KR101832288B1

KR101832288B1 - 용암해수와 탄산수, 또는 암반수를 이용한 녹차 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101832288B1
Application number: KR1020150163850A
Authority: KR
Inventors: 김민지; 주철규; 함경만; 박진오
Original assignee: 대봉엘에스 주식회사
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2018-04-04
Also published as: KR20170059651A

Abstract

본 발명은 용암해수와 탄산수, 암반수를 이용한 녹차 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 용암해수와 탄산수, 암반수를 이용하여 고함량의 활성성분을 함유하는 녹차 추출물을 제조하는 방법과 상기 방법으로 제조된 녹차 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 용암해수 및 탄산수, 암반수 녹차 추출물은 우수한 항산화, 미백, 주름개선, 피부 보습 및 피부 톤 개선, 피부 장벽 기능 회복 효과가 뛰어나다.

Description

용암해수와 탄산수, 또는 암반수를 이용한 녹차 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물{METHOD OF PREPARING GREEN TEA EXTRACT BY USING MAGMA SEAWATER, CARBONATED WATER, OR BEDROCK WATER, AND FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 용암해수와 탄산수, 암반수를 이용한 녹차 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 용암해수와 탄산수, 암반수를 이용하여 고함량의 활성성분을 함유하는 녹차 추출물을 제조하는 방법과 상기 방법으로 제조된 녹차 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)으로 구분되며, 이러한 노화과정에서 다양한 물리화학적 변화가 일어나게 된다. 내적인 노화는 사람이 나이가 들어감에 따라 나타나는 필연적인 현상으로 자유라디칼이라고 하는 활성산소가 주 원인으로 알려져 있다. 활성산소가 증가되면 인체에 존재하는 항산화 방어망이 파괴되고, 세포 및 조직이 손상되어 각종 성인병 및 산화독성이 촉진된다. 광노화는 인체 피부가 빛, 주로 자외선에 노출되었을때 나타나는 현상으로 자외선에 노출된 피부는 마찬가지로 자유라디칼과 활성산소를 생성시켜 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증과 피부노화 등을 유발하게 된다.(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989). 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 collagen, hyaluronic acid, elastin, proteoglycan, fibronectin등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다. 그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 자유라디칼이나 자외선 조사에 의해 매개되는 자유라디칼, 활성산소를 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화 시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 Matrix metalloproteinase(MMP)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

상기와 같은 활성산소종은 에너지가 크고 반응성이 매우 높아 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어 시스템을 붕괴시켜 피부 노화를 가속시키므로(Yang et al., J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 34:275-286, 2008) 활성산소에 의한 효소적, 비효소적 산화를 조절하는 것 또한 피부 노화방지에 매우 중요하다. 내적인 노화, 광노화에 관계되는 자유라디칼 및 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 대표적으로 O₂(superoxide anion radical), OH(hydroxyl radical), O₂(singlet oxygen), H₂O₂(hydrogen peroxide) 등(A.I. Potapovich et al., J. Biochem., 68:632-638, 2002; Kim et al., J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 34:259-268, 2008)으로 현재까지 이러한 피부노화에 관계되는 활성 산소종을 억제하기 위해 많은 항산화제가 개발되고 있다.

항산화제는 활성산소종의 활동을 저해하는 피부노화방지에 가장 중요한 물질로 그 종류는 크게 합성 항산화제와 천연 항산화제로 나뉜다. 대표적인 합성 항산화제로는 부틸화 히드록시 톨루엔(butylated hydroxytoluene; BHT), 부틸화 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole; BHA)를 들 수 있는데, 이들은 피부노화에 관계된 항산화 효과는 좋지만 발암성이 높아 인체에 악영향을 줄 수 있다(Namiki et al., CRC Critical Rev. Food Sci. and Nutr., 29:273-300, 1990). 또한, 이들은 비효소적 항산화 효과에 비해 효소적 항산화 효과가 미미하여(K. Nagendra Prasad et al., Innov. Food Sci. and Emer. Tech., 10:413-419, 2009) 그 응용이 어려운 실정이다. 최근에는 이러한 합성 항산화제의 문제점으로 인해 좀 더 피부 친화적인 천연 항산화제에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며, 식물로부터 많은 항산화제의 연구개발이 이루어지고 있다(K. Nagendra Prasad et al., J. Pharm. and Biomed., 51:471-477, 2010). 하지만 천연 항산화제 또한 효소적 항산화와 비효소적 항산화 효과 모두 충족시키는데 있어서 많은 연구가 더 필요한 실정이다.

다음으로, 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라조이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

아토피(atopy)성 피부염의 원인은 아직 확실하게 규명되지 못하고 있으므로 피부건조, 습진등으로 표현되는데, 아토피성 피부염(atopic dermatitis)은 다수의 요인에 의하여 기인한다. 아토피 피부염 악화에 관련하는 여러 외적 환경요인들은 잘 알려져 있으며 그 증거로 혈중 IgE의 증가, IL-4와 IL-5의 증가, INF-r등이 있으며 피부적인 이상은 표피내 수분함량이 저하되고 자연보습인자의 성분이 감소되고 경피수분손실량이 증가되고 있다.

용암해수는 40만년 전 화산 활동으로 제주 동부지역에 형성된 화산용암층에 의해 자연 여과 되어 희귀 미네랄이 다양하게 함유되어 있는 제주만의 독특한 지하수이다. 용암해수는 현무암을 뚫고 나오는 과정에서 자연 여과가 되기 때문에 매우 깨끗하며, 인체에 꼭 필요한 칼륨과 희귀 미네랄까지 다양하게 녹아 있어, 편향된 식습관, 스트레스 등으로 인해 미네랄이 부족한 현대인에게 유용한 천연소재이다. 또한 용암해수의 다양한 기능과 효능은 이미 실험과 역학조사를 통해서 입증되었다. 이러한 용암해수는 나트륨(Na) 성분 10800/, 염소(Cl^-) 19422/, 칼륨(K) 416/, 칼슘(Ca) 407/, 마그네슘(Mg) 1329/, 철(Fe) 0.01/, 리튬(Li) 0.37/, Zn 0.016/, 구리(Cu) 0.014/, 망간(Mn) 0.003/, 몰리브텐(Mo) 0.011/, 바나듐(V) 0.022/, 게르마늄(Ge) 0.001/, 스트론튬(Sr) 8.36/, 규소(Si) 10.8/, 셀레늄(Se) 0.008/, 보톤(B) 4.97/를 함유하고 있다.

탄산수는 다른 물에 비해 차가운 편이라서, 탄산이 많이 함유 되어 있다. 탄산수는 미네랄수이기도 하며 비와 눈이 토양에 스며들어 그 하층 토양에 녹아들어 끊임없이 여과되면서 만들어지는 천연자원이다. 천연 탄산수는 바위와 모래에 의해 천천히 여과되는 과정에서 칼슘, 마그네슘, 칼륨 등 미네랄을 함유되고, 미생물학적으로도 안전하다. 또한, 탄산수는 혈액순환 기능은 물론이고 고지혈증, 피부미용 등에 효과적이며, 피부 흡수가 가장 뛰어난 물로서, 민감성 피부에도 좋은 물로 알려져 있다. 이러한 탄산수는 유리탄산(free CO₂) 1628/, 중탄산이온(HCO₃) 3563/, 나트륨(Na) 1180/, 총 용존 고용 물질(T-Solid)은 4520/로 다량 함유하고 있다. 그밖에 칼륨(K) 49.3/, 칼슘(Ca) 319/, 마그네슘(Mg) 159/, 철(Fe) 0.07/, 리튬(Li) 2.30/, 황산이온(SO4) 140/, 구리(Cu) 0.02/를 함유하고 있다.

해양 암반수는 심해의 암반에 저장된 것으로 태양광이 도달하지 않기 때문에 영양 물질을 소비하는 식물 플랑크톤이 없다. 그렇기 때문에 박테리아 등에 분해된 영양물질이 풍부하다. 그리고, 해양 암반수는 “해양심층수가 암반층을 통해, 오랜시간 동안 여과되면서 암반층 아래 저장된 물”을 의미하는 것으로서, 수천년동안 형성된 물이기 때문에 성질이 안정되어 있고, 각종 효소들의 작용으로 항산화 물질이 포함되어 있다. 뿐만 아니라, 칼슘이나 마그네슘등 세포의 작용을 돕는 미네랄이나 필수 미량 원소가 균형있게 포함되어 있고, 용존되어 있는 금속 이온들의 작용으로 활성산소의 소거에 놀라운 효능 을 발휘하고 있다. 유기물의 농도가 낮고, 대장균이나 일반세균에 의한 오염이 거의 없다. 이러한 해양 암반수는 수분나트륨(Na) 성분 4664/, 염소(Cl^-) 2237/, 칼륨(K) 95.9/, 칼슘(Ca) 3560/, 마그네슘(Mg) 270.4/, 철(Fe) 0.75/, 리튬(Li) 0.45/, Zn 0.02/, 구리(Cu) 0.007/, 망간(Mn) 0.002/, 몰리브텐(Mo) 0.011/, 바나듐(V) 0.011/, 게르마늄(Ge) 0.009/, 스트론튬(Sr) 4.01/, 규소(Si) 12 /, 셀레늄(Se) 0.008/, 보톤(B) 3.14/를 함유하고 있다.

녹차는 차나무(Camellia sinensis)의 잎을 사용하는 것으로, 차나무는 카멜리아(Camellia) 속으로 분류되는 82종 중 하나로 현재 아시아를 중심으로 아프리카, 남아메리카, 오세아니아 등의 50여개 국가에서 재배되고 있다. 천연 기능성 물질 가운데서 우수한 항산화력이 검증된 식물 중의 하나로서 폴리페놀성 화합물인 카테킨을 비롯한 다수의 유효 성분이 함유되어 있으며, 여러 가지 약리작용이 뛰어나고 특히 항산화성이 우수하여 생체 내외의 스트레스에 의해 발생되는 유리기를 제거하는 기능이 있다고 알려져 있다.

등록특허 10-14630130000은 용암해수를 이용한 된장과 간장의 제조방법을 개시한다. 등록특허 10-09823510000은 용암해수 미네랄수를 함유하는 육모제 조성물을 개시한다. 출원특허 10-20130146915는 울금과 용암해수를 이용한 항콜레스테롤 또는 간기능 개선용 조성물과 기능성 식품을 개시한다.

등록특허 10-20110131653은 녹차 잎의 열수추출물 및 녹차 잎의 에탄올추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 조성물을 개시한다. 등록특허10-14493770000은 녹차 아세톤 추출물의 추출방법을 개시한다. 출원특허 10-20090043571은 녹차 추출물을 함유하는 조성물을 개시한다. 출원특허 10-20110107337은 녹차 추출물을 함유하는 미백용 화장료 조성물을 개시한다. 출원특허 10-20130051253 은 초음파 추출기술을 이용한 항산화활성이 높은 저카페인 함유 녹차추출물의 제조방법을 개시한다. 등록특허 10-1123102는 초고압 재결정화 방법을 이용한 녹차 EGCG 분리, 정제법을 개시한다.

그러나 상기문헌 어디에도 용암해수와 탄산수, 암반수를 이용한 녹차 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 대한 개시가 없었다. 이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 추출방법들에 있어서 화장료로서의 응용 가능성을 연구한 결과, 용암해수와 탄산수를 추출용매로 이용하여 고함량의 활성성분을 포함하는 녹차 추출물을 제조할 수 있고, 그 추출물은 기능성 화장료로서의 용도를 제공하고자 한다.

따라서 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 상기 종래의 연구나 시도가 없었던, 용암해수와 탄산수, 암반수를 이용한 녹차 추출물의 제조 방법 및 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물의 화장학적 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서,

용암해수, 탄산수, 및 암반수에서 선택되는 1종 이상을 추출용매로 하여 제조한 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 있어서, 항산화, 미백, 주름개선, 피부 보습, 피부 톤 개선, 피부 자극 완화 및 피부 장벽 기능 회복 효과를 지니는 것을 하는 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 있어서, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유형, 유중수형, 또는 연고의 제형인 것을 특징으로 하는 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 챔버에 녹차 및 용암해수, 탄산수, 및 암반수로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 넣어 추출물을 추출하는 추출 단계;

상기 추출물을 마이크로필터 또는 여과보조제를 이용하여 여과하는 여과 단계; 및

상기 여과물을 동결건조, 분무건조, 또는 감압건조하여 농축하는 농축공정을 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 녹차 추출물의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 추출 단계는 90℃ 이하, 5 시간 이하로 추출하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 녹차 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 용암해수, 탄산수, 암반수를 이용한 녹차 추출물은, 일반 정세수를 이용한 녹차 추출물 보다 우수한 항산화 효과, 미백효과, 주름개선효과, 피부 자극 완화 효과를 가지는 바, 화장료 및 피부외용제로서 매우 유용하다.

도 1은, 추출 용매에 따른 수율을 나타낸 그래프이다.
도 2는, 추출 공정의 모식도이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 용암해수, 탄산수, 및 암반수에서 선택되는 1종 이상을 추출용매로 하여 제조한 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

용암해수와 탄산수, 암반수를 이용한 녹차 추출물은, 항산화, 미백, 주름개선, 피부 보습, 피부 톤 개선, 피부 자극 완화 및 피부 장벽 기능 회복 효과를 지닌다.

상기 녹차 추출물은, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유형, 유중수형, 또는 연고의 제형으로 제조될 수 있고, 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어 상기 용암해수와 탄산수, 암반수를 이용한 녹차 추출물의 함량은, 특별히 제한되지는 않지만, 기능성과 제제성을 고려하여, 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 90 %중량인 것이 바람직하다.

상기 녹차 추출물은, 챔버에 녹차 및 용암해수, 탄산수, 및 암반수로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 넣어 추출물을 추출하는 추출 단계; 상기 추출물을 마이크로필터 또는 여과보조제를 이용하여 여과하는 여과 단계; 및 상기 여과물을 동결건조, 분무건조, 또는 감압건조하여 농축하는 농축공정을 순차적으로 포함하는 것에 의해 제조될 수 있다.

특히, 본 발명에 있어서, 상기 추출 단계는 90℃ 이하, 5 시간 이하로 추출하는 것이 바람직하고, 80℃ 이하, 3 시간 이하로 추출하는 것이 더 바람직한데, 이 추출 조건에서 피부 자극을 줄 수 있는 성분이 용출되기 않는 것으로 보이기 때문이다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 비교예, 실험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예로 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

실시예 및 실험예

실시예 1

건조시켜 분쇄한 녹차가루 50g에 용암해수 450ml를 첨가한 후 80℃에서 3시간 동안 교반하면서 추출을 진행한다. 추출이 완료된 후, 추출액을 1um 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 용암해수 녹차 추출물을 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 1"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

실시예 2

건조시켜 분쇄한 녹차가루 50g에 탄산수 450ml를 첨가한 후 80℃에서 3시간 동안 교반하면서 추출을 진행한다. 추출이 완료된 후, 추출액을 1um 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 탄산수 녹차 추출물을 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 2"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

실시예 3

건조시켜 분쇄한 녹차가루 50g에 암반수 450ml를 첨가한 후 80℃에서 3시간 동안 교반하면서 추출을 진행한다. 추출이 완료된 후, 추출액을 1um 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 탄산수 녹차 추출물을 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 3"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

비교예 1

건조시켜 분쇄한 녹차가루 50g에 정제수 450ml를 첨가한 후 80℃에서 3시간 동안 교반하면서 추출을 진행한다. 추출이 완료된 후, 추출액을 1um 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 탄산수 녹차 추출물을 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 4"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

비교예 2

용암해수 "시료 5"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

비교예 3

탄산수 "시료 6"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

비교예 4

암반수 "시료 7"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

비교예 5

건조시켜 분쇄한 녹차가루 50g에 70% 에탄올 수용액 450ml를 첨가한 후 80℃에서 3시간 동안 교반하면서 추출을 진행한다. 추출이 완료된 후, 추출액을 1um 필터로 여과를 수행하여 여과액을 수득하였고, 이 여과액을 감압농축하여 -21℃ 조건에서 동결 전처리 후 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)를 이용하여 -80℃, 48시간 동안 동결건조를 실시하여 녹차 추출물을 얻었다.

상기 녹차 추출물에 용암해수 450ml를 첨가한 후 교반하여 수득된 것을 "시료 8"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

비교예 6

상기 녹차 추출물에 정제수 450ml를 첨가한 후 교반하여 수득된 것을 "시료 9"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.

실험예 1 - 추출수율

본 발명의 추출용매에 따른 녹차 추출물의 수율을 확인하기 위하여 건조된 녹차시료 투입량 대비 추출물 수득량을 통해 실시예, 비교예 별 추출물의 수율 비교를 수행하였다. 결과는 하기 표 1과 같았다.

추출용매	수율(%)
용암해수 녹차 추출물	시료1	15.7
탄산수 녹차 추출물	시료2	16.3
암반수 녹차 추출물	시료3	15.3
정제수 녹차 추출물	시료4	10.5

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 녹차 추출물의 수율확인 실험에서 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 용암해수, 탄산수, 암반수로 추출한 녹차 추출물의 수율이 높았다.

실험예 2 - 유리 아미노산/단백질 함량 분석

본 발명의 추출용매에 따른 녹차 추출물의 유리 아미노산/단백질 함량 분석을 수행하였다. 먼저 유리 아미노산의 경우 전처리를 하지 않고 바로 분석하였고, 비유리된 단백질 함량분석의 경우는 하기 전처리 과정을 거쳐 단백질을 유리시켜 분석하였다. 녹차 추출물 시료 0.2g을 20 의 6N HCl에 130 24시간 동안 가수분해시켜 단백질의 펩타이드 결합을 끊어 단백질을 유리아미노산으로 만들었다. 그 후 유리 아미노산을 OPA(o-phthalaldehyde, Agilent), FMOC(9-fluorenylmethylchloroformate) 유도체를 사용하여 형광을 띄는 아이소인돌(isoindole)을 형성시킨 후, 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용한 형광검출기(FLD, Agilent Technologies, USA)에서 아미노산을 검출하였다. 표준물질로 250pM 아미노산 분석 스탠다드 (AAS, Agilent, USA), Theanine(Sigma)를 사용하여 검량선을 작성하고 본 발명의 시료들의 아미노산을 확인하여 총량으로 나타내었다. 결과는 하기 표 2과 같았다.

총량	시료 1 용암해수 녹차 추출물 (mg/g)	시료 2 탄산수 녹차 추출물 (mg/g)	시료 3 암반수 녹차 추출물 (mg/g)	시료 4 정제수 녹차 추출물 (mg/g)
유리아미노산	53	50	48	26
비유리(단백질)	85	84	81	67

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 녹차 추출물의 수율확인 실험에서 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 용암해수, 탄산수, 암반수로 추출한 녹차 추출물의 유리아미노산/단백질 함량이 높았다.

실험예 3 - 당 분석

본 발명의 추출용매에 따른 녹차 추출물의 총 당 함량을 측정하기 위해 Phenol-sulfate법을 수행하였다. Phenol-sulfate법은 환원당을 진한 황산으로 처리하면 탈수되어 furfural 또는 그 유도체가 형성되는데 이 유도체의 흡광도를 490nm에서 측정하여 정량하는 방법으로 실험방법은 하기와 같다. 우선 sample 0.5 ml에 5 % phenol을 0.5 ml 가한 후 황산 2.5 ml 를 강하게 넣는다. 그 후 vortex mixer를 사용, 30초간 vortexing 후 25 20분간에 방치하고 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정, 검량선을 작성하고 총당량 정량을 하였다. 검량 표준선은 Glucose standard(Sigma, USA)를 사용하였고, 결과는 하기 표 3와 같다.

추출용매	당 함량(%)
용암해수 녹차 추출물	시료1	8.16
탄산수 녹차 추출물	시료2	7.91
암반수 녹차 추출물	시료3	7.48
정제수 녹차 추출물	시료4	5.12

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 녹차 추출물의 수율확인 실험에서 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 용암해수, 탄산수, 암반수로 추출한 녹차 추출물의 당 함량이 높았다.

실험예 4 - 미네랄 분석

본 발명의 추출용매에 따른 녹차 추출물의 미네랄 함량을 확인하기 하기 위해

각각의 녹차 추출물을 코니컬 비커에 정밀히 칭량한 후 질산 (NitricAcid65%, Suprapur, MerckCo.) 을 가하여 상온에서 180분 이상 반응시킨 후, 80에서 400분간 가열분해하였다. 가열분해한 시험용액의 질산을 완전히 휘발시키고 상온에서 방랭 후 질산을 다시 가하여 위와 같은 조건으로 재가열 분해한 뒤 질산을 휘발시켰다. 잔류물을 2% 질산으로 충분히 재용해하여 filterpaper(ADVANTEC No.5c)로 여과한 다음 2% 질산을 이용하여 정용하여, 유도결합플라즈마 분광분석기 (ICP-Inductively Coupled Plasma, Perkin ElmerOPTIMA3300XL,U.S.A.)로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타냈었다.

함량 (mg/L)
	용암해수 녹차 추출물	탄산수 녹차 추출물	암반수 녹차 추출물	정제수 녹차 추출물	용암해수	탄산수	암반수	정제수
Ca	487	341	3621	2.4	407	319	3560	-
K	564	210	297	112.4	416	49.3	95.9	-
Mg	1487	186	293	6.4	1329	159	270.4	-
Na	10821	1197	4667	1.5	10800	1180	4664	-
Si	10.8	-	12.13	-	10.8	-	12	-
Sr	8.45	-	4.77	-	8.36	-	4.01	-
Fe	0.15	0.1	0.9	0.1	0.01	0.07	0.75	-
Cl	19451	-	2245	-	19422	-	2237	-
Cu	0.015	0.03	0.08	-	0.014	0.02	0.07	-
Li	0.37	2.37	0.46	-	0.37	2.30	0.45	-
Mn	0.8	0.7	0.87	0.6	0.003	-	0.002	-
Ge	0.001	-	0.01	-	0.001	-	0.009	-
Mo	0.011	-	0.007	-	0.011	-	0.005	-
Se	0.018	-	0.015	-	0.008	-	0.009	-
Zn	0.78	0.5	0.47	0.3	0.016	-	0.02	-
V	0.022	-	0.019	-	0.022	-	0.011	-
B	4.97	-	3.14	-	4.97	-	3.14	-

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 용암해수, 탄산수, 암반수로 추출한 녹차 추출물이 녹차 자체의 미네랄 함량 추출을 극대화함을 확인하였다.

실험예 5 - 폴리페놀, 플라보노이드 함량 분석

본 발명에 의한 녹차 추출물의 주요성분 중 항산화 효과와 관련된 페놀성 물질, 플라보노이드에 대한 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

총 페놀 함량은 다음과 같이 측정하였다. 추출액 1 mL에 증류수 10 mL을 첨가한 후, 2 mL의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시킨다. 이 반응물에 20 % 소듐 카보네이트를 2 mL 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 시킨 후 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지표물질은 갈릭산(gallic acid, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표 물질의 농도 별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 하기 표 2에 나타내었다.

총 플라보노이드 함량은 다음과 같이 측정하였다. 추출액 1.5 mL에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃6H₂O을 혼합한 다음 상온에서 10분간 반응을 시킨 후 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 367 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 카테킨(catechin, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표 물질의 농도 별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여 하기 표 5 나타내었다.

추출용매	시료	총 페놀함량 (gallic acid equivalents) (/ of extract)	총 플라보노이드 함량 (catechin equivalents) (/ of extract)
용암해수 녹차 추출물	시료1	216	147
탄산수 녹차 추출물	시료2	214	144
암반수 녹차 추출물	시료3	210	141
정제수 녹차 추출물	시료4	181	123
용암해수	시료5	-	-
탄산수	시료6	-	-
암반수	시료7	-	-

상기 표 5의 결과 용암해수와 탄산수, 암반수로 추출한 녹차추출물은 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 높은 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량을 나타내었다.

실험예 6 - 항산화 효과 측정

본 발명의 상기 녹차 추출물에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼소거시험과 활성산소소거시험을 실시하였다.

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 540 nm에서 최대 흡광도를 나타는 것을 이용, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록 즉, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 540 nm파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 하기와 같은 검정시험방법에 의해 진행하였다.

먼저 0.1 mM 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical(DPPH, Sigma)용액 1 mL에 상기의 실시예, 비교예 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1 mL를 혼합하고, 37에서 15분간 방치한 후 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼소거시험에서 대조군은 DPPH 1 ml과 메탄올 1 ml을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 메탄올 1 ml과 시료 1 ml을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼소거율을 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 표 3에서 SC₅₀은 자유라디칼을 50 % 소거하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 항산화활성이 높음을 나타낸다.

활성산소소거시험은 잔틴/잔틴옥시데이즈(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소반응에 의한 활성산소 발생을 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용한 흡광도 변화를 측정함으로써 활성 산소의 소거능을 알 수 있다.

Na₂CO₃ 2.4 mL, xanthine(Sigma) 0.1 mL, ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA) 0.1 mL, bovine serum albumin(BSA, Sigma) 0.1 mL, NBT 0.1 mL 및 시료 0.1 mL을 넣고 vortex mixer(Type 37600 Mixer, Mini mix, USA)를 이용하여 voltexing 후 25에서 10분간 방치한 후 xanthine oxidase 0.1mL을 넣고 25 20분간 반응시킨 후, 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 활성산소소거활성시험에서의 대조군은 시료용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, xanthine oxidase 용액 대신 3차 증류수를 넣어 추출 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

수학식 2를 이용하여 활성산소소거율을 수치로 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 표 3에서, IC₅₀은 활성산소를 50 % 소거하기 위해 소요되는 시료 농도이며, 값이 작을수록 항산화활성이 강함을 의미한다.

시험에 사용한 시료는 각 실시예와 비교예에서 수득한 녹차 추출물이며, 항산화 효과를 비교하기 위해 상기와 같이 시험을 하였고 그 결과를 표 6에 나타내었다.

추출용매	추출방법	항산화 효과
추출용매	추출방법	자유라디칼소거율 SC₅₀(mg/mL)	활성산소소거율 IC₅₀(mg/mL)
용암해수 녹차 추출물	시료1	0.14	0.23
탄산수 녹차 추출물	시료2	0.12	0.21
암반수 녹차 추출물	시료3	0.15	0.26
정제수 녹차 추출물	시료4	0.32	0.49
용암해수	시료5	-	-
탄산수	시료6	-	-
암반수	시료7	-	-

상기 표 6의 결과 암해수와 탄산수, 암반수로 추출한 녹차추출물은 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 높은 항산화효과를 나타내었다.

실험예 7 - 타이로시네이즈 활성저해 시험

본 발명의 상기 녹차 추출물에 대한 미백효과를 검정하기 위해 타이로시네이즈(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 평가하였다. 타이로시네이즈는 생체내에서 타이로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 멜라닌이란 흑색의 고분자로서 생체내에서 상기와 같은 산화에 의해 멜라닌이 형성되어 피부 상층부로 이동하게 되면 피부가 검게 변하고 기미, 주근깨를 생성하게 된다. 이러한 타이로시네이즈의 작용을 억제하는 정도를 측정하여 미백효과를 검정하는 방법(Pomerantz S. H., J. Biochem., 24:161-168, 1966)을 응용해 판정하였다. 시험방법은 하기와 같다.

시료 0.9 mL, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 1.0 mL 및 1.5 mM L-타이로신 용액 1.0 mL을 넣은 후, 37에서 10분간 유지시켰다. 머쉬룸타이로시네이즈(1,500 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 37에서 10분간 반응시킨 후, UV-vis spectrophotomete(Smartspec Plus, Biorad, USA)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하여 타이로시네이즈에 대한 저해율을 측정하였다.

상기 타이로시네이즈 활성저해시험을 위한 대조군은 시료액 대신 완충용액을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 타이로시네이즈 대신 완충용액을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻은 경우로 설정하였다.

효과를 판단하기 위해 실험에 사용한 비교군은 여러 연구결과에서 미백효과가 뛰어나다고 알려진 arbutin(Arbutin synthetic, Sigma)을 비교하였고, 하기 수학식 3을 이용하여 타이로시네이즈 저해율을 수치로 계산하여 표 7에 나타내었다. 표 7에서, IC₅₀은 타이로시네이즈 활성을 50 % 저해하는데 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

추출용매	타이로시네이즈저해율(IC₅₀, ug/ml)
용암해수 녹차 추출물	시료1	200
탄산수 녹차 추출물	시료2	180
암반수 녹차 추출물	시료3	190
정제수 녹차 추출물	시료4	340
용암해수	시료5	-
탄산수	시료6	-
암반수	시료7	-
Arbutin		150

표 7에 나타난 바와 같이, 암해수와 탄산수, 암반수로 추출한 녹차추출물은 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 높은 미백 효과를 나타내었으며, 특히 탄산수로 추출한 녹차 추출물은 강력한 미백제로 알려진 Arbutin과 거의 비슷한 강력한 미백 효과를 나타내었다.

실험예 8 - 콜라겐 합성 효과 시험

본 발명의 상기 녹차 추출물에 대한 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정하였다. 콜라겐은 상기 엘라스틴과 함께 피부 내 진피 matrix층을 이루는 구성성분으로서 피부가 서서히 노화 되어가며 진피 내 matrix층을 이루고 있는 구성성분들이 분해되어 감으로 주름이 생성되어지는데, 진피 matrix층의 구성성분인 콜라겐의 합성효과를 확인함으로써 피부 주름을 개선시키는 효과를 확인 할 수 있다. 시험 방법은 하기와 같이 진행한다.

사람의 정상 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(1 X 10⁵ 세포/웰) 37, 5 % 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 시료들을 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM배지에서 24시간 동안 배양하였다. 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 다음과 같이 수행한다.

24시간 배양한 배리를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 버퍼(PBS-T; 0.05 % Tween 20 in phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 블로킹 용액(5 % skin milk, Fluka)을 첨가하여 37에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 버리고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차항체(rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 uL씩 가하여 37에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 이차 항체(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 uL씩 첨가하여 37에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척후, 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100 uL씩 넣고 항온 25에서 발색시킨 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 콜라겐 합성효과를 측정하기 위한 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도이며, 콜라겐 합성효과를 판단하기 위해 아스코르빈산을 비교군으로 설정하여 각각 3회씩 실시, 평균값을 구하였다.

하기 수학식 4를 이용하여 콜라겐 합성효과를 수치로 계산하여 표 8에 나타내었다.

콜 라 겐 합 성 효 과 (%)	추출용매	시료	농도(ug/mL)
	추출용매	시료	0	1	10	100
	용암해수 녹차 추출물	시료1	100.00	104.21	106.66	121.47
	탄산수 녹차 추출물	시료2	100.00	103.10	107.54	128.01
	암반수 녹차 추출물	시료3	100.00	103.5	106.17	131.89
	정제수 녹차 추출물	시료4	100.00	102.13	103.70	109.80
	용암해수	시료5	100.00	101.3	103.28	102.91
	탄산수	시료6	100.00	102.64	101.82	100.38
	암반수	시료7	100.00	100.75	101.23	102.31
	아스코르빈산		100.00	108.45	123.57	131.58

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 탄산수 녹차 추출물, 암반수 녹차 추출물, 용암해수 녹차 추출물, 정제수 녹차 추출물 순으로 월등한 주름개선 효과를 나타내었다.

실험예 9 - 자외선 조사 후 녹차 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

본 발명의 상기 녹차 추출물에 대한 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하여 MMP-1 발현억제를 검정하기 위해서 하기와 같이 효소면역분석법(ELISA)를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5 J/의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/ml -nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때, 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하고, MMP-1 발현 억제 평가를 하기 위해 MMP-1 발현 억제효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀을 비교군으로 설정하여 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

추출용매	시료	처리농도(%)	MMP-1 발현 억제율(%)
용암해수 녹차 추출물	시료1	0.1	23
탄산수 녹차 추출물	시료2	0.1	24
암반수 녹차 추출물	시료3	0.1	26
정제수 녹차 추출물	시료4	0.1	12
용암해수	시료5	-	-
탄산수	시료6	-	-
암반수	시료7	-	-
레티놀		0.1	38

상기 표 9에 나타난 바와 같이, 용암해수와 탄산수, 암반수로 추출한 녹차추출물은 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 MMP-1 발현 억제효과를 나타내었고, 특히 암반수 녹차추출물은 26 % 이상의 억제율을 보였다.

실험예 10 - B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

본 발명의 녹차 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단하였다. 실험방법은 하기와 같다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2 X 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄 (Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1 % Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 mL를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1 N NaOH (10 % DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율 (%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율 (%)은 수학식 5에 의하여 계산, 하기 표 10에 나타냈으며, 이때, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50 % 저해하는 물질의 농도로 낮을 수록 멜라닌 생성 저해효과가 높음을 의미한다.

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

추출용매	시료	멜라닌 합성 저해율 (IC₅₀)
용암해수 녹차 추출물	시료1	0.15 %
탄산수 녹차 추출물	시료2	0.12 %
암반수 녹차 추출물	시료3	0.15 %
정제수 녹차 추출물	시료4	0.28 %
용암해수	시료5	-
탄산수	시료6	-
암반수	시료7	-
Arbutin		0.10 %

상기 표 10에 나타난 바와 같이, 용암해수와 탄산수, 암반수로 추출한 녹차추출물은 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 높은 멜라닌 생성 억제효과를 나타내었고, 특히 탄산수로 추출한 녹차 추출물의 IC₅₀값은 0.12 %로 기존의 미백제인 알부틴과 같은 우수한 효과를 나타내었다.

실험예 11 - 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 발명의 상기 녹차 추출물에 대한 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1 X 10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 uL의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15 W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/cm²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1 mL을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 녹차 추출물을 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 uL 배지와 MTT 용액(2.5 mg/mL) 60 uL를 넣은 후 2시간동안 37 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500 uL씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 uL씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 565 nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 6에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 7에 의하여 계산하여 하기 표 11에 나타내었다.

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

추출용매	시료	처리농도(%)	세포독성 완화율 (%)
용암해수 녹차 추출물	시료1	0.1	21
탄산수 녹차 추출물	시료2	0.1	29
암반수 녹차 추출물	시료3	0.1	24
정제수 녹차 추출물	시료4	0.1	15
용암해수	시료5	0.1	-
탄산수	시료6	0.1	-
암반수	시료7	0.1

상기 표 11에 나타난 바와 같이, 용암해수와 탄산수, 암반수로 추출한 녹차추출물은 정제수로 추출한 녹차 추출물보다 높은 세포독성 완화율을 나타내어 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

실시예 4, 및 비교예 7 내지 9

상기 실시예에 따른 용암해수 녹차 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 표 12과 같이 구성하여 제조하였다(단위는 중량%).

번호	성 분	실시예 4	비교예 7	비교예 8	비교예 9
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0	3.0	3.0
16	시료 1	10.0	-	-	-
17	시료 8	-	-	-	10.0
18	시료 9	-	-	10.0	-
19	증류수	잔량	잔량	잔량	잔량
20	방부제, 향, 색소	미량	미량	미량	미량

상기 표 12의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 19의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1 내지 11을 80℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 19의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark , Primix, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 20를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

실시예 5, 및 비교예 10

상기 실시예에 따른 특정 연속 공정을 통한 탄산수 녹차 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 표 13와 같이 구성하여 제조하였다(단위는 중량%).

번호	성 분	실시예 5	비교예 10
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 2	1.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 13의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 17의 수성성분을 80로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1 내지 11을 80로 가온하여 상기 원료 12 내지 17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark , Primix, Japan)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

실시예 6, 및 비교예 11

상기 실시예에 따른 특정 연속 공정을 통한 암반수 녹차 추출물을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 표 14와 같이 구성하여 제조하였다(단위는 중량%).

번호	성 분	실시예 6	비교예 11
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	시료 3	1.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

실험예 12 - 미백효과 측정

상기 제형 실시예 및 제형 비교예에서 제조된 영양크림의 미백효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 기미, 주근깨 및 색소 침착증을 갖고 있는 25세이상 여성 20명을 대상으로 상기 실시예 4 내지 6, 및 비교예 7 내지 11의 영양크림을 12주간 사용하게 한 후 피부색의 변화를 Chromameter(CR-410, Minolta, Japan)를 이용하여 색의 밝기 변화 (L)을 측정하였다. 총 20명의 평균값을 통하여 계산하였으며, 밝기 변화 값이 높을 수록 미백효과가 높음을 의미한다. 실험 결과는 하기 표 15과 같다.

	평균값
	실시예 4	비교예 7	실시예 5	비교예 10	실시예 6	비교예 11
피부색 밝기 변화(L)	4.32	0.39	4.13	0.39	5.31	0.39

상기 표 15의 결과와 같이 용암해수와 탄산수, 암반수 녹차 추출물이 첨가된 제형 실시예의 영양크림은 용암해수와 탄산수 녹차 추출물이 첨가되지 않은 제형 비교예의 영양크림과 비교하였을 때, 미백효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

실험예 13 - 주름개선효과 측정

상기 제형 실시예 및 제형 비교예에서 제조된 영양크림의 주름개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부노화가 진행중인 30대 이상 여성 40명을 대상으로 상기 실시예 4 내지 6, 및 비교예 7 내지 11의 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름(crow feets)부위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형(replica)을 영상분석법으로 Skin visiometer(SV-600, C+K, Germany)를 이용하여 주름의 깊이(um)를 측정하고, 그 결과를 하기 표 16에 나타내었다.

	평균값(A.U)
	실시예 4	비교예 7	실시예 5	비교예 10	실시예 6	비교예 11
도포 전	328±17	322±15	337±11	322±15	330±16	322±15
도포 12주후	263±13	316±18	269±21	316±18	271±36	316±18
주름깊이 감소율(%)	19.8	1.9	20.2	1.9	20.5	1.9

상기 표 16의 결과와 같이 용암해수와 탄산수, 암반수 녹차 추출물이 첨가된 제형 실시예의 영양크림은 용암해수와 탄산수 녹차 추출물이 첨가되지 않은 제형 비교예의 영양크림과 비교하였을 때, 주름 개선효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

실험예 14 - 피부 일차 자극 평가

상기 실시예 4 내지 6, 및 비교예 7 내지 11의 인체피부 일차 자극 평가 시험은 전문 임상시험 기관인 P&K에 의뢰하여 수행하였다. 피험자 선정은 선정조건을 만족하고 제외조건에 해당사항이 없는 성인 30명 이상 선정하여 수행하였으며, 피험자의 척추를 제외한 등의 평평한 부위로 착색이나 피부손상이 없는 부위에 첩포하였다. 피부 자극정도 평가는 Frosch & Kligman, CTFA(Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) guideline에 의해 평가하였으며 결과 계산은 하기 표 17의 등급 판정 기준에 따라 아래의 수학식 8을 이용하여 피부반응도를 판정하였다. 또한 시험 물줄의 피부자극정보는 아래의 수학식 9을 이용하여 하기 표 18의 피부 자극 지수표를 참조하여 판정하였다.

기호	등급	판정 기준
+	1	약간의 홍반, 반점 또는 미만성(diffuse)
++	2	증등도의 균일한 홍반
+++	3	부종을 동반한 심한 홍반
++++	4	부종과 소수포를 동반한 심한 홍반

i: 피험자번호

n: 평가횟수

피부자극지수	구분	비고
0.00 ~ 0.25	비 자극성	6.25 %
0.26 ~ 1.00	약한 자극성	25.00 %
1.01 ~ 2.50	중등도 자극성	62.50 %
2.51 ~ 4.00	강한 자극성	100.00 %

결과는 하기 표 19에서 나타낸 바와 같았다.

시험제품	피부자극지수	피부자극정도
실시예 4	0.05	비 자극성
실시예 5	0.11	비 자극성
실시예 6	0.07	비 자극성
비교예 7	0.09	비 자극성
비교예 8	0.25	비 자극성
비교예 9	0.35	약한 자극성
비교예 10	0.15	비 자극성
비교예 11	0.09	비 자극성

상기 표 19에 확인할 수 있듯이, 본 발명의 실시예는 모두 비 자극성으로 평가되었다. 다만, 비교예 8의 경우 비 자극성이지만 피부자극지수가 비교적 높은 편이고, 특히, 비교예 9의 경우, 약한 자극성이 있는 것으로 나타났는데, 알코올 등의 용매로 추출할 경우 피부자극성분도 같이 추출되는 것으로 보인다. 한편, 비교예 8와 비교예 9를 비교하면, 용암해수의 미네랄 성분이 이러한 피부작극성분과 반응하여 피부 자극도를 높히거나, 피부자극 시너지 효과를 내는 것으로 일응 보이는데, 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.

실험예 15 - 피부자극 완화 평가 시험

상기 실시예 4 내지 6, 및 비교예 7 내지 11에서 제조된 영양크림의 피부 자극완화 효과 및 피부안전성을 확인하기 위하여 과거력상 피부자극에 과민 반응을 보인 적이 없으며, 현재 피부병 내지 피부 알러지 증상이 없는 20~30대 여성 20명을 대상으로 인체 피부첩포시험을 하였다. 피부 자극 물질인 락틱산 5.0% 본 발명의 실시예 4, 비교예 1 에 첨가하여 시험에 사용하였다. 우선 시험 부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 준비된 시험 물질을 15씩 핀챔버(Finn chamber, 100x 10, EPITEST, 핀란드) 내에 적하시킨 후, 시험대상자의 전박(forearm)안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24시간 동안 첩포하고, 첩포를 제거한 후, 펜으로 시험부위를 표시하였다. 표시후 각각 1시간 및 24시간 후에 확대경(8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험부위를 관찰하여 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다. 피부 반응은 국제접촉피부염연구회(ICDRG, International Contact Dermatitis ResearchGroup)의 규정에 따라 판정하고, 하기 수학식 10에 따라 평균피부반응도(mean response rate)를 구하고, 그 결과를 표 21에 나타내었다. 피부반응의 평가기준 및 점수는 표 20에 나타내었다.

기호	점수	평가기준
-	0	무반응
	0.5	희미한 또는 가벼운 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
+++	3	심한 홍반 및 대수포, 가피 형성

시료	1시간 후			24시간 후			반응도(%) (n=20)
시료		+	++		+	++	반응도(%) (n=20)
제형 실시예1	7	-	-	2	-	-	3.75
제형 비교예5	10	3	-	8	1	-	10.83

상기 표 21의 결과와 같이 용암해수 녹차 추출물이 첨가된 실시예 4의 영양크림은 70% 에탄올 수용액 녹차 추출물이 첨가된 비교예 9의 영양크림과 비교하였을 때, 피부자극 완화 효과가 우수한 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

제형예 1 - 유연화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	시료 1 or 시료 2 or 시료 3	0.5
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

제형예 2 - 수렴화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	시료 1 or 시료 2 or 시료 3	0.5
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

제형예 3 - 영양화장수

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	시료 1 or 시료 2 or 시료 3	0.5
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

제형예 4 - 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	시료 1 or 시료 2 or 시료 3	0.5
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

제형예 5 - 팩

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	시료 1 or 시료 2 or 시료 3	0.3
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

Claims

탈염하지 아니한 용암해수, 및 탈염하지 아니한 해양 암반수에서 선택되는 1종 이상을 추출용매로 하여 제조한 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 스킨케어용 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 항산화, 미백, 주름개선, 피부 보습, 피부 톤 개선, 피부 자극 완화 및 피부 장벽 기능 회복 효과를 지니는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
청구항 1, 또는 청구항 2에 있어서, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유형, 유중수형, 또는 연고의 제형인 것을 특징으로 하는 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
삭제
삭제