间，例如30min。
所述离心的速率可为本领域常规的离心速率，例如5000 rmp；所述离心的时间可为本领域常规的离心时间，例如30min。
所述过滤所使用的过滤膜的孔尺寸可为本领域常规的过滤膜孔尺寸，较佳地为0.45 μM。
进一步地，本发明还提供一种细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物在制备皮肤外用剂中的应用，所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、抗衰老活性成分或美白活性成分。
其中，所述皮肤外用剂可为本领域常规的供皮肤外用的制剂，例如为美白、抗氧化或抗衰老化妆品。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1）本发明的细梗蔷薇愈伤组织培养基通过添加维生素C、烟酰胺、传明酸、羟丙基四氢吡喃三醇，四种成分的协同配合，相比现有的培养基，可以提高促进细梗蔷薇愈伤组织细胞的增殖，且培养获得的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中的有效成分含量、细胞提取物对皮肤细胞氧化损伤的保护显著提高，具有良好的皮肤抗氧化功效。
2）进一步地，本发明的细梗蔷薇愈伤组织培养基培养获得的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物还可提升对促进皮肤细胞（HaCat细胞和FB细胞）增殖、抑制酪氨酸酶等方面的作用，对促进皮肤细胞再生、抗衰老、美白等方面具有良好的应用前景。
实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，各原料来源如下：
细梗蔷薇愈伤组织细胞：
取无菌的细梗蔷薇（Rosa. gracififlora）小苗的叶片，剪成长宽约0.8 mm 的小方块正面朝上接种到配方为1/2MS+6-BA0.2mg/L+α-NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L培养基中，诱导出其愈伤组织。后续根据需要取适量的愈伤组织细胞以供后续实验。
MS培养基配方如下表a所示：
表a
冰川水取自喜马拉雅山脉中段北坡，海拔5128米的日喀则岗巴县曲登尼玛冰川。
下述实施例中，培养基A的成分为：MS +2,4-D3.0 mg/L+KT0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L。
下述实施例中，羟丙基四氢吡喃三醇的含量中的%是指羟丙基四氢吡喃三醇的质量占整个培养基的质量百分比。
以下实施例和对比例中，培养基的制备方法如下：取试剂MS培养基，2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），激动素（KT），蔗糖，琼脂，冰川水，按照配方MS、2,4-D 3.0 mg/L、KT0.5 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L配制成培养基后，调节pH 5.8左右，在灭菌锅内121℃灭菌20 min备用，待培养基温度降至65度以下在培养基中添加其他成分。
实施例
培养基成分如下：培养基A、维生素C 10mg/L、烟酰胺 10mg/L、羟丙基四氢吡喃三醇 0.002%、传明酸20 mg/L。
实施例
培养基成分如下：培养基A、维生素C 1mg/L、烟酰胺 1mg/L、羟丙基四氢吡喃三醇0.002%、传明酸1mg/L。
实施例
培养基成分如下：培养基A、维生素C 20mg/L、烟酰胺20mg/L、羟丙基四氢吡喃三醇0.005%、传明酸20mg/L。
实施例
培养基成分如下：培养基A、维生素C 50mg/L、烟酰胺 50mg/L、羟丙基四氢吡喃三醇 0.01%、传明酸100mg/L。
实施例5：在培养基A上添加维生素C 10mg/L
实施例6：在培养基A上添加维生素C 50mg/L
实施例7：在培养基A上添加维生素C 100mg/L
实施例8：在培养基A上添加维生素C 1000mg/L
实施例9：在培养基A上添加烟酰胺 10mg/L
实施例10：在培养基A上添加烟酰胺 50mg/L
实施例11：在培养基A上添加烟酰胺 100mg/L
实施例12：在培养基A上添加烟酰胺 1000mg/L
实施例13：在培养基A上添加传明酸 1mg/L
实施例14：在培养基A上添加传明酸 10mg/L
实施例15：在培养基A上添加传明酸 100mg/L
实施例16：在培养基A上添加传明酸 1000mg/L
实施例17：在培养基A上添加羟丙基四氢吡喃三醇 0.01%
实施例18：在培养基A上添加羟丙基四氢吡喃三醇 0.1%
实施例19：在培养基A上添加羟丙基四氢吡喃三醇 1%
效果实施例1细梗蔷薇愈伤组织细胞的培养及不同培养基对细梗蔷薇愈伤组织细胞增殖的效果
细梗蔷薇愈伤组织细胞的培养：取按照上述实施例和对比例的成分制备好的培养基，每个处理3个平行，每个培养瓶的培养基体积为50 mL，在培养瓶内接种0.5g左右细梗蔷薇愈伤组织细胞，培养条件为温度20±1℃，湿度60%~75%，光照强度1500 Lx ~ 2000Lx，每天光照12小时，培养时间为20天。
由表1结果可知，通过添加适当浓度的活性成分，可以明显促进细梗蔷薇细胞的增殖，其中以实施例1-4、实施例6、实施例10、实施例15、实施例17促进增殖效果最佳。因此选择这8个培养基进行下一步研究。
表1不同培养基培养的细梗蔷薇细胞的增殖倍数
效果实施例2不同培养基获得的细梗蔷薇细胞的提取物
取由上述效果实施例1中培养后获得的新鲜细梗蔷薇细胞（1.5-2.0g），准确称量，研磨机研磨破碎(60Hz，60s*2次)，然后加入10倍体积去离子水，500W超声提取30min，5000rmp离心30min，取上清，0.45μM过滤，得到细梗蔷薇细胞提取物。
1.不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物中固含量的测定
取一定体积提取液烘干后称重测定其固含量（见表2）。由表2结果可知添加了活性成分的培养基均可以促进细梗蔷薇细胞的物质积累。
表2 不同组合细梗蔷薇细胞提取物的提取产率
2. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物中多酚含量的测定
总多酚含量用Folin-Ciocalteu方法，以没食子酸为对照品进行检测。取0.1 mL没食子酸标准液和待测样品溶液，平行3次，加入0.5 mL 10% Folin-Ciocalteu试剂，混合，室温放置5min后加入0.4 mL 7.5%NaCO3溶液，混合后室温放置60 min，测定765nm 的OD值。由标准液各管OD520对没食子含量作标准曲线，根据标准曲线计算样品中多酚含量（见表3）。
由表3结果可知实施例6、10、17可以促进细梗蔷薇细胞的多酚物质合成。
表3 细梗蔷薇细胞提取物中的多酚含量
3. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物中Vc含量
采用LS50B荧光检测器((SNF/仪器设备-106-2001)对细梗蔷薇细胞提取物中Vc含量进行测定。
表4 细梗蔷薇细胞提取物中的Vc含量
4. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物中烟酰胺含量
烟酰胺含量的测定采用高效液相色谱法，测定方法参照林毅侃，顾宇翔，王承平等人高效液相色谱法测定化妆品中烟酰胺的含量，《香料香精化妆品》，2015，003（29-32）。
表5 细梗蔷薇细胞提取物中的烟酰胺含量
5. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物中传明酸含量
传明酸含量的测定参照唐毓萍，唐欣等人，高效液相色谱法测定化妆品中氨甲环酸的含量，《日用化学工业》，2018，1（57-60）。
表6 细梗蔷薇细胞提取物中的传明酸含量
效果实施例3
1. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物对自由基清除率的影响
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一种稳定的氮中心有机自由基。DPPH法于1958年被提出，广泛用于地量测定生物试样、分类物质和食品的抗衰老能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的抗衰老能力。
取提取物样品溶液0.1mL 加入试管中，再加入0.1mL DPPH乙醇溶液，混匀，室温下避光在黑暗处反应 30min，在 525nm 处测定OD值，按照下面公式计算清除率：清除率 I(％) ＝ [1-(T-T0)/(C-C0)]×100％，式中： T0：0.1mL样品液加 0.1mL 95％乙醇的吸光度；T：0.1mL 样品液加0.1 mLDPPH 溶液的吸光度；C0：0.1mL 水加 0.1mL 95％乙醇的吸光度；C：0.1mL 水加0.1 mL DPPH 溶液的吸光度。
由表7结果可知与对照组相比，实施例1-4、实施例6、10、15、17的细梗蔷薇细胞提取物的DPPH清除率均较低。
表7 不同细梗蔷薇细胞提取物的DPPH清除率
2. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物对皮肤细胞增殖的影响
角质细胞是表皮层中最主要的细胞，参与形成皮肤的物理屏障，防止物理、化学性及微生物等不良因素的侵袭，对皮肤起保护作用。皮肤衰老后的一个主要特征就是表皮变薄，伤口愈合速度变慢，这主要是由于表皮层中角质细胞的再生能力下降，角质细胞体系的增殖能力降低所导致。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一。它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的皮肤。
制备的样品用去离子水配制成溶液，加入到人永生化表皮HaCat细胞或者人原代成纤维细胞（FB）培养液中，以不含样品的溶剂为空白对照。培养48小时后，用MTT法对细胞染色后，用酶标仪测定550nm处吸光度，空白对照的增殖率为100%，参比空白对照，评估对HaCat或者FB细胞增殖的影响。
由表8结果可知以下组合培养基培养获得的细梗蔷薇细胞提取物对皮肤细胞表皮HaCat细胞和成纤维细胞都有一定的增殖促进作用，且实施例1、3和实施例10、15、17的促进作用强于培养基A组，实施例1的促进效果最好。
表8 不同组合细梗蔷薇细胞提取物对皮肤细胞增殖的影响
3. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物对皮肤细胞氧化损伤的保护作用
自由基可以从细胞水平、分子水平乃至组织器官水平上对机体造成各种不可逆性的氧化性损伤，加速生物体细胞乃至整个机体的衰老进程，诱发各种与衰老相关的疾病。过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)是细胞内一种重要的氧自由基，对人体皮肤细胞能造成直接的氧化应激反应和氧化应激所致的氧化性损伤。在体外利用H2O2能够诱导并加速细胞因氧化应激所致的衰老进程，模拟体内氧化损伤的病理过程。
人永生化表皮HaCat细胞或者人原代成纤维细胞（FB），种入96孔板中，培养24h后加入含药物和H2O2（1mM）培养基中再培养24h，用MTT法检测细胞活力。用没有加H2O2处理的做为空白对照组，空白对照的细胞活力为100%，参比空白对照，评估H2O2以及样品处理对细胞活力的影响。
由表9结果可知细梗蔷薇细胞提取物对双氧水造成的细胞氧化损伤有明显的保护作用，在HaCaT细胞模型中，实施例1-4的细胞提取物对双氧水造成的细胞氧化损伤有明显的保护作用，且保护作用强于培养基A组。在两种细胞氧化损伤模型中，四种功效成分组合的保护效果最好。结合DPPH清除实验结果，对照组清除率高于实验组，推测在培养基中添加其他功效成分培养的细梗蔷薇细胞提取物可能与培养基A组有不同的抗氧化途径。
表9 不同组合细梗蔷薇细胞提取物对皮肤氧化损伤的保护作用
4. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物的紫外损伤保护作用
皮肤的衰老分为内源性老化和外源性老化，日光尤其是紫外线(ultraviolet UV)照射是外源性老化形成的主要因素,所以外源性老化又称为光老化。与皮肤光老化有关的主要是UVA（320nm-400nm）和少量的UVB（280-320nm）。许多资料表明照射到皮肤的紫外线95%是由角质形成细胞吸收,皮肤暴露于UVA辐射下会产生ROS并导致氧化应激在内的不同损伤。紫外线UVB则会直接作用于表皮细胞，通过诱导氧化应激、炎症过程进而影响皮肤屏障功能，形成光损伤。因此我们用UVA/UVB照射真皮成纤维细胞Fibroblast细胞建立皮肤的光损伤模型，利用该模型评估活性物对皮肤紫外损伤的保护作用。
人永生化表皮HaCat细胞或者人原代成纤维细胞（FB），种入96孔板中，37℃的5%CO2细胞培养箱中培养24h。然后加入含药物或者溶剂对照的全培养基中培养24h。将培养基换成PBS后进行UVA/UVB辐照，剂量为10J/cm2或40J/cm2。去掉PBS后加入含有待测样品的培养基继续培养24小时，用MTT法检测细胞活力。用没有UVA/UVB辐照组做为空白对照组（UVA-/UVB-），UVA/UVB辐照组作为对照组(UVA+/UVB+)。空白对照的细胞活力为100%，参比空白对照，评估UVA/UVB以及样品处理对细胞活力的影响。
由表10-1结果可知，以下不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物对UVA造成的细胞损伤弱于培养基A组，对UVA无明显的保护作用。
表10 -1细梗蔷薇细胞提取物对皮肤UVA损伤的保护作用
| 样品 | 测试浓度（mg/mL） | HaCaT细胞活力（%） | FB细胞活力（%） |
| 空白对照组 | - | 100 | 100 |
| UVA处理组 | - | 68 | 61 |
| 培养基A细胞提取物 | 0.5 | 59 | 62 |
| 实施例1细胞提取物 | 0.5 | 63 | 59 |
| 实施例2细胞提取物 | 0.5 | 60 | 60 |
| 实施例3细胞提取物 | 0.5 | 58 | 54 |
| 实施例4细胞提取物 | 0.5 | 61 | 56 |
| 实施例6细胞提取物 | 0.5 | 60 | 62 |
| 实施例10细胞提取物 | 0.5 | 56 | 58 |
| 实施例15细胞提取物 | 0.5 | 53 | 51 |
| 实施例17细胞提取物 | 0.5 | 57 | 50 |
由表10-2结果可知，细梗蔷薇细胞提取物对UVB造成的细胞损伤有明显的保护作用，实施例6、10的细胞提取物保护作用显著强于培养基A组。
表10-2不同细梗蔷薇细胞对皮肤UVB损伤的保护作用
| 样品 | 测试浓度（mg/mL） | HaCaT细胞活力（%） | FB细胞活力（%） |
| 空白对照组 | - | 100 | 100 |
| UVB处理组 | - | 73 | 78 |
| 培养基A-细胞提取物 | 0.5 | 85 | 90 |
| 实施例1-细胞提取物 | 0.5 | 85 | 86 |
| 实施例2-细胞提取物 | 0.5 | 83 | 88 |
| 实施例3-细胞提取物 | 0.5 | 86 | 83 |
| 实施例4-细胞提取物 | 0.5 | 84 | 85 |
| 实施例6-细胞提取物 | 0.5 | 97 | 98 |
| 实施例10-细胞提取物 | 0.5 | 93 | 91 |
| 实施例15-细胞提取物 | 0.5 | 83 | 86 |
| 实施例17-细胞提取物 | 0.5 | 82 | 85 |
5. 不同组合培养基获得的细梗蔷薇细胞提取物的美白作用
近年的研究证明色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶，产生色素所引起的。人表皮中位于基底层的黑素细胞与周围的角质形成细胞接触并发生联系，构成“表皮黑素单元”，其中黑素是一种含氮的复合物, 在黑素小体中进行合成。一般来讲，黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴，多巴醌，经非酶氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。
皮肤的颜色来自于角质形成细胞内存储的黑色素。一般来讲，存储黑色素多的人肤色更深，也更受到保护，远离阳光辐射。黑色素数量和质量在皮肤黑色素是决定皮肤颜色的重要因素。酪氨酸酶是结构复杂的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。在人体中酪氨酸酶是皮肤合成黑色素的关键酶。
采用L-Dopa氧化法测定样品对酪氨酸酶的抑制作用。小鼠黑色素瘤B16细胞，种入96孔板中，经24h后，加入含药的完全培养基培养48h，用PBS洗2遍，加入1%TritonX-100 (inPBS)，迅速置-80度冰箱放置30min。室温或者37度下融化，裂解细胞，震荡混匀。加入0.2%多巴水溶液震荡混匀，37度反应3h，测OD490nm。按如下公式计算酶活力：酪氨酸酶抑制率=[1-(实验组OD值/对照组OD值]×100%。用没有添加提取物组作为空白对照组。参比空白对照，评估样品处理对酪氨酸酶活力的影响。
由表11结果可知实施例1、实施例17的细梗蔷薇细胞提取物对小鼠黑色素瘤B16细胞酪氨酸酶活力有抑制作用，且抑制作用强于培养基A组。
表11 不同细梗蔷薇细胞提取物对小鼠黑色素瘤B16细胞酪氨酸酶活力的影响
| 样品 | 测试浓度(mg/mL) | 酪氨酸酶抑制率（%） |
| 空白对照组 | - | 0 |
| 培养基A-细胞提取物 | 0.5 | 20 |
| 实施例1细胞提取物 | 0.5 | 28 |
| 实施例2-细胞提取物 | 0.5 | 21 |
| 实施例3-细胞提取物 | 0.5 | 25 |
| 实施例4-细胞提取物 | 0.5 | 22 |
| 实施例6-细胞提取物 | 0.5 | 10 |
| 实施例10细胞提取物 | 0.5 | 17 |
| 实施例15细胞提取物 | 0.5 | 22 |
| 实施例17细胞提取物 | 0.5 | 29 |
综合以上结果可见，相比培养基A，实施例1-4在抗HaCaT皮肤细胞和FB皮肤细胞氧化损伤方面均有显著提升，而实施例5-19则无法同时对抗HaCaT、FB皮肤细胞氧化损伤方面有提升。其中实施例1在促进细梗蔷薇细胞增殖优于培养基A，且其细梗蔷薇提取物在促进HaCaT、FB皮肤细胞增殖、抗氧化损伤、抑制酪氨酸酶活力等功效方面均同时相比培养基A显著提升，而在对HaCaT细胞抗UVA方面稍有提升。
Claims (7)
1.一种细梗蔷薇愈伤组织培养基，其特征在于，其包括以下组分：植物组织培养的基础培养基、维生素C45~55mg/L；
所述维生素C的浓度较佳地为 50mg/L；
较佳地，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基由以下组分组成：植物组织培养的基础培养基、维生素C45~55mg/L；其中，所述维生素C在所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的浓度更佳地为50mg/L。
2.一种细梗蔷薇愈伤组织培养基的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将如权利要求1所述的细梗蔷薇愈伤组织培养基中的各组分混合，即可。
3.如权利要求2所述的细梗蔷薇愈伤组织培养基的制备方法，其特征在于，所述细梗蔷薇愈伤组织培养基的制备方法还包括杀菌步骤，例如高温灭菌；
较佳地还包括在高温灭菌后，待温度降低至65℃以下之后，再添加所述维生素C。
4.一种细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物，其特征在于，其由对培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞进行提取得到，所述培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞是由如权利要求1中任一项所述的细梗蔷薇愈伤组织培养基对细梗蔷薇愈伤组织进行培养得到。
5.如权利要求4所述的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物，其特征在于，所述培养的条件为：温度20±1℃，湿度60%~75%，光照强度1500 Lx ~ 2000Lx，每天光照12小时；
和/或，所述培养的时间为20天；
和/或，所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的固含量为3~5 mg/mL，所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的固含量是指将细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物进行烘干后剩余部分的质量占细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物总质量的质量百分数；
和/或，所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中多酚的含量为3.0~4.5%，例如3.4、3.5、4.0或4.1%；所述多酚的含量是指多酚占细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的质量百分比；
和/或，所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中Vc的含量为1~2mg/kg，例如1.1、1.2、1.5或1.7mg/kg，所述Vc的含量为以细胞湿重计每1kg的所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物中Vc的质量；
和/或，所述提取的方法为超声提取；较佳地，包括如下步骤：取新鲜的所述培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞，研磨，加入适量水后，超声、离心、取上清液，过滤，得到所述细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物；
其中，所述研磨的速率较佳地为50~70 Hz，例如60Hz；所述研磨的时间较佳地为50~70s，例如60s；所述研磨的次数较佳地为1~3次，例如2次；
其中，所述水为去离子水，所述水的体积为新鲜的所述培养后的细梗蔷薇愈伤组织细胞的10倍；
所述超声提取的功率较佳地为500W；所述超声提取的时间较佳地为30min；
所述离心的速率较佳地为5000 rmp；所述离心的时间较佳地为30min；
所述过滤中使用的过滤膜的孔尺寸较佳地为0.45 μM。
6.如权利要求5所述的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物，其特征在于，
细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物的固含量为3.0~4.5 mg/mL，例如3.26、3.77、3.98或4.07mg/mL。
7.一种细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物在制备皮肤外用剂中的应用，其特征在于，如权利要求4-6所述的细梗蔷薇愈伤组织细胞提取物作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、抗衰老活性成分或美白活性成分；
所述皮肤外用剂较佳地为美白、抗氧化或抗衰老化妆品。
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