KR101250894B1

KR101250894B1 - 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트를 이용한 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크

Info

Publication number: KR101250894B1
Application number: KR1020100108141A
Authority: KR
Inventors: 이범선; 박명원; 유순식; 한지영; 송근호; 황성진
Original assignee: 주식회사 지본코스메틱
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2013-04-04
Also published as: KR20120046472A

Abstract

본 발명은 종래의 항산화제, 미백제에 필적하는 우수한 항산화기능 및 미백기능을 나타내는 천연성분으로서 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 이용한 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크(수면팩)에 관한 발명이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크(수면팩)는 초피나무 및 산초나무 잎을 유기용매로 추출하여 그 각각의 추출물을 혼합한 것에 알부틴을 첨가하는 단계를 포함하는 것으로서 항산화기능를 함유함과 동시에 현저히 우수한 미백효과를 제공한다.

Description

인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트를 이용한 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크{Cosmetic Compositions and Sleeping Water Mask using Intensive Witening Zanthoxylumcomposite}

본 발명은 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트을 이용한 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크(수면팩)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 혼합한 것에 알부틴을 첨가한 것으로서 항산화기능 및 피부의 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 우수한 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크(수면팩)에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 작용한다. 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드 또는 빌리루빈 등 인체 내외의 색소 함유 등의 유무 등이 중요하다. 특히 가장 중요한 요인은 인체내의 멜라노사이트에서 티로시나아제 등의 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이다. 멜라닌은 흑갈색 색소로서 일정량 이상의 자외선을 흡수하는 방식으로 자외선의 침투를 차단한다.

멜라닌은 흑갈색 알갱이의 색소로서 피부, 털, 눈 등에 존재한다. 멜라닌을 만드는 세포를 멜라닌세포라 하며, 멜라닌은 멜라닌세포 속의 멜라노솜이라는 작은 자루 모양의 세포소기관에서 만들어진다. 멜라닌세포는 멜라노솜이 들어 있는 돌기를 뻗어서 케라틴세포 등 주변의 다른 세포에 멜라닌을 전달한다. 멜라닌세포의 종류에 따라 멜라노솜을 그대로 유지하고 있는 경우도 있다.

멜라닌의 양에 따라 피부색이 결정되는데, 멜라닌의 양이 많을수록 검은 피부색을 띤다. 인종마다 피부색이 다른 것은 멜라닌세포의 수가 다르기 때문이 아니라, 멜라닌세포의 크기와 만들어지는 멜라닌의 양이 다르기 때문이다.

멜라닌은 일정량 이상의 자외선을 흡수하여 인체를 보호하는 역할을 한다. 햇빛에 의해 피부가 갈색으로 변하는 것은, 피부 아래층에 존재하는 멜라닌세포가 자외선에 의해 자극을 받아 신체를 보호하기 위해 멜라닌을 만들고, 만든 멜라닌을 피부 위쪽으로 올려 보내어 자외선이 피부 깊숙히 침투하는 것을 방지하기 때문이다. 같은 논리로 햇볕에 많이 노출된 사람일수록 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 멜라닌이 많이 생성되고, 그러한 이유로 피부가 검다.

멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 유발하게 된다.

따라서 피부에 색소가 침착되는 것을 방지하는 방법에 대한 관심이 증대되고 있는데, 상기 멜라닌 생성의 주요 인자인 티로시나아제의 활동을 억제해 멜라닌 생성을 억제함으로써 멜라닌의 생성을 감소시켜 주는 방법이 일반적이다. 이를 위해 종래에는 아스콜빈 산, 코직 산, 상백피 추출물, 알부틴, 히드로 퀴논 등이 이용되어 왔다.

그러나 아스콜빈 산, 코직 산, 상백피 추출물 등은 피부의 안정성과 화장료 제형의 안정성에 문제점을 가지고 있고, 또한 히드로 퀴논은 기미 치료가 목적인 약으로 이미 미국 시장에서 판매되고 있지만 피부 자극성이 있어 사용상 제한이 있었다.

그리고 알부틴은 색소침착에 의한 기미, 주근깨 등의 생성을 억제하고 과다 멜라닌 생성을 저해시켜 주는 작용이 있어 미백효과가 우수하나 가격이 고가이고 알부틴 하나의 성분으로 한정된 범위내에서의 미백효과를 볼 수 있다는 문제점이 있다.

한편, 생체 내에서 빛과 각종 약물 등에 의해 과잉 생성된 유해한 자유 라디칼 및 다양한 활성 산소는 지질, 단백질, 핵산 등과 같은 생체 물질을 변성시킴으로써 노화 및 발암의 주요한 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 미백, 노화방지용 기능성 화장료는 피부에 도포하였을 때 멜라닌 생성 경로를 차단하기 위한 목적과 함께, 화장품 유연제 원료로 사용되는 유지, 오일 등이 공기나 물중에 용해된 용존 산소 및 자외선 등으로부터 유발되는 활성 라디칼에 의해 산화되고 분해되는 것을 방지 내지 지연시킬 목적으로 항산화제를 포함시키고 있다.

이러한 항산화제의 대표적인 예로서는 디부틸 하이드록시 톨루엔(BHT)과 천연 항산화제로서의 토코페롤을 들 수 있다. 그러나 BHT는 항산화 효과는 우수하지만 독성이 있어 피부 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 통상적으로 a-토코페롤을 지칭하는 토코페롤은 항산화 효과가 우수한 천연 항산화제이기는 하나 상업적으로는 합성 토코페롤을 사용하고 있으므로 그 부산물에 의한 피부 부작용 우려가 있음과 아울러, 근자의 많은 연구 결과는 a-토코페롤이 인체 내에서 충분한 항산화 효과를 발휘하기 위해서는 산화된 a-토코페롤을 재활용시키는 비타민C와 같은 다른 항산화제가 필요한 것으로 보고하고 있고, a-토코페롤의 단독 사용은 이보다 더욱 강력한 항산화 효과를 나타내며 독성이 강한 퍼옥시 니트라이트(peroxynitrite)유리기 중화능을 갖는 a-토코페롤의 생체 내 감소를 초래하는 것으로 보고하고 있으며 더욱이 상대적으로 고가라는 문제점이 있다.

일반적으로 화장료에 있어서의 미백작용은 멜라닌 색소 침착으로 인한 기미나 주근깨의 생성을 억제하는 작용을 지칭하며, 멜라닌 색소는 티로신(Tyrosine) 또는 도우파(Dopa)로부터 티로시나제(Tyrosinase)에 의해 도우파크롬(Dopachrome)으로 되고 자동 산화 반응을 거쳐 멜라닌 고분자로 변환 생성되는 것으로 알려져 있다.

최근 야외에서 레져활동을 즐기는 사람들이 증가하면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 늘어나고 있다. 또한 웰빙을 지향하는 사회적 추세에 따라 천연물질로부터의 추출물을 활용한 기능성 화장품 등에 대한 요구가 계속 되고 있다. 특히 피부에 손상을 주는 근본적인 원인인 활성산소를 제거하는 항산화효과와 미백효과를 두루 가지면서 안전한 신규 원료 및 이를 이용한 제품에 대한 요구가 급증하고 있다.

따라서 항산화효과를 가지면서 동시에 멜라닌 생성 경로를 차단하는 천연 물질을 함유하는 화장료를 개발하기 위한 시도가 최근 활발히 이루어지고 있다.

이에 본 발명자들은 천연유래의 유효물질인 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 혼합한 것에 알부틴을 첨가하여 제조한 화장료 조성물이 현저히 우수한 미백효과가 있음을 발명하게 되어 특허출원하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 항산화기능을 함유하면서 동시에 멜라닌 생합성 억제 효과가 우수한 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크(수면팩)를 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 혼합한 물질에 알부틴을 첨가한 것을 유효성분으로 하는 항산화 및 미백효과를 갖는 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크(수면팩)를 제공한다.

상기 화장료 조성물은 일반화장수, 크림제, 에센스, 마스크팩 등의 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명에 의한 화장료 조성물과 슬리핑 워터마스크(수면팩)는 초피나무 및 산초나무 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 항산화기능을 나타냄과 동시에 피부의 멜라닌 생성을 억제하였다.

특히, 상기 초피나무 및 산초나무 추출물에 알부틴을 첨가한 것은 멜라닌 생성을 더욱 현저히 억제하였다.

도1은 초피나무 잎 추출물의 멜라닌생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
(ZP,메탄올분획물; ZPH,노르말핵산분획물; ZPE,에틸아세테이트분획물; ZPC, 클로로포름분획물)
도2는 산초나무 잎 추출물의 멜라닌생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도3는 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 동량 혼합한 Mixture의 멜라닌생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다. (Concentration of methanol fraction are 50 ug/ml)
도4~9는 초피나무 및 산초나무 잎 추출물의 황산화 효과를 측정한 그래프이다.
도10은 초피나무 잎 추출물의 아질산염소거능을 측정한 그래프이다.
도11은 산초나무 잎 추출물의 아질산염소거능을 측정한 그래프이다.
도12는 초피나무 및 산초나무 잎 추출물의 세포독성을 측정한 그래프이다.
도13~15는 시제품을 사용한 후 피부상태를 안면분석기로 테스트한 결과를 나타낸 그래프이다.
도16은 초피나무 및 산초나무 잎 추출물의 혼합비율에 따른 멜라닌 생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도17은 초피나무 및 산초나무 잎 혼합물과 알부틴의 혼합비율에 따른 멜라닌 생성 억제 활성을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 하기와 같다.

본 발명에서는 1)초피나무(Zanthoxylum piperitum) 잎을 채취하여 동결건조 후 분말화하는 단계; 2)상기 분말화한 시료를 메탄올 등으로 추출하는 단계; 3)상기 추출액을 원심분리하여 불용성물질을 제거하고 상층액만 취한 후 필터를 사용하여 여과하는 단계; 4)그 후 감압농축장치를 이용하여 10~80℃에서 농축하여 추출물을 얻는 단계: 5)상기 4)단계의 추출물을 n-hexane, chloroform, ethyacetate 등의 용매로 연속 추출하여 분획하는 단계; 6)산초나무(Zanthoxylum schinifolium) 잎을 채취하여 상기 1)2)3)4)5)단계의 초피나무 잎과 동일하게 추출하는 단계;를 통하여 초피나무 및 산초나무 잎의 추출물을 각각 제조한 다음, 7) Tyrosinase에 대한 활성 억제 효과 검정단계;를 거쳐 미백 효과를 확인하였다. 별도로, 8) 상기에서 메탄올로 추출하여 분획한 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 균일하게 혼합하는 단계;를 거쳐 혼합물을 제조한 다음, 8)Tyrosinase에 대한 활성 억제 효과 검정단계;를 거쳐 미백 효과를 확인하였다. 그 후, 9)상기 7)단계의 혼합물에 알부틴을 첨가하는 단계;를 거친 다음, 10) Tyrosinase에 대한 활성 억제 효과 검정단계;를 거쳐 미백 효과를 확인하였다.

또한 11)상기 1)~6)단계를 거쳐 제조된 초피나무 및 산초나무 잎 추출물에 대하여 각각 DPPH에 의한 라디칼 소거능 측정단계 등;을 거쳐 항산화효과를 확인하였다.

아울러 12)상기 메탄올로 추출하여 분획된 초피나무 및 산초나무 잎 추출물에 대하여 각각 아질산염 소거능과 세포생존율 및 세포독성을 측정하였다.

상기 2)단계에서 추출 용매는 메탄올이외에도 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있다. 다만 추출 효율이 높은 메탄올이 바람직하고, 그 농도는 60~100%, 바람직하게는 70~100%가 적당하다. 60%미만의 메탄올로 추출하는 경우는 기대하는 효과를 발휘하기 부족하다. 이때 추출온도는 5~60℃, 바람직하게는 15~30℃가 적당하며, 추출시간은 1~30일, 바람직하게는 2~7일이 적당하다. 상기 추출온도 및 추출시간을 벗어나면 추출 효율이 떨어지거나 성분의 변화가 생길 수 있다.

상기 4)단계에서 감압농축장치를 이용하여 농축하는 경우 10~80℃, 바람직하게는 30~50℃가 적당하다. 10℃미만에서 농축하면 기대하는 효과를 발휘하기 어렵고, 80℃초과에서 농축하면 열에 의해 추출물의 유효성분이 파괴될 수 있다.

본 발명에 따라 초피나무(Zanthoxylum piperitum) 잎을 채취하여 각각 분리 동결건조 한 후 유기용매에 5~60℃도에서 1~30일 동안 침지시킨 다음 원심분리하여 추출한 것을 상층액만 취하여 필터를 사용하여 여과한 후 감압농축장치를 이용하여 10~80℃에서 농축하여 초피나무 잎 추출물을 제조하고, 산초나무(Zanthoxylum schinifolium) 잎을 채취하여 상기 초피나무 잎 추출물을 얻는 방법과 동일한 방법으로 산초나무 잎 추출물을 제조한 후, 상기 초피나무 잎 추출물과 산초나무 잎 추출물을 40~60:60~40의 중량비로 혼합한 혼합물에 있어서 하기 시험예1에서 설명하는 바와 같이 티로신이 산소와 결합하여 멜라닌을 생성하는 기작에 작용하는 티로시나아제 활성을 저해하는 효과를 매우 현저하게 나타내었는 바, 이하 상기물질을 '인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트'라고 정의하여 사용하기로 한다.

인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트는 미백효과 즉 티로시나아제 활성 저해율에 있어서 초피나무 잎 추출물과 산초나무 잎 추출물 각각 단독의 미백효과의 합보다도 20~30%만큼이나 상승된 매우 의미있는 결과를 나타내었다.

이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예1] 초피나무 잎 추출물 제조

냉동건조된 초피나무의 잎 1065.10 g을 분말화 한 후 80% 메탄올에 실온(15~25℃)에서 72시간 동안 침지시켜 3회 반복 추출하여 조추출물을 얻었다. 그 후, 감압농축한 초피나무 잎 추출물 197.61 g을 n-hexane, chloroform 및 ethylacetate등의 용매를 사용하여 순차적으로 연속 추출, 분획하여 n-hexane 분획물 42.42 g, chlroroform 분획물 7.91 g, ethylacetate 분획물 12.96 g, 그리고 잔사체 130.77 g을 얻었다.

[실시예2] 산초나무 잎 추출물 제조

냉동건조된 산초나무의 잎 685.33 g을 분말화 한 후 80% 메탄올에 실온(15~25℃)에서 72시간 동안 침지시켜 3회 반복 추출하여 조추출물을 얻었다. 그 후,감압농축한 초피나무 잎 추출물 105.0 g을 n-hexane, chloroform 및 ethyl acetate등의 용매를 사용하여 순차적으로 연속 추출, 분획하여 n-hexane 분획물 22.27 g, chlroroform 분획물 2.07 g, ethylacetate 분획물 19.06 g, 그리고 잔사체 61.3 g을 얻었다.

[시험예1] Tyrosinase 활성 억제 효과 검정

1) 연구방법

초피나무와 산초나무 잎의 용매분획물이 멜라닌 생합성 억제에 미치는 영향을 확인하기 위해 tyrosinase에 대한 활성 억제 검정을 측정 하였다. Tyrosinase 억제 효과의 측정은 96 well plate에 0.1 M phosphate buffer(pH 6.5) 150 ul를 넣고 여기에 1.5 mM L-tyrosine(0.1 M phosphate buffer, pH 6.5) 25 ul, 각 용매 분획 sample solution 15 ul를 넣은 후 마지막으로 2100 unit/ml에 해당하는 mushroom tyrosinase (0.05 M phosphate buffer, pH 6.5) 7 ul를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 다음 생성되는 dopachrome 양을 micro-plate reader(Bio-Rad Model No. 3550)를 사용하여 흡광도 490 nm에서 측정하였다. Positive control로는 현재 미백제 원료로 사용되어지고 있는 arbutin(Sigma Chem Co.)과 kojic acid(Sigma Chem Co.)를 사용하였다.

2) 연구결과

초피나무와 산초나무 잎에서 분리한 추출물의 멜라닌생성 억제 활성을 측정한 결과 초피나무와 산초나무 잎 용매 분획물의 농도가 증가함에 따라 (용매는 70%에탄올) 분획별 차이는 있으나 농도 의존적으로 유의적인 증가 양상을 나타내었다(표1,2/도.1,2). 특히, tyrosinase의 저해활성은 초피나무 잎의 경우 메탄올 분획물(ZP)에서 40-50 ug/ml일때 80% 이상 높은 tyrosinase 억제효과를 나타내었으나, 반면 산초나무의 경우 동일 농도에서 60% 이하의 낮은 억제효과를 나타내었다. 한편 산초나무와 초피나무 잎의 추출분획물 중 노르말핵산 분획물(ZPH), 클로로포름 분획물(ZPC), 에틸아세테이트 분획물(ZPE)의 경우 매우 낮은 tyrosinase 억제효과를 나타내었다.

본 시험예에서 가장 의미있는 부분은 메탄올로 추출하여 분획된 초피나무 잎 추출물과 산초나무 잎 추출물을 혼합한 실험구에서 티로신이 산소와 결합하여 멜라닌을 생성하는 기작에 작용하는 티로시나아제의 활성을 억제하는 효과가 초피나무 잎 추출물과 산초나무 잎 추출물 각각 단독의 효과의 합보다 매우 우수한 상승효과를 나타내었다는 점이다.

표3에서 보는 바와 같이 초피나무 잎 추출물과 산초나무 추출물을 각각 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1로 혼합한 시료에서 초피나무 및 산초나무 잎 추출물 각각의 단독 실험구에 비해 티로시나아제 억제효과가 상승되는 것을 확인할 수 있고(도.16) 특히 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 동량혼합한 실험구에서 가장 현저하게 우수한 효과를 있음을 나타내었다.(도.3) 이는 초피나무 및 산초나무 잎 추출물 각각의 단독 효과의 합이 약 66.5%(티로시나아제 저해율)인데 비해 2종의 추출물으로 혼합한 효과는 약 89%(티로시나아제 저해율)로서 그 차이가 20%를 훨씬 상회하는 매우 현저한 것인 바, 매우 의미있는 결과이다. 따라서 상기 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 단독 사용하는 것보다 2종을 혼합하여 사용하는 것이 미백효과 면에서 유리하며 특히 양 추출물을 40~60:60~40의 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 상기 메탄올로 추출하여 분획된 초피나무 및 산초나무 잎 추출물을 동량혼합한 실험구 즉 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트에 알부틴을 첨가하여 티로시나아제 저해율을 확인한 실험에서 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트와 알부틴 각각 단독 실험구의 효과보다 상기 2종의 물질을 혼합한 실험구에서 우수한 티로시나아제 저해 효과를 나타내었으며 특히 상기 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트에 알부틴을 동량첨가한 실험구에서 2종의 물질 각각 단독의 효과의 합보다 현저한 상승효과를 나타내었다.(도.17) 이는 역시 상기 두 물질 단독의 효과의 합(티로시나아제 저해율 약 76%)보다 두 물질을 혼합했을 때의 효과(티로시나아제 저해율 약 92%)가 매우 현저하게 나타나는 것인바, 종래 미백제품으로 사용되고 있는 알부틴 하나의 성분만으는로 한정된 범위에서만 미백효과를 볼 수 있는 단점을 해결할 수 있게 되었다.(표3)

멜라닌생성 억제 활성 1 (초피나무 잎 추출물)

concentration(ug/ml)	sample	Inhibition rate(%)
10	ZP	61
	ZPH	8
	ZPE	11
	ZPC	10
	Arbutin	34
	Kojic acid	58
20	ZP	69
	ZPH	10.5
	ZPE	12
	ZPC	11
	Arbutin	47
	Kojic acid	62
30	ZP	72
	ZPH	17
	ZPE	14
	ZPC	12.2
	Arbutin	61
	Kojic acid	79
40	ZP	75
	ZPH	18
	ZPE	17
	ZPC	17
	Arbutin	62
	Kojic acid	84
50	ZP	82
	ZPH	19
	ZPE	18
	ZPC	19
	Arbutin	63
	Kojic acid	92

*ZP, 메탄올분획물; ZPH, 노르말핵산분획물; ZPE, 에틸아세테이트분획물; ZPC, 클로로포름분획물.

멜라닌생성 억제 활성 2 (산초나무 잎 추출물)

concentration(ug/ml)	sample	Inhibition rate(%)
10	ZP	36
	ZPH	5
	ZPE	8
	ZPC	7
	Arbutin	34
	Kojic acid	58
20	ZP	42
	ZPH	6.5
	ZPE	9
	ZPC	8
	Arbutin	47
	Kojic acid	62
30	ZP	44
	ZPH	12
	ZPE	12.5
	ZPC	11.5
	Arbutin	61
	Kojic acid	79
40	ZP	47
	ZPH	14
	ZPE	13
	ZPC	12.5
	Arbutin	62
	Kojic acid	84
50	ZP	51
	ZPH	15
	ZPE	14
	ZPC	14.5
	Arbutin	63
	Kojic acid	92

멜라닌생성 억제 활성 4 (초피 및 산초나무 잎 추출물 Mixture와 다른 sample비교)

sample	Inhibition rate(%)
초피나무 잎 추출물	82
산초나무 잎 추출물	51
초피및산초 혼합물 (중량비 1:9)	56
초피및산초 혼합물 (중량비 3:7)	72.5
초피및산초 혼합물 (중량비 5:5)	89
초피및산초 혼합물 (중량비 7:3)	85
초피및산초 혼합물 (중량비 9:1)	83
알부틴	63
코지산	92
초피및산초 혼합물 + 알부틴 (중량비 1:9)	65
초피및산초 혼합물 + 알부틴 (중량비 3:7)	74
초피및산초 혼합물 + 알부틴 (중량비 5:5)	92
초피및산초 혼합물 + 알부틴 (중량비 7:3)	89.8
초피및산초 혼합물 + 알부틴 (중량비 9:1)	89.4

*초피 및 산초 혼합물은 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트이다.(농도 50 ug/ml)

[시험예 2] 항산화 효과 측정

1. 연구방법

1) DPPH에 의한 라디칼 소거 측정

시료의 항산화 활성은 DPPH법을 이용하여 radical 소거능을 측정 하였다. 여러 농도의 추출물 시료를 1 ml 메탄올에 희석시킨 용액과 에탄올로 1.5 X 10^-4 M/ml 농도가 되게 한 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) 용액 4 ml 씩 교반기로 균일하게 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2)환원력 측정

여러 농도의 시료 2.5 ml에 sodium phosphate buffer (2.5 ml, 200 mM, pH 6.6)와 1% potassium ferricyanide (2.5 ml)를 혼합 시킨 후 혼합물을 50에서 20분 동안 유지시킨 다음 trichloroacetic acid (2.5 ml, 10% w/v)를 첨가하여 650 x g에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리한 상징액 5 ml에 탈이온수 5 ml와 1% ferric chloride 용액 1 ml을 첨가 시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) Superoxide anion radical 소거능 측정

이 분석법은 xanthine에 의해 발생되는 Superoxide anion radical을 항산화제가 제거시키는 정도를 확인하는 실험으로써 NBT의 감소정도를 통하여 항산화기능을 측정하는 것이다.

시료 용액 100 ul에 0.1 M xanthine과 0.1 mM NBT 혼합액 900 ul를 넣고 xanthine oxidase (0.5 unit/mM)를 0.05 M EDTA가 포함된 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) 100 ul를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 2N HCl을 400 ul 첨가하여 반응을 정지 시킨 후 560 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

2. 연구결과

1) DPPH radical 소거능

초피나무와 산초나무의 잎 추출물에 대한 항산화활성 검정을 위한 DPPH free radical 소거능은 도.4와 도.5와 같다. 각 추출용매별 항산화력은 두가지 수종 모두 메탄올 분획물에서 높게 나타났으며, 산초나무에 비해 초피나무 (RC₅₀ : 3.01 ug)에서 높게 나타났다. 특히, positive control로 사용한 BHA(RC₅₀ : 12.4 ug)와 a-tocopherol(RC₅₀ : 13.7 ug)보다 초피나무 잎의 메탄올 추출물이 약 4배 이상 높은 항산화 활성을 나타내었다(표4).

초피나무 잎으로부터 분리되 메탄올 분획물의 DPPH radical 소거능

Samples	RC50 ( ug )*
ZPM**	3.01
ZSM***	9.08
BHA	12.4
α-tocopherol	13.7

*Amount required for 50% reduction of DPPH after 30 min

**ZPM; 초피나무 잎으로부터 분리된 메탄올 분획물

*** ZSM; 산초나무 잎으로부터 분리된 메탄올 분획물

2) 환원력

초피나무와 산초나무의 농도별 잎 추출물의 금속이온(Fe³ ⁺ → Fe² ⁺)을 환원시키는 환원력을 측정한 결과(도.6, 도.7) 두가지 수종 모두 추출물의 농도가 증가 함에 따라 환원력 역시 비례적으로 유의적인 증가를 나타내었다. 추출용매 분획별 차이는 메탄올 추출물에서 높게 나타났으며, 특히 초피나무 잎 추출물의 경우 positive control로 사용한 BHA에 비해 250 ul에서 2.01로 매우 높은 환원력을 나타내었다. 그러나, 다른 분획은 낮은 환원력을 나타내었다.

3)Superoxide anion radical 소거능

초피나무와 산초나무의 추출용매 분획별 superoxide anion radical 소거능을 측정한 결과 다소 차이는 있으나 모든 분획에서 농도 증가에 따라 superoxide anion radical 소거능이 증가하는 경향을 보여주었다. 100ug 농도 처리구에서 초피나무 잎의 메탄올 분획물의 경우 64.31%로 합성산화제인 BHA의 62.07% 보다 높은 superoxide anion radical 소거능을 나타내엇다. 이에반해 산초나무 잎의 메탄올 분획물은 41.03%로 천연 항산화제인 a-tocopherol 보다 높은 superoxide anion radical 소거능을 나타내었다(도.8, 도.9).

[시험예3] 아질산염소거능 측정

1) 연구방법

아질산염 소거능 측정을 위해 1 mM NaNO₂ 용액 1 ml에 시료를 농도별로 첨가하고 여기에 0.1 N HCl 및 0.2 M 구연산 완충용액을 사용하여 반응액의 pH를 1.2, 4.0, 6.0으로 조정하여 반응액의 volume을 10 ml로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반응 시킨 후 각 반응액을 1 ml 씩 취하여 2% 초산용액 5 ml, Griess 0.4 ml를 가하고 혼합한 후 상온에서, 바람직하게는 20~25℃에서 15분간 유지시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) 연구결과

초피나무와 산초나무 잎의 메탄올 분획을 농도별(5, 50, 100, 150 ug)로 조절하고 pH 별(pH 2, 4, 6)로 아질산염 소거능을 측정한 결과 농도가 증가할수록 pH가 낮을수록 아질산염 소거능은 높게 나타났으며, 초피나무 잎 추출물이 산초나무 잎 추출물에 비해 동일 농도 조건 하에서 아질산염 소거능 작용이 높게 나타났다 (도.10, 도.11)

[시험예4] 세포 생존률 및 세포독성 측정

1)연구방법

① MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

Melan-a 세포를 RPMI배지를 이용하여 24 well plate에 5 x 10³농도로 접종 한 후 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 하루 동안 배양하였다. 이 후 3일 간격으로 계대배양 한 후 MTT 50 mg/mL를 처리하여 형성된 formazan을 DMSO에 녹인 후 540 nm에서 ELISA로 측정하였다.

세포독성의 계산은 시료를 가할 때 세포(Tz, zero time)와 시료 대신 과량의 배지만을 가하여 배양한 후 세포수와 세포(C, control)와 시료를 함께 넣고 배양 한 후 세포수(T, tast)를 측정하여 아래 방식으로 세포독성을 측정하였다.

Tz>T ; (T-Tz)/(C-Tz) X 100

Tz<T ; (T-Tz)/Tz X 100

2) 연구결과

초피나무와 산초나무 잎의 메탄올 분획물의 암세포주에 대한 성장억제효과를 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 암세포주의 성장이 억제되는 결과를 보여주었으며, 초피나무 메탄올 분획물의 경우 100 ug/ml 농도에서 61.8%로 높게 나타났다. (도. 10).

[시험예5] 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트를 이용한 기능성 슬리핑 워터마스크(수면팩) 제조

가) 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트 첨가량에 따른 패널조사

자사에서 보유하고 있는 수면팩 기본 제형 전체 중량의 0.5중량%에서 5중량%까 지 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트를 각각 첨가하고 20~40대의 남,여 50명으로 이루어진 사내직원을 panel로 구성하여 패널조사를 실시하였다. 시료의 향이나 사용 후 산뜻한 느낌이 있는지 등을 기준으로 하여 기호도를 평가하였다.

본 시험예에서 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트는 초피나무 잎 추출물과 산초나무 잎 추출물을 동량으로 혼합한 것으로 이용하였다.

인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트 첨가량에 따른 패널조사 결과 (참가자 50명)

구성물질	시료1	시료2	시료3	시료4	시료5
초피 및 산초 추출물(중량%) *	0.5	1	2	3	5
종합기호도%	4(2명)	26(13명)	60(30명)	8(4명)	2(1명)

*인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트

인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트 첨가량에 따른 슬리핑 워터마스크(수면팩)에 대한 패널조사 결과는 표5에서 보는 바와 같다. 첨가량에 따른 종합 기호도를 살펴 보면 수면팩 기본제형 전체중량의 2중량%를 첨가한 경우에서 가장 우수한 결과를 나타내었고 0.5중량% 이하이거나 3중량% 이상 첨가구에서는 낮은 기호도를 나타내었는데 그 원인으로는 초피 및 산초의 향을 거의 느낄 수 없거나 초피 및 산초향의 부향율이 높아 거부감을 느끼는 것으로 판단된다.

일반적으로 추출물의 양이 화장료 조성물 전체 중량의 0.01% 미만이면 기대하는 효과를 발휘하기 어렵고 10중량% 초과이면 제제화에 어려운 문제가 있다.

나)슬리핑 워터마스크(수면팩)의 온도 및 광안정성 테스트

일반적인 보습제에 혼용하여 사용하는 경우 높은 보습효과를 기대할 수 있는 글리세릴 메타크릴레이트의 첨가비율에 따른 온도안정성과 안정성을 분석한 실험결과에서 첨가비율에 따른 안정성에는 특별한 문제가 없는 것으로 나타났다. 글리세릴 메타크릴레이트 이외에 프로필렌글라이콜이나 글리세린을 사용해도 유사한 효과를 볼 수 있다. 한편, 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트의 첨가량과 온도안정성과 광안정성을 분석한 결과에서 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트의 첨가량은 온도안정성과 광안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.(표6,7) 온도안정성은 시료를 표7의 온도조건으로 항온조에 방치하고 2주일 경과 후 시료의 상태 변화를 관찰하였고, 광안정성은 시료를 일광에서 방치하여 1주일간 시료의 상태 변화를 관찰하였다.

슬리핑 워터마스크(수면팩)의 온도 및 광안정성 테스트 시료 제조

구성물질(중량%)	시료1	시료2	시료3	시료4	시료5	시료6	시료7
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100
보습제	15	15	15	15	15	15	15
글리세릴 메타크릴레이트	0.5	1	2	3	1	1	1
점증제	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
기타 첨가제	15	15	15	15	15	15	15
초피 및 산초 추출물*	2	2	2	2	5	7	9

*인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트

슬리핑 워터마스크(수면팩)의 온도안정성과 광안정성

온도(℃)	시료1	시료2	시료3	시료4	시료5	시료6	시료7
-20℃	◎	◎	◎	◎	◎	◎	◎
-4℃	◎	◎	◎	◎	◎	◎	◎
5℃	◎	◎	◎	◎	◎	◎	◎
37℃	◎	◎	◎	◎	◎	◎	◎
45℃	◎	◎	◎	◎	◎	◎	◎
광안정성	◎	◎	◎	◎	◎	◎	◎

*주 ◎ : 층분리/상변이 이상 없음

○ : 층분리/상변이에 대한 물리적 변화 진행 중

△ : 층분리/상변이에 대한 물리적 변화 진행 완료

다) 글리세릴 메타크릴레이트 첨가비율에 따른 패널 조사(관능평가)

글리세릴 메타크릴레이트 첨가 비율에 따른 패널 조사 결과

구성물질(중량%)	control	시료1	시료2	시료3	시료4	시료5	시료6	시료7
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100
보습제	15	15	15	15	15	15	15	15
글리세릴 메타크릴레이트	0.5	0.5	1	2	3	4	5	6
점증제	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
기타 첨가제	15	15	15	15	15	15	15	15
초피, 산초추출물*	-	2	2	2	2	2	2	2
선택비율%	4(2명)	4(2명)	16(8명)	24(12명)	20(10명)	16(8명)	8(4명)	8(4명)

* 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트

각 샘플 4g을 취하여 사용하고 난 후 보습감을 20~40대의 남,여 50명으로 이루어진 사내직원을 대상으로 관능평가를 실시하였다. 평가는 수분감 지속시간, 흡수력, 사용 후 산뜻하다고 느끼는지 여부 등을 기준으로 행하였다.

글리세릴 메타크릴레이트 첨가량이 1중량%미만이면 일반적으로 보습효과를 기대하기 어렵고 4중량%초과이면 산뜻한 느낌이 저해되는 경향이 있는 바, 1~4중량%가 적당한 첨가량이라고 할 것이다. 상기에서 설명한 바와 같이 프로필렌글라이콜이나 글리세린을 혼용하여 사용하여도 유사한 효과를 볼 수 있다.

[시험예 6] 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트을 이용한 기능성 마스크팩의 제조

자사에서 보유하고 있는 마스크팩 기본 제형 전체 중량의 0.5중량%에서 5중량%까지 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트을 각각 첨가하고 20~40대의 남,여 50명으로 이루어진 사내직원을 panel로 구성하여 패널조사를 실시하였다. 시료의 향이나 사용 후 산뜻한 느낌이 있는지 등을 기준으로 하여 기호도를 평가하였다.

인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트 첨가량에 따른 패널조사 결과(참가자 50명)

구성물질	시료1	시료2	시료3	시료4	시료5
초피 및 산초 추출물(중량%) *	0.5	1	2	3	5
종합기호도%	6(3명)	22(11명)	64(32명)	6(3명)	2(1명)

*인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트

인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트 첨가량에 따른 마스크팩에 대한 패널조사 결과는 표9에서 보는 바와 같다. 첨가량에 따른 종합 기호도를 살펴 보면 마스크팩 기본제형 전체중량의 2중량%를 첨가한 경우에서 가장 우수한 결과를 나타내었고 0.5중량% 이하이거나 3중량% 이상 첨가구에서는 낮은 기호도를 나타내었는데 그 원인으로는 초피 및 산초의 향을 거의 느낄 수 없거나 초피 및 산초향의 부향율이 높아 거부감을 느끼는 것으로 판단된다.

나) 점증제 종류에 따른 마스크팩의 패널조사

마스크팩은 피부와 부직포의 점착력이 점증제의 종류 및 첨가비율에 따라 다르게 나타나므로 점증제의 종류에 따른 패널조사를 실시하였고 결과는 표10에서 보는 바와 같다. 이때 사용된 에센스 용액은 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트가 포함된 것이며 안정성이 확보된 혼합 비율 자료를 이용하여 구성하였다.

점증제의 종류에 따른 마스크팩의 패널조사 결과

구성물질(중량 %)	시료1	시료2	시료3
정제수	To 100	To 100	To 100
carbomer	0.5	-	-
HEC	-	0.5	-
Gum	-	-	0.5
중화제	-	-	-
초피 및 산초 추출물*	2	2	2
방부제	0.2	0.2	0.2
Alcohol	3	3	3
기타 첨가제	15	15	15
향	0.1	0.1	0.1
점착력 기호도%	78%(39명)	12%(6명)	10%(5명)

*인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트

각 샘플 25g을 취하여 부직포에 15분간 흡수시킨 부직포 사용시 점착력을 20~40대의 남, 여 50명으로 이루어진 사내직원을 대상으로 평가를 실시하였다.

점증제 종류에 따른 마스크팩의 패널 조사 결과 시료1에서 사용된 carbomer 첨가구에서 부직포와의 점착력 및 사용 후감이 가장 우수하게 나타났고(표10), 이 결과를 근거로 carbomer의 첨가 비율에 따라 2차 점착력 및 보습력의 패널조사를 진행하였다(표11).

다) 점증제(carbomer) 첨가 비율에 따른 점착력 및 보습력의 패널조사

점증제(carbomer) 첨가 비율에 따른 점착력 및 보습력의 패널조사는 점증제 종류별 마스크팩의 패널 조사 결과에서 가장 우수했던 carbomer의 첨가 비율을 자사에서 보유하고 마스크팩 제형 전체 중량의 0.1 ~ 0.5중량%로 조절하여 제형 샘플을 각각 제작하였다. 제작된 샘플 25g을 취하여 부직포에 15분간 흡수시킨 후 점탄성과 보습력에 대한 패널 조사를 실시하였다.

점증제의 혼합비율에 따른 마스크팩의 점착력 실험 및 패널조사 결과

구성물질(중량%)	시료1	시료2	시료3	시료4	시료5
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100
carbomer	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
중화제	-	-	-	-	-
초피및산초 추출물*	2	2	2	2	2
방부제	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
Alcohol	3	3	3	3	3
기타 첨가제	15	15	15	15	15
향	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
부착력, 사용후감 %	84(42명)	10(5명)	6(3명)	-	-
보습력 %	80(40명)	10(5명)	10(5명)	-	-

*인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트

각 샘플 25g을 취하여 부직포에 15분간 흡수시킨 부직포 사용시 점탄성을 20~40대의 남, 여 50명으로 이루어진 사내직원을 대상으로 관능평가를 실시하였다. 평가는 상기 마스크팩을 얼굴에 도포시 흐름성이 적고 퍼짐성이 우수한지, 아울러 사용후 산뜻한 느낌을 주는지 등을 기준으로 하여 행하였다.

점증제(carbomer) 첨가 비율에 따른 점착력 및 보습력의 패널조사 결과는 표11에서 보는 바와 같이 점증제 0.1중량% 첨가구가 부착력 및 사용후감이 가장 우수하였고 보습감 또한 0.1%첨가구에서 가장 좋은 것으로 나타났다. 카보머는 제조되는 화장품의 점도를 조절하는 것으로 첨가비율이 낮아질수록 점도는 낮아져 묽어지고, 첨가비율이 높아질수록 점도는 강해지게 되는 바, 마스크팩을 제조하기 위해서는 약 0.1중량%를 첨가하는 것이 바람직하다고 할 것이다.

[실시예 3] 시제품 제조

상기의 결과를 바탕으로 최종공정 조건을 수립하여 시제품(슬리핑 워터마스크)을 제작하였다.

시제품 구성비 (슬리핑 워터마스크)

원료명칭	분량
정제수	79.85
에탄올	3.00
피부 리프팅제	3.00
히아루론산나트륨(0.5%)	3.00
알부틴	2.00
프로필렌글라이콜	1.30
부틸렌글라이콜	1.00
유화 보조제	1.00
산초추출물*	1.00
초피추출물*	1.00
피부 연화제	0.70
글리세린	0.60
레시틴	0.55
기타 추출물	0.45
유화제	0.40
점증제	0.25
중화제	0.22
보존제	0.20
향료	0.13
변색 방지제	0.05
아카시아콜라겐	0.05
판테놀	0.05
토코페릴아세테이트	0.05
카퍼트리펩타이드-1	0.05
팔미토일 올리고펩타이드	0.05
아데노신	0.04
색소	0.01

*인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트

[시험예 7] 안면분석기를 이용한 피부 테스트

상기의 시제품을 30일간 사용하면서 1주일 단위로 총 4회 안면분석기를 이용하여 패널의 피부상태를 테스트하였다. (참가자 9명)

안면분석기를 이용한 피부테스트 자료 1 (색소침착,%)

	1차	2차	3차	4차	30일 후
패널 1	37	31	30	25	12
패널 2	24	20	17	15	9
패널 3	33	30	27	25	8
패널 4	22	21	19	19	3
패널 5	15	15	15	14	1
패널 6	24	20	19	18	6
패널 7	16	16	14	14	2
패널 8	43	40	40	36	7
패널 9	43	38	35	32	11
평균	28.56	25.67	24	22	6.56

상기 표13에서 보는 바와 같이 상기 시제품을 30일간 사용한 경우 개인차는 있으나 색소침착의 정도가 상당히 낮아졌음을 확인할 수 있다.

안면분석기를 이용한 피부테스트 자료 2 (피부톤,%)

	1차	2차	3차	4차	30일 후
패널 1	56	56	57	60	4
패널 2	55	55	56	57	2
패널 3	57	56	58	58	1
패널 4	53	53	53	55	2
패널 5	52	53	53	53	1
패널 6	48	48	50	50	2
패널 7	55	55	56	56	1
패널 8	57	58	58	57	0
패널 9	53	53	53	55	2
평균	54	54.11	54.89	55.67	1.67

상기 표14에서 보는 바와 같이 본 시제품을 사용후 패널 대부분의 경우에 있어서 피부톤이 밝아졌음을 확인할 수 있다.

안면분석기를 이용한 피부테스트 자료 3 (주름,%)

	1차	2차	3차	4차	30일 후
패널 1	26	25	24	24	2
패널 2	28	25	26	23	5
패널 3	14	15	14	14	0
패널 4	28	27	27	25	3
패널 5	16	15	15	14	3
패널 6	24	24	23	22	2
패널 7	24	24	22	22	2
패널 8	11	10	10	10	1
패널 9	28	28	27	26	2
평균	22.11	21.45	20.89	20	2.11

상기 표15에서 보는 바와 같이 패널 대부분의 경우에 있어서 상기 시제품 사용으로 주름상태도 다소 완화되었음을 확인할 수 있다.

Claims

초피나무(Zanthoxylum piperitum) 잎과 산초나무(Zanthoxylum schinifolium) 잎 분말을 각각 유기용매로 추출한 후, 상층액만 여과하여 감압농축장치를 통해 농축한 초피나무 잎 추출물 및 산초나무 잎 추출물을 각각 40~60:60~40의 중량비로 혼합한 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트 및 알부틴을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백 화장료 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물이고 동결 건조한 시료에 대하여 5~20배의 중량인 것을 특징으로 하는 항산화 및 미백 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트는 메탄올, 노르말핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻은 1종 이상의 용매분획물인 것을 특징으로 하는 항산화 및 미백 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트는 한국산 초피나무(Zanthoxylum piperitum) 및 산초나무(Zanthoxylum schinifolium) 잎으로부터 분리된 것이고 70~100% 메탄올로 60~84시간동안 18~25℃에서 침지시키는 과정을 3~4회 반복하여 추출된 것으로 30~50℃에서 감압증발기로 감압농축하여 분획된 것을 특징으로 하는 항산화 및 미백 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 인텐시브 화이트닝 잔톡시럼컴포지트는 화장료 조성물 전체 중량의 0.01~10중량% 포함된 것을 특징으로 하는 항산화 및 미백 화장료 조성물.
한국산 초피나무(Zanthoxylum piperitum) 및 산초나무(Zanthoxylum schinifolium) 잎을 80~100%메탄올로 추출하여 분획된 것을 각각 40~60:60~40의 중량비로 혼합한 인텐시브화이트닝 잔톡시럼컴포지트를 전체 중량 대비 0.01~10중량% 포함하고, 알부틴을 전체 중량대비 0.01~10중량% 포함하는 슬리핑 워터마스크.