KR101223654B1 - 미생물에 의한 골담초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물에 의한 골담초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로 골담초에 효모 또는 유산균, 곰팡이를 첨가, 배양하여 수득한 골담초 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 화장료 조성물은 피부에 자극이 없고 안전하여 피부질환 유발 문제가 없으며, 타이로시나아제의 활성을 억제하여 미백 효과를 나타낼 뿐 아니라, 항산화 효과를 나타내 피부 노화 방지 화장료 조성물로 사용할 수 있다.

Description

미생물에 의한 골담초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 {A Manufacturing Method and cosmetic composition containing the fermented extract of Caragana sinica Rehder}

본 발명은 특정 미생물에 의한 골담초 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부에 자극이 없고 안전하여 피부질환 유발 문제가 없으며, 타이로시나아제의 활성을 억제하여 미백 효과를 나타낼 뿐 아니라, 항산화 효과를 나타내는 피부 노화 방지 화장료 조성물에 관련된다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 일상생활에서 햇빛 노출에 의한 자외선 조사, 황사나 자동차 매연 등에 의한 대기 오염 물질 및 각종 세균 등에 노출되어 피부 트러블 및 자극이 유발되며 이로 인해 정상적인 피부 노화를 가속화시키게 된다. 이러한 피부 노화는 피부 외관상으로 피부의 탄력을 저하시켜 주름을 형성하거나 기미 및 노인성 반점을 형성하여 피부의 색소 침착을 유발하게 된다.

일반적으로 피부 노화는 체세포 돌연변이, 자유 라디칼의 과도한 생성, 자가면역반응, 독성물질의 축적, 유전자 복제중 발생된 에러, 진피구성 단백질의 변형 등 (M. Rieger, Cosmetics & toiletries, 110, 94, 1994) 여러 가지 학설이 제기되고 있으며, 이 중에서 노화 (aging)와 성인병과 같은 각종 질환의 원인이 활성산소종 (reactive oxygen species)에 기인된다는 학설이 인정받음에 따라 산소나 질소로부터 유래되는 활성 산소종을 조절할 수 있는 천연 항산화제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 보통 유해산소로 알려져 있는 활성 산소종은 가장 안정한 형태인 삼중항 산소 (³O₂)가 환원되면서 과산화물 음이온 라디칼 (O₂ ^-·), 과산화수소 (H₂O₂), 히드록시 라디칼 (·OH), 과산화지질 (ROOH)이나 여기서 발생되는 자유 라디칼 (ROO·, RO·) 등의 과산화지질로서, 체내에는 이러한 활성산소종이 정상적인 상태에서도 발생을 하지만 항산화 효소인 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 (superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제 (catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제 (glutathion peroxidase, GPx) 등이 존재하여 과도한 활성 산소종의 생성을 억제하고 있다. 그러나, 이러한 활성산소종이 스트레스 및 외부 환경적인 요인에 의해 비정상적으로 과도하게 발생이 되어 소거되지 않고 체내에 존재하게 되면 자유 라디칼로 인한 산화적 스트레스 (oxidative stress)가 생체에 가해져 DNA, RNA, 단백질, 세포막 및 세포구조 손상, 암, 조직 손상, 노화 등을 유발한다고 추측된다.

현대에 급증하는 다양한 질병 및 노화의 가속화를 억제하기 위하여 이러한 활성산소종을 조절하거나 제거할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 대표적으로, 천연 항산화제인 토코페롤, 아스코르빈산, 카로테노이드, 플라보노이드, 글루타치온 등에 대한 효능 연구 및 이들의 안정화 기술에 대한 연구와 합성 항산화제인 부틸화된 히드록시 톨루엔 (BHT), 부틸화된 히드록시 아니졸 (BHA) 등 다양한 항산화제가 알려져 있고, 그 외 많은 항산화제에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있다. (E. A. Lissi et al. Free Radic. Biol. Med, 18(2), 153, 1995) (A. Ghiselli et al. Free Radic. Biol. Med, 18(1), 29, 1995) 이들 항산화제 중 토코페롤은 항산화 효과가 비교적 낮은 편이고, 효과가 우수한 BHA, BHT 등의 합성 항산화제가 의약품 및 식품분야 등에서 활용되고 있으나, 돌연변이원성 및 독성에 대한 지적이 있으며 아스코르빈산의 경우에는 안정성이 확보된 유도체 및 제형 개발이 진행되고 있어, 더욱 안정하고 효과가 우수한 천연 항산화 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다.

또한, 노화의 특징 중 하나인 노인성 반점의 경우에는 멜라닌 생합성과 연관되어 있으며, 자외선 노출에 의한 피부 흑화 현상 또한 노화를 가속화 시키는 원인으로 작용한다. 멜라닌 생합성은 멜라노사이트(melanocyte)의 멜라노좀 (melanosome)에서 합성되며, 멜라노좀에는 멜라닌을 합성하는데 필요한 특이적인 효소들을 함유하고 있다. 멜라노사이트는 외부 신호전달 물질 및 호르몬 수용체를 지니고 있어 자외선 등의 외부 조건이나 알파-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH) 등의 호르몬, 엔도테린(endotherin)과 같은 사이토카인(cytokine)과 멜라닌 합성에 필요한 특이적 효소인 타이로시나아제, 타이로시나아제 관련 단백질-1(TRP-1), 도파크롬 토토머라아제(dopachrome tautomerase (DCT, TRP-2)) 등의 효소가 활성화되어 멜라닌을 형성한다. 이 중 타이로시나아제는 멜라닌 합성의 속도결정 단계에 작용하는 효소 (C. Jimenez- Cervantes et al. J. Biol. Chem., 269, 17993, 1994)로서 타이로신을 DOPA(3,4-디히드록시페닐알라닌)로 전환하는 타이로신 히드록시라아제 활성과 DOPA를 도파-퀴논으로 산화하는 DOPA 옥시다아제 활성을 모두 가지고 있다. TRP-1은 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산 (DHICA)로 산화하는 효소이다. DCT는 초기에는 TRP-2로 불려졌던 효소로서 도파크롬을 DHICA로 이성화시키는 효소이다. 이 중, 멜라닌을 합성하는 핵심 효소로 타이로시나아제가 관여하며 TRP-1, DCT의 경우에는 페노멜라닌보다 유멜라닌 합성에 더 많이 관여하는 것으로 알려져 있다 (V. J. Hearing et al. J. Invest. Dermatol., 4, 24, 1999).

미백의 유효성분은 멜라닌 색소의 생산을 돕는 타이로시나아제에 직접 작용하여 멜라닌 색소의 생산을 억제하는 성분과 주로 생성된 멜라닌을 환원시키는 성분 등이 사용된다. 타이로시나아제에 대한 억제 효능 성분으로는 코직산, 알부틴 및 엘라그산, 히드로퀴논 등이 있으며 생성된 멜라닌을 환원시키는 소재로는 ㅌ태태반 추출물, 아스코르브산 등의 성분이 사용되는 경우가 많다. 그러나 강력한 멜라닌 생합성 저해활성을 보이는 소재 대부분이 정상세포 및 멜라노사이트의 변성 또는 치사를 일으키고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 발생시킨다는 문제가 있다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 최근 각광받고 있는 식물화학물질(phytochemical) 중에서 상대적으로 독성이 낮고 안전하며 피부에 유효한 효능을 나타내는 추출물을 이용한 화장료 조성물에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으나 일반적인 추출 방법에 의해 수득된 성분은 그 효과가 미미한 한계점을 나타내어 효능을 극대화시킨 소재의 개발이 요구되고 있다.

한편, 발효를 통한 천연 추출물의 경우에는 인체에 유해한 유기용매를 사용하지 않고 천연물 내에 존재하는 당 성분을 미생물의 대사과정에서 탄소원으로 사용되어 알코올로 전환시키게 되므로, 천연물 내의 유효성분 특히, 플라보노이드, 폴리페놀, 카테킨 등은 당화되어 안정한 화합물로 존재하게 되어 있어 발효를 통해 유효성분 함량 추출율을 증가시키고 당이 배제되어 활성화된 유효성분에 의해 우수한 피부 효능이 기대되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하여 비자극성이고 피부질환 유발에 문제가 없으며 항산화, 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하여 항산화 효과 및 미백 효과를 나타내는 피부 노화방지 화장료 조성물로 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 골담초에 효모 또는 유산균, 곰팡이를 첨가 배양하여 수득한 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 효능 및 미백 효과에 의한 노화 방지 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 골담초를 효모 또는 유산균, 곰팡이를 첨가, 배양하여 발효시켜 수득한 골담초 발효액 추출물을 화장료 조성물에 적용한 결과, 골담초 내에 존재하는 배당체 형태의 플라보노이드, 카테킨, 폴리페놀 등의 유효성분 함량 추출율이 현저히 높아지고, 이에 따른 항산화 및 피부 미백 효능이 탁월해지는 한편, 피부에 자극을 유발하지 않는 안전성을 확보하여 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 사용되는 골담초 발효 추출물의 제조와 관련하여 골담초에 효모 또는 유산균, 곰팡이를 첨가, 배양하여 발효시킴으로써 수득할 수 있다.

발효물 제조시, 효모는 사카로마이세스 (Saccharomyces sp .), 스키조사카로마이세스 (Schizosacchromyces sp .), 칸디다 (Candida sp .) 등의 미생물을 사용할 수 있다. 또한, 유산균으로는 락토바실러스 (Lactobacillus sp.), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus sp.), 류코노스톡 (Leuconostoc sp.), 또는 비피도박테리아 (Bifidobacteria sp.) 등이 있으며, 곰팡이는 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) 등의 미생물을 사용할 수 있다.

골담초(Caragana sinica Rehder)는 골담초 또는 기타 동속 근연식물의 뿌리를 기원으로 하며 한국 (경상북도, 경기도, 강원도, 황해도), 중국 등지에 분포하며 산지에서 자라는 콩과 식물이다. 높이는 약 2m이며 위쪽을 향한 가지는 사방으로 퍼진다. 줄기는 회갈색으로 가시가 뭉쳐나고 5개의 능선이 있다. 잎은 어긋나고 홀수 1회깃꼴겹잎이며 작은 잎은 4개로 타원형이다. 꽃은 5월에 1개씩 총상꽃차례로 피며 길이는 2.5~ 3cm이고 나비 모양이다. 꽃받침은 종 모양으로 위쪽 절반은 황적색이고 아래쪽 절반은 연한 노란색이다. 꽃자루는 길이가 약 1cm이며 열매는 협과로 원기둥 모양이고 털이 없으며 9월에 익는다. 길이는 3~3.5cm이며 비슷한 종으로 작은 잎의 길이가 8~17cm인 것을 반용골담초 (var. megalantha), 작은 잎이 12~ 18cm인 것을 좀골담초 (C. microphylla)라고 한다. 잎과 가지에 플라보노이드, 껍질에 알칼로이드, 여물지 않은 열매에 이노시톨 등이 있으며 카라페놀 A (레스베라트롤 삼량체), (+)-이소암펠옵슨(Isoampelopson) F (레스베라트롤 이량체), 카라페놀 B (레스베라트롤 이량체), 카라페놀 C (레스베라트롤 이량체) 등의 올리고스틸벤류를 함유하고 있는 것으로 보고되고 있다 (Hong-Feng Luo et al., Tetrahedron, 57, 4849, 2001). 주요 효능으로는 강장, 이뇨, 류마티즘, 관절염, 대하증, 요통, 급성유선염, 이명 등에 사용이 되어왔으며 이름에서도 알 수 있듯이 뼈와 신경통에 효능이 있다고 알려져 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 골담초 발효 추출물은, 골담초 분쇄물에 효모 또는 유산균, 곰팡이를 첨가, 배양 발효시켜 수득할 수 있으며 이때, 골담초는 기본 배지에 5 내지 30 중량% 범위로 포함되는 것이 바람직하다.

구체적으로, 미생물로 효모를 사용할 경우에는 골담초 분말이 함유된 배지에 일정한 농도 (약 10⁵~ 10⁷ CFU/ml)로 효모를 접종하여 pH 5.5~ 6.5, 온도 25~ 35℃, 배양 시간은 48~ 120시간의 조건을 유지하면서 배양한 후, 이 발효물을 이용하여 최종 골담초 발효 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 미생물로 유산균을 사용할 경우에는 골담초 분말이 함유된 배지에 일정한 농도(약 10⁵~ 10⁷ CFU/ml)로 유산균을 접종하여 pH 6.5~ 7.5, 온도 32~ 38℃, 배양 시간은 24 내지 72시간의 조건을 유지하면서 배양한 후, 이 발효물을 이용하여 최종 골담초 발효 추출물을 수득할 수 있다.

미생물로 곰팡이를 사용할 경우에는 골담초 분말이 함유된 배지에 일정한 농도 (약 10⁵~ 10⁷ CFU/ml)로 곰팡이를 접종하여 pH 5.5~ 6.5, 온도 25~ 35℃, 배양 시간은 72 내지 120시간의 조건을 유지하면서 배양한 후, 이 발효물을 이용하여 최종 골담초 발효 추출물을 수득할 수 있다.

이 발효물로부터 유효성분의 추출은 통상의 추출 용매, 예를 들어 물이나, 알코올 등의 유기 용매를 사용하여 행할 수 있으며, 바람직하게는 예를 들어 물 또는 에탄올, 또는 그 혼합용매를 사용하여 행해질 수 있다.

상기와 같이 수득한 골담초 발효 추출물은 본 발명의 노화 방지 화장료 조성물에 0.1 내지 90 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량% 범위로 포함될 수 있다. 그 함량이 1 중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부 효과를 기대하기 어렵고, 80 중량%보다 높으면 화장료 제형 및 제조에 문제가 있다.

본 발명에 따라 골담초 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 효를 함유하는 노화 방지 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤, 마스크팩 등의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 노화 방지 화장료 조성물은 위에 기재된 제형 이외에도 일반 피부 화장료에 배합될 수 있으며 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 또는 향료 등을 필요에 따라 각각의 제형에 적절히 배합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하여 비자극성이고 피부질환 유발에 문제가 없으며 항산화, 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하여 항산화 효과 및 미백 효과를 나타내는 피부 노화방지 화장료 조성물로 제형상의 안정성이 확보된 화장품의 모든 형태로 첨가하여 사용할 수 있다.

도 1은 레스베라트롤 표준품의 정량곡선

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니며, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예

실시예 1. 골담초 발효 추출물 제조

건조된 골담초를 세절한 후 다시 분쇄하여 분말 상으로 수득하였다. 수득한 골담초 분말을 1.2L의 기본 배지에 30 중량%가 되도록 첨가하여 pH를 5.5~ 6.5로 조절하였으며 상온에서 2시간 정치하여 충분히 함습될 수 있도록 한다.

상기 골담초 분말이 함유된 배지에 Saccharomyces cerevisiae KCTC7913 (분양처: 한국생명공학연구원 생물자원센터)를 10⁶CFU/ml로 접종하고 pH 5.5~ 6.5, 온도 23~ 28℃의 조건을 유지하면서 72 시간 동안 배양하면서 24시간 간격으로 발효물을 섞어주었다. 발효에 사용한 미생물인 Saccharomyces cerevisiae KCTC7913는 접종 24시간 전에 35℃에서 액체배양하여 준비하였으며, 이를 희석하여 발효의 접종균으로 사용하였다.

상기 발효물에 70% 에탄올을 발효물의 중량 대비 5~ 30배로 첨가, 바람직하게는 10~ 20배로 첨가하여 발효물 내의 유효성분을 추출하고 1㎛ pore size의 paper filter를 이용하여 고분자 침전물 및 균체를 제거하여 최종 골담초 발효 추출물을 수득하였다.

비교예 1. 골담초 추출물 제조

위 실시예 1과 같은 중량의 골담초를 건조 및 세절한 후, 추출 용매로 70% 에탄올을 넣어 골담초 추출물이 5 중량%가 되도록 하였다. 이를 상기 실시예 1과 같은 방법으로 추출, 여과하여 최종 골담초 추출물을 제조하였다.

시험예 1. 자유라디칼 소거능

실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물에 대한 자유라디칼 소거능을 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질 (DPPH) 방법을 변형하여 측정하였다. (Blois, M. S. nature 181, 1190, 1958). 보통의 라디칼은 반응성이 강하여 불안정한 반면, DPPH 라디칼은 비교적 안정한 자유라디칼로, 라디칼 상태로 존재시 517nm에서 흡광을 통해 측정이 가능하다. DPPH는 0.1mM의 농도로 메틸 알코올에 녹여 사용하였다.

실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물, 비교예 1에서 제조한 골담초 추출물 및 BHT (butylated hydroxytoluene)를 24 웰 플레이트의 각 웰에 500㎕씩 넣은 후, DPPH 용액을 100㎕씩 첨가하여 상온에서 30분간 방치한 후 ELISA reader (VICTOR3, Perkin Elmer)를 이용하여 565nm에서 흡광을 측정하였다. 이때 대조군으로는 추출물 대신 메틸 알코올을 사용하였다.

상기 실험군과 대조군에 대한 흡광을 측정 후, 자유라디칼 소거효능을 환산하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

자유라디칼 소거활성 (%) = (1-실험군 흡광도/대조군 흡광도)X100

시료농도 (%, w/v)	비교예 1(0.05%)	실시예 1(0.05%)	BHT(0.005%)
자유라디칼 소거율 (%)	83.78	42.21	97.92

위 표 1에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물은 비교예 1의 골담초 추출물과 비교하여 자유라디칼 소거능이 현저히 우수함을 확인할 수 있다.

시험예 2. 추출물의 레스베라트롤 성분 변화 분석

상기 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물은 비교예 1에서 제조한 골담초 추출물에 비하여 미생물의 발효를 통해 폴리페놀, 플라보노이드 성분이 분해되어 추출율이 증가되었을 것을 가정하여 골담초 내에 함유되어 있는 것으로 보고되어 있는 레스베라트롤을 HPLC 기기를 이용하여 분석하였다. HPLC 기기분석 조건은 하기 표 2와 같다.

	분석 조건
기기분석-HPLC (액체크로마토그래피)	컬럼	Agilent Eclipse plus C18 (5㎛, 4.6mm id x 250 mm)
	검출기	UV/VIS Spectrophotometer (306nm)
	유속	1.0ml/min
	컬럼온도	40℃
	주입부피	20㎕
	이동상	아세토니트릴

	비교예 1	실시예 1
레스베라트롤 (ppm)	830±100	1333±100

도 1에는 레스베라트롤 표준품의 정량곡선을 나타내었다. 이를 토대로 하여, 상기 표 3의 결과와 같이 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물은 비교예 1의 골담초 추출물과 비교하여 레스베라트롤의 추출율이 증가함을 확인할 수 있었다.

시험예 3. 세포 독성 평가

실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물의 세포 독성을 측정하기 위하여 쥐 유래의 멜라닌 세포 (mouse melanocyte)를 96 웰 플레이트에 10⁵ cells/ml의 농도로 접종하고 배양한 후, 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물 및 비교예 1에서 제조한 골담초 추출물을 무혈청 배지를 이용하여 각각 10, 20, 50, 100, 200㎍/ml의 농도로 희석한 후, 1일간 적용하였다. MTT 시약을 이용하여 세포의 생존율을 평가하였다. 이때, 대조군으로는 무혈청 배지를 사용하였다.

구분		세포 생존율 (%)
대조군 (무혈청 배지)		100±1.5
비교예 1	10 ㎍/ml	114.4±2.1
	20 ㎍/ml	105.9±4.9
	50 ㎍/ml	94.4±1.0
	100 ㎍/ml	82.0±3.3
	200 ㎍/ml	71.0±4.0
실시예 1	10 ㎍/ml	106.3±2.7
	20 ㎍/ml	107.8±2.8
	50 ㎍/ml	107.7±10.1
	100 ㎍/ml	106.5±4.3
	200 ㎍/ml	95.7±1.7

상기 표 4의 결과로 비교예 1에서 제조한 골담초 추출물에 대비하여 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물의 세포 생존율이 높게 나타나는 것으로 보아 세포에 독성을 미칠 수 있는 성분이 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물에서 저감되었음을 확인할 수 있었다.

시험예 4. 타이로시나아제 효소 활성 저해 효과

실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물의 타이로시나아제 효소 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 버섯 유래의 타이로시나아제를 시그마(Sigma.)사로부터 구입하여 시험에 사용하였다. 타이로신을 기질로 사용하여 1.5mM의 타이로신 용액과 100U/ml 타이로시나아제 용액을 준비하였다. 반응의 완충 용액으로 0.1M의 인산염 완충용액을 사용하였다. 96 웰 플레이트에 준비한 타이로신 용액을 100㎕씩 넣고 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물과 비교에 1에서 제조한 골담초 추출물, Kojic acid를 시료로 사용하였다. 추출물의 최종 농도 10, 20, 50, 100 ㎍/ml이 되도록 20㎕씩 처리한 후, 마지막으로 준비한 타이로시나아제를 80㎕씩 접종한 후, 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트는 490nm에서 흡광을 측정하였다. 대조군으로는 0.1M의 인산염 완충 용액을 사용하였다.

구분		타이로시나아제 활성 저해능 (%)
코직산	1 ㎍/ml	44.4±4.6
	5 ㎍/ml	92.1±4.5
비교예 1	10 ㎍/ml	0.2±6.0
	20 ㎍/ml	0.0±5.3
	50 ㎍/ml	1.1±4.1
	100 ㎍/ml	1.8±3.6
실시예 1	10 ㎍/ml	22.8±1.8
	20 ㎍/ml	28.1±1.3
	50 ㎍/ml	30.1±1.4
	100 ㎍/ml	33.0±1.0

상기 표 5에서 보듯이, 본 발명의 발효를 통하여 타이로시나아제 활성 저해 효과가 증대되었으며 효소 수준에서 미백 효능이 있음을 확인하였다.

시험예 5. 멜라닌 생성 억제 효과

실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하기 위하여 쥐 유래의 멜라닌세포 (mouse melanocyte)를 이용하였으며, 세포를 6 웰 플레이트에 10⁵ cells/ml의 농도로 접종하여 24시간 동안 37℃의 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양된 세포에 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물과 비교예 1에서 제조한 골담초 추출물을 적용하기 위하여 혈청과 세포의 멜라닌 생성을 유도하는 것으로 알려진 α-MSH (alpha melanocyte stimulating hormone)을 함께 처리하여 10㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml의 농도로 희석하였다. 양성 대조군으로는 알부틴을 사용하였으며 대조군은 α-MSH만 함유된 배지를 처리하였다. 48시간 배양된 세포를 회수하여 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 1M 수산화나트륨 수용액에 세포를 녹여 490nm에서 흡광을 측정하였다.

구분		멜라닌 생성 저해능 (%)
알부틴	50μM	24.3±2.3
	100μM	45.08±1.9
비교예 1	10 ㎍/ml	18.5±1.5
	50 ㎍/ml	23.2±2.9
	100 ㎍/ml	38.6±2.7
실시예 1	10 ㎍/ml	21.9±3.1
	50 ㎍/ml	36.4±1.4
	100 ㎍/ml	44.1±4.0

상기 표 6의 결과로 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물이 비교예 1에서 제조한 골담초 추출물에 비하여 동일한 농도를 처리하였을 때, 세포 내 멜라닌 생성 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

시험예 6. 피부 자극 유발 여부 평가

실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물의 피부 자극 유발 여부를 평가하기 위하여 인체 첩포 시험 (Human patch test)을 통하여 인체에 대한 1차 자극 시험 및 누적 자극 시험을 수행하였다.

건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 CTFA 가이드라인 (The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association. Inc. Washington, D.C., 20036, 1991)에 따라 실시하였다. 핀 쳄버 (Finn chamber)에 시료 20㎕를 적하시킨 후, 이를 시험 부위인 인체의 팔 한쪽에 첩포하고 테이프로 고정시켰다.

1차 피부 자극시험은 24시간 동안 첩포한 후, 첩포를 제거하고 다시 4시간, 24시간 경과 한 후의 시험부위의 피부 반응을 하기 표 7의 기준에 따라 판정하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

시료	피시험자수	판정결과				자극도
		++	+	±	-
시험군	20	-	-	-	20	0
대조군	20	-	-	-	20	0
(판정기준) - : 홍반이나 특이한 현상 없음 ±: 주위보다 약간 붉어짐 +: 주위보다 현저히 붉어짐 ++: 주위보다 심하게 붉어지고 부풀어 오름 (자극도 계산식) 자극도 = [{(±) 수 × 1}+{(+)수 × 2}+{(++)수 × 3}]/피시험자 수

시료	피시험자수	유도단계									도전단계			자극도
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	24hr	48hr	72hr
시험군	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0
대조군	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0
(계산식) 자극도 = [{(±)수 × 1}+{(+)수 × 2}+ {(++)수 × 3}]/피시험자 수

상기 표 7과 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 인체에 대한 피부 자극 시험을 평가한 결과, 본 발명의 실시예 1에서 제조한 골담초 발효 추출물은 자극을 유발하지 않으며 피부에 적용하기에 안전한 소재임을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

1. 효모에 의한 골담초 발효물의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지 및 미백용 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 (Saccharomyces sp.), 또는 스키조사카로마이세스 (Schizosacchromyces sp.) 인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 사카로마이세스는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
   
   
   
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