KR102512376B1

KR102512376B1 - 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102512376B1
Application number: KR1020210020598A
Authority: KR
Inventors: 박창호; 이원주
Original assignee: 태남메디코스 주식회사; 태남생활건강주식회사
Priority date: 2021-02-16
Filing date: 2021-02-16
Publication date: 2023-03-22
Also published as: KR20220117020A

Abstract

본 발명은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물에 관한 것이다. 이러한 추출물은 다른 방식을 이용하여 얻은 추출물과 비교하여 유효 성분 함량이 현저히 증대되며 항균, 항산화, 항염증 및 피부 저자극을 비롯한 유용한 향장학적 약리 활성을 지니는 바, 여드름 피부를 비롯한 민감성 피부를 위한 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물을 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OBTAINED FROM HERBAL MIXTURE USING LOW-TEMPERATURE AGING PROCESS}

본 발명은 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물, 및 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 저온 숙성 공정을 거쳐 얻어진 본 발명의 추출물은 항균, 항산화, 항염증 및 피부 저자극을 비롯한 유용한 향장학적 약리 활성을 지니는 바, 여드름 피부를 비롯한 민감성 피부를 위한 화장품으로 사용될 수 있다.

화장품의 영역이 확대됨에 따라 화장품에 함유된 성분의 안전성 및 효능에 대한 소비자들의 관심이 높아지고 있다. 특히, 페녹시에탄올, 파라벤 등 피부에 유해한 것으로 알려진 일부 성분은 미국 환경 연구 단체인 EWC에 의해 중간 혹은 높은 위험도 등급 성분으로 분류되거나 각종 언론 보도 자료 등에서 그 유해성 논란이 지속되고 있어, 화장품의 소재 및 원료 물질에 대한 소비자들의 불안감이 커져 있다. 이에, 피부 유해 성분은 물론이거니와 유해성 논란이 있는 성분까지 모두 배제한 '저자극 화장품'이 출시되고 있는 상황이다.

더욱이, 현재 화장품 시장에서는 더마코스메틱(Dermacosmetic) 제품의 개발이 활발하게 이루어지고 있는데, 이는 소비자들의 화장품에 대한 인식 변화에 원인이 있는 것으로 분석된다. 더마코스메틱(Dermocosmetic)은 피부 과학을 뜻하는 '더마톨로지(Dermatology)'와 화장품을 뜻하는 '코스메틱(Cosmetic)'의 합성어로, 더마코스메틱 제품이란 화장품에 피부 과학의 전문성을 더한 제품을 일컫는다.

더마코스메틱 제품 시장이 매년 놀라운 속도로 성장하고 있는 이유는 소비자들의 피부가 민감해지면서 이를 해결하기 위한 방법으로 피부 과학의 연구 성과를 기초로 개발된 더마코스메틱 제품을 찾는 사람들이 늘어나고 있기 때문이다. 민감한 피부를 가진 여성들은 대부분 건조, 가려움 등의 증상 자체에 관심을 가지며 화장품 때문에 피부에 심각한 트러블이 생기는 경우도 많다. 이에, 건성, 지성, 중성, 복합성 등의 피부 타입과 무관하게 외부 환경에 예민하게 반응하는 민감성 피부를 위해 적극적인 대처를 하는 소비자들이 늘고 있고, 더마코스메틱 제품이 이러한 소비자들에게 각광을 받고 있다.

시장 조사 기관인 NPD 그룹이 발표한 '2017년 여성 스킨케어 소비자 동향 보고서'에 따르면, 여성 소비자들의 대략 50%가 화장품 구매 시 성분을 확인하고 구매한다고 한다. 국내 소비자들 역시 브랜드 인지도나 모델을 보고 제품을 구매하기보다는 화장품에 함유된 성분을 꼼꼼히 살펴본 후 구매하는 추세로 변하고 있다. 이에, 뷰티 업계에서는 천연 성분이 함유되어 있음을 강조한 제품을 출시하고 있으며, 이는 천연 성분을 포함시킴으로써 소비자들의 심리적 불안감을 덜어내고자 한 것이다.

화장품에 이용되는 천연물은 생체에 대해 약리학적으로 유효성을 나타내는 생약이 많으며, 그 실체는 여러 가지 화학물질의 혼합물이라 할 수 있다. 이들 생약 성분은 미용을 위한 장식뿐만 아니라 피부나 모발의 보호, 양모 등의 목적으로 응용되고 있다. 이렇게 약리학적 유효성을 지닌 생약 등의 '자연 성분'을 화장품의 소재로 이용하면, 소비자들에게 심리적 안정감을 줄뿐만 아니라 피부에도 실질적인 도움을 준다.

화장품의 소재로 생약 등을 이용하는 자연주의 경향에 따라, 생약을 포함한 식물성 원료에서 다양한 발효 원료에 이르기까지 다양한 천연 소재를 이용한 화장품이 개발되어 왔고, 이로 인해 천연 화장품, 한방 화장품 등의 전성 시대가 도래하게 되었다.

한편, 저온 숙성은 천연 재료를 저온으로 오랜 시간 숙성시키는 옛 선조들의 지혜에서 착안한 기술로, 화학 성분을 통해 만들어진 것이 아닌 천연의 유용 성분이 증대되게 하는 천연 발효 기술이다.

더욱이, 천연 재료를 저온 환경에서 발효시키는 기술과 관련하여, 저온 숙성 기술이 사용되는 경우, 미생물의 과도한 성장은 방지하지만 성장을 억제하지는 않아서 효능을 증대시킬 수 있다. 따라서, 저온 숙성 기술은 미생물로부터 분해 또는 합성을 통해 천연 재료에서 가장 활동적인 성분을 생성할 수 있으며 독성 물질을 최소화시킬 수 있으므로, 이렇게 얻어진 천연 재료는 화장품의 원료로 사용될 때 그 효능이 극대화될 수 있다.

본 발명자들은 소비자들에게 심리적 안정감을 줄뿐만 아니라 피부에도 실질적인 도움을 주는 화장료 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 당귀(Angelica gigas Nakai), 천궁(Cnidium officinale Makino), 작약(Paeonia lactiflora Pall), 숙지황(Rechmannia glutinosa Libosch) 및 황금(Scutellaria baicalensis Georgi)으로 이루어진 생약 혼합물에 저온 숙성 공정을 적용하여 얻은 추출물이 여드름 피부를 비롯한 민감성 피부에 적용된 경우 최적의 효능을 발휘함을 발견하였고, 이러한 발견을 기초로 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 여드름 피부를 비롯한 민감성 피부에 적용하기 위한 화장료 조성물의 향장학적 용도를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 피부 저자극성을 갖는 상기 화장료 조성물의 제형, 예를 들어, 페이셜 크림, 바디 로션 또는 바디 크림을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 그 밖의 목적은 이하의 설명을 통해 당업자에게 명백해질 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 일 측면에서, 본 발명은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물을 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

일 양태에 있어서, 상기 생약 혼합물은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금을 동일한 비율로 혼합함으로써 얻어질 수 있다.

다른 양태에 있어서, 상기 저온 숙성 공정은 상기 생약 혼합물을 용매로 2℃ 내지 6℃의 온도에서 5일 내지 10일 동안 숙성시키는 저온 숙성 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 저온 숙성 공정은 상기 생약 혼합물을 용매로 4℃의 온도에서 7일 동안 숙성시키는 저온 숙성 단계를 포함한다.

또 다른 양태에 있어서, 상기 저온 숙성 단계에서, 상기 용매는 정제수, 미네랄수 및 탄산수로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 용매는 탄산수이다.

또 다른 양태에 있어서, 상기 저온 숙성 단계에서, 상기 용매는 상기 생약 혼합물의 중량의 10배 양으로 사용될 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 상기 추출물은 상기 저온 숙성된 생약 혼합물을 열수(정제수) 또는 70% 에탄올로 3회 반복 추출함으로써 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출물은 용매로 탄산수를 사용하여 저온 숙성된 생약 혼합물을 70% 에탄올로 3회 반복 추출함으로써 얻어진다.

또 다른 양태에 있어서, 상기 화장료 조성물은 여드름 개선을 위해 사용될 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 상기 화장료 조성물은 페이셜 크림, 바디 로션 또는 바디 크림으로 제형화될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 우유 단백질 성분 및 바오밥나무씨 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 우유 단백질 성분은 바람직하게는 젖소, 더욱 바람직하게는 뉴질랜드 젖소의 초유 추출물이고, 상기 바오밥나무씨 성분은 바오밥나무씨 추출물일 수 있다.

본 발명에 따른 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물은 다른 방식을 이용하여 얻은 추출물과 비교하여 유효 성분 함량이 현저히 증대되며 항균, 항산화, 항염증 및 피부 저자극을 비롯한 유용한 향장학적 약리 활성을 지니는 바, 여드름 피부를 비롯한 민감성 피부를 위한 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 2의 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가와 관련하여 11가지 추출물에서 전자공여능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 2의 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가와 관련하여 11가지 추출물에서 ABTS 라디칼 소거능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 2의 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가와 관련하여 11가지 추출물 중 일부 추출물의 항균 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 2의 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가와 관련하여 11가지 추출물 중 일부 추출물에 대한 MTT assay에 의한 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 2의 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가와 관련하여 11가지 추출물 중 일부 추출물의 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 2의 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가와 관련하여 11가지 추출물 중 일부 추출물에 대한 Western blot을 통한 단백질 발현 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 2의 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가와 관련하여 11가지 추출물 중 일부 추출물에 대한 RT-PCR(reverse transcription PCR)을 통한 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 추출물 E-3에서 지표 물질을 확인하기 위한 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 화장품 제형(바디 로션)의 방부력 테스트 평가 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 화장품 제형(바디 크림)의 방부력 테스트 평가 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 화장품 제형(페이셜 크림)의 방부력 테스트 평가 결과를 나타낸다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물이 여드름 피부를 비롯한 민감성 피부에 적용된 경우 최적의 효능을 발휘한다는 발견에 기초하여 이루어진 것이다.

따라서, 일 측면에서, 본 발명은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물을 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

당귀(Angelica gigas Nakai)는 산형과에 속한 다년생 초본인 식물로서, 늦가을에 채취하여 수염 뿌리를 제거하고 수분이 약간 증발할 때를 기다렸다가 천천히 연기로 훈증하면서 건조하여 얻는다. 당귀는 부인병에 약으로 쓰이며, 진통, 진정, 항부정맥, 항혈전, 화혈, 정혈, 강장, 간기능보호 및 항암 작용이 있다.

천궁(Cnidium officinale Makino)은 산형과에 속한 다년생 초본으로서, 9월 내지 11월에 채취한 뿌리와 줄기를 건조하여 약재로 사용된다. 이 약재는 수면 작용, 혈압강하 작용, 혈관확장 작용 및 비타민 E 결핍증 치료 등의 약리 작용이 있으며 보혈 및 진통 작용이 뛰어난 것으로 전해지고 있다.

작약(Paeonia lactiflora Pall)은 미나리아제비과에 속한 다년생 초본인 적작약 또는 동속근연식물의 뿌리를 건조한 것으로서, 진경, 진통, 두통 및 항혈전 작용이 있어 치료 약재로 사용된다. 주성분인 페오닌플로린(peaoniflorin)과 안식향산, 정유, 지방산, 탄닌(tannin), 당, 트리테르페노이드(triterpenoid), β-시토스테롤(β-sitosterol) 등이 함유되어 있다.

숙지황(Rechmannia glutinosa Libosch)은 현삼과에 속하는 다년생 식물로서, 보약, 지혈약, 토혈, 변비, 성욕항진, 당뇨병 등에 사용되며 면역에 대한 효능이 높은 것으로 알려져 있다.

황금(Scutellaria baicalensis Georgi)은 꿀풀과의 여러해살이풀로서, 주성분이 플라보노이드(flavonoid)계 30여종의 화합물과 14종의 아미노산, 정유, 스티그마스테롤(stigmasterol)을 가지고 있으며, 항바이러스, 세포면역촉진, 항암 작용이 있다.

일 양태에 있어서, 상기 생약 혼합물은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금을 동일한 비율로 혼합한 것일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “정제수”는 이온교환수지를 통하여 정제한 물을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “미네랄수”는 미네랄(무기물)을 포함한 물을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “탄산수”는 탄산을 포함한 물을 의미한다.

또 다른 양태에 있어서, 상기 추출물은 상기 저온 숙성된 생약 혼합물을 열수(정제수) 또는 70% 에탄올로 3회 반복 추출함으로써 얻어질 수 있다.

이와 같이 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물은 (특히 저온 숙성 단계 후 70% 에탄올로 3회 반복 추출된 경우) 단순히 열수 또는 70% 에탄올만으로 얻은 추출물과 비교하여 총 폴리페놀 함량 측정 시 높은 폴리페놀 함량을 나타냈고(표 2 참조), 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 이용한 전자 공여능 측정 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 시 각각 높은 소거율을 나타냈다(하기 표 3 및 표 4 참조). 또한, 항균 활성 측정(paper disc 법), 세포 생존율 측정(MTT assay) 및 항염증 측정 시 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물은 (특히, 저온 숙성 단계에서 용매로 탄산수가 사용된 후, 정제수 또는 70% 에탄올로 추출된 경우) 유리한 효과를 나타냈다(하기 표 5 내지 표 9 참조).

특히, 저온 숙성 단계에서 용매로 탄산수가 사용된 후, 정제수 또는 70% 에탄올로 추출된 경우 얻어진 추출물의 생리 활성 물질 함량을 분석해 본 결과, decursin 함량이 가장 많이 검출되었으며, 다음으로 paeoniflorin, baicalein, ligustilice, luteolin 순으로 검출됨을 확인하였다. 이에 따라, 저온 숙성 과정에서 decursin 함량이 상대적으로 많이 추출되는 것으로 분석되어 상기 추출물의 주지표 성분을 decursin으로 확정하였다(하기 표 12 및 도 8 참조).

또한, 항균 활성 측정 시 나타난 유리한 효과로부터, 상기 화장료 조성물은 여드름 개선을 위해 사용될 수 있음을 알 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효 성분인 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물 이외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 향장학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림(페이셜 크림 및 바디 크림을 포함함), 로션(바디 로션을 포함함), 세정제, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이, 세안제, 목욕제 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 오일, 식물성 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화 아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

특히, 상기 화장료 조성물은 페이셜 크림, 바디 로션 또는 바디 크림으로 제형화될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 우유 단백질 성분 및 바오밥나무씨 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 우유 단백질 성분은 바람직하게는 젖소, 더욱 바람직하게는 뉴질랜드 젖소의 초유 추출물이고, 상기 바오밥나무씨 성분은 바오밥나무씨 추출물일 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명된다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

<참고예>

1. 시약

실험에 사용된 시약 중 MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), 그리스 시약(griess reagent), 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)는 시그마(Sigma, St. Louis, USA) 제품을 사용하였다. 세포 배양용 시약인 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 구입하였으며, 1차 항체, 유도형NO생성효소(Inducible NO synthase, iNOS)와 사이클로옥시지나제2(cyclooxygenase-2, COX-2)는 셀 시그널링(Cell Signaling, Boston, USA)사에서, 2차 항체 마우스 항-래빗 IgG HRP(mouse anti-rabbit IgG HRP) 는 산타크루즈 (Santacruz, CA, USA)사에서 구입하였다.

2. 균주 및 세포 배양

항균 활성 측정 실험에 사용된 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) KCTC 3314(P.acnes)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. P. acnes는 37℃, 혐기성 환경(GasPak EZ Anaerobic Container System(BD, USA) 이용)에서 배지(Difco TM Reinforced Clostridial Medium)를 이용하여 배양하였다.

마우스의 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받아 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, 25 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하여 배양하였다.

3. 방부력 테스트를 위한 미생물, 접종액 준비, 접종 방법 및 평가 기준

방부력 테스트에 사용된 5가지 균 중 세균인 E coli KCTC2571, P aeruginosa KCTC2513 및 S aureus sub Aureus KCTC1916, 효모인 Candida albicans KCTC7965, 및 곰팡이인 Aspergillus niger KCTC6317를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양 받아 사용하였다.

또한, 방부력 테스트에 사용하기 위한 접종액을 다음과 같이 준비하여 접종하였다. 먼저, potato dextrose broth/agar(PDA) 배지에서 배양된 C. albicans 균체는 접종루프를 이용하여 9 mL의 멸균을 한 생리식염수 0.85%에 접종하였고, 희석 농도는 1.0×10⁵ CFU/mL가 되도록 농도를 맞추어 진행하였다. PDA 배지에서 배양된 A. niger는 배지 안에 9 mL 멸균된 0.85% 생리식염수를 흘려보낸 후 접종루프를 이용하여 멸균된 0.85% 생리식염수 안으로 분산하였다. 균의 희석농도는 1.0×10⁵ CFU/mL가 되도록 농도를 맞추었다. Tryptic soy broth/agar(TSA)에서 배양된 P. aeruginosa, S. aureus 및 E. coli의 각 균체는 접종루프로 떠서 9 mL의 멸균을 한 생리식염수 0.85%에 접종하였다. 각 균의 희석농도는 1.0×10⁸ CFU/mL가 되도록 희석하고 McFarland 기준으로 3.0×10⁸ CFU/mL가 되도록 현탁액의 농도를 맞추었다. 상기의 방법으로 준비된 검체를 5.50×10⁵ CFU/mL로 접종한 균액에 첨가하였다. 또한 효모 및 곰팡이 배양액은 5.50×10⁵ CFU/mL가 되도록 접종을 한 후 각 실온에서 보관을 하였다. 균이 접종된 검체액은 접종 0일, 3일, 7일, 14일, 28일 동안 각각의 1 g씩 시료를 채취하여 배양배지에 멸균된 생리식염수로 10배씩 희석한 희석액을 만들었다. 각각의 균의 구체적인 배양 조건은 다음과 같다:

검체를 처리한 각각의 배지에서 방부력을 측정하기 위하여 측정된 생존균체수는 log reduction 수치로 환산하여 사멸률을 확인하였으며 7일 내로 사멸하여 14일 이내에 검출되지 않고 한 달 동안 방부력이 유지되면 방부력이 있음으로 판단하는 CTFA의 방부기준을 따라 검체액의 방부력을 분석하였다.

<제조예>

1. 저온 숙성 공정을 이용한 본 발명의 생약 혼합물의 추출물의 제조

옴니허브㈜(경북 영천 소재)에서 구입한 당귀(국산), 천궁(국산), 작약(국산), 숙지황(국산) 및 황금(국산) 약재를 물로 세척하여 음건 후 사용하였다. 상기 약재들을 동일한 비율로 혼합하여 총 50 g의 생약 혼합물(이하, "제조예의 생약 혼합물"라 함)을 제조하였다.

이렇게 제조한 생약 혼합물에 그의 10배 양의 용매(정제수, 미네랄수 또는 탄산수)를 가하여 4℃에서 7일 동안 저온 숙성시켰다. 상기 저온 숙성된 생약 혼합물을 원심 분리하여 상층액과 침전물을 분리하였다.

이어서, 상기 침전물을 정제수로 세척한 후 건조하였다. 건조된 침전물을 열수로 추출하거나 70% 에탄올로 추출하였다. 열수 추출의 경우, 건조된 침전물에 증류수(DW) 1,500 mL를 가하여 100℃에서 9시간 동안 추출하였고; 70% 에탄올 추출의 경우, 건조된 침전물에 그의 10배 양의 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 추출하였다. 이러한 추출 과정을 3회 반복하였다.

이렇게 열수 또는 70% 에탄올로 추출된 추출물을 여과하고, 농축한 후, 동결 건조하여 저온 숙성된 생약 혼합물의 추출물을 얻었다.

<비교예>

1. 열수 추출만에 의한 생약 혼합물의 추출물의 제조

상기 제조예의 생약 혼합물에 증류수 1,500 mL를 가하여 100℃에서 9시간 동안 추출하였다. 이어서, 생성된 추출물을 여과하고, 농축한 후, 동결 건조하여 열수로만 추출된 생약 혼합물의 추출물을 얻었다.

2. 에탄올 추출만에 의한 생약 혼합물의 추출물의 제조

상기 제조예의 생약 혼합물에 그의 10배 양의 70% 에탄올을 가하여 24시간 동안 추출하였다. 이를 3회 반복하였다. 이어서, 생성된 추출물을 여과하고, 농축한 후, 동결 건조하여 70% 에탄올로 추출된 생약 혼합물의 추출물을 얻었다.

상기 <제조예> 및 <비교예>에서 얻은 추출물들을 용매별로 구분하여 아래 표 1에 나타냈다.

[표 1] 용매별 추출물 명칭

실시예 1. 용매별 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정

상기 <제조예> 및 <비교예>에서 얻은 용매별 추출물, 즉, 추출물 A, B, C-1, C-2, C-3, D-1, D-2, D-3, E-1, E-2 및 E-3를 시료로 하여 이들의 총 폴리페놀 함량을 Folin-Denis법을 변형하여 측정하였다. 식물에 존재하는 폴리페놀 화합물은 항산화 등의 다양한 생리활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 각 추출물을 증류수에 희석하고, 희석 추출물 2 ml과 50% Folin-ciocalteu reagent (Sigma, USA) 2 ㎖를 혼합한 후, 실온에서 3분간 방치하였다. 이어서, 10% Na₂CO₃ 2 ㎖를 가하여 혼합한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이어서, 흡광도를 700 nm에서 측정하였다. 표준 물질로 Tannic acid를 사용하여 검량선(y=0.0361x-0.2441, R²=0.9991)을 작성한 후, 총 폴리페놀 함량을 100 g 당 mg tannic acid equivalent(TAE)로 표시하였다.

위와 같이 Tannic acid를 표준물질로 사용하여 11가지 추출물에서 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과를 표 2에 나타냈다.

[표 2] 총 폴리페놀 함량 측정

표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 추출물 A 및 B는 각각 109.51±0.04 mg TAE/100 g 및 115.75±0.37 mg TAE/100 g의 폴리페놀 함량을 나타냈고; 추출물 C-1, C-2 및 C-3는 각각 81.74±0.39 mg TAE/100 g, 97.64±0.35 mg TAE/100 g 및 280.90±0.23 mg TAE/100 g의 폴리페놀 함량을 나타냈고; D-1, D-2 및 D-3는 각각 76.90±0.59 mg TAE/100 g, 121.95±0.53 mg TAE/100 g 및 284.35±0.45 mg TAE/100 g의 폴리페놀 함량을 나타냈고; E-1, E-2 및 E-3는 각각 90.24±0.70 mg TAE/100 g, 121.58±0.34 mg TAE/100 g 및 474.76±0.45 mg TAE/100 g의 함량을 나타냈다.

이러한 결과로부터, 탄산수 E-3(탄산수를 가하여 저온 숙성시킨 제조예의 생약 혼합물의 70% 에탄올 추출물)의 폴리페놀 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다.

실시예 2. 용매별 추출물의 in vitro 효능 평가

1) 항산화 활성 측정

가) 전자 공여능 측정

전자 공여능 측정 실험을 다음과 같이 수행하였다. 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 60 ㎕와 농도별 추출물을 120 ㎕씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로 비타민 C(VIT-C)를 사용하였다. 전자 공여능을 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타냈다(하기 식 (1) 참조).

(1)

위와 같이 11가지 추출물에서 전자공여능을 확인한 결과를 하기 표 3 및 도 1에 나타냈다.

[표 3] 전자 공여능 측정 결과표

상기 용매별 추출물을 1,000 μg/ml 농도에서 측정한 결과, 표 3 및 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, A 및 B는 각각 44% 및 67% 소거율을 나타냈고; 정제수 C-1, C-2 및 C-3는 각각 22%, 44% 및 96% 소거율을 나타냈고; 미네랄 D-1, D-2 및 D-3는 각각 9%, 58% 및 95% 소거율을 나타냈고; 탄산수 E-1, E-2 및 E-3는 각각 16%, 77% 및 94% 소거율을 나타냈다.

결과적으로, 모든 용매(정제수, 미네랄수 및 탄산수)를 사용하여 저온 숙성된 에탄올 추출물, 즉, 정제수 C-3, 미네랄 D-3 및 탄산수 E-3는 1,000 μg/ml 농도에서 94% 이상의 소거율을 나타내는 것으로 확인되었는 바, 우수한 항산화 활성을 갖는다.

나) ABTS 라디칼 소거 활성 측정

ABTS 라디칼을 이용한 항산화 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 140 mM potassium persulfate를 혼합하고, 실온에서 16 내지 18시간 동안 보관하여 ABTS+를 형성시킨 후, 에탄올로 희석시켜 사용하였다. ABTS+ 3 ml에 시료 150 ㎕를 가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로 Vitamin C(VIT-C)를 사용하였다.

ABTS 라디칼 소거능은 하기 식 (2)에 따라 계산하였다:

(2)

위와 같이 11가지 추출물에서 ABTS 라디칼 소거능을 확인한 결과를 하기 표 4 및 도 2에 나타냈다.

[표 4] ABTS 라디칼 소거능 측정 결과표

상기 용매별 추출물을 1,000 μg/ml 농도에서 측정한 결과, 표 4 및 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, A 및 B는 각각 35% 및 50% 소거율을 나타냈고; 정제수 C-1, C-2 및 C-3는 각각 15%, 47% 및 70% 소거율을 나타냈고; 미네랄 D-1, D-2 및 D-3는 각각 14%, 34% 및 74% 소거율을 나타냈고; 탄산수 E-1, E-2 및 E-3는 각각 14%, 37% 및 84% 소거율을 나타냈다.

결과적으로, 정제수, 미네랄수 및 탄산수를 이용한 저온 숙성 공정을 거친 추출물 중에서 탄산수 E-3가 가장 우수한 ABTS 라디칼 소거율(84%)을 나타내는 것으로 확인되었다.

2) 항균 활성 측정(paper disc 법)

여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes(P. acnes)을 이용하여 상기 용매별 추출물 중 정제수 C-2 및 C-3, 미네랄수 D-2 및 D-3, 및 탄산수 E-2 및 E-3 가 상기 균에 대해 나타내는 항균 활성을 다음과 같이 측정하였다.

먼저, 평판 배지에 배양한 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10 ml에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10 ml에 균액을 0.1 ml 접종하여 5시간 본 배양하였다. 이를 평판 배지 1개당 균수를 약 10⁷ cells이 되게 접종하고 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 필터 페이퍼 디스크(filter paper disc, 8 mm, Tokyo, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 0.05 ml/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시키고 37℃에서 24시간 배양하여 디스크 주위의 클리어 존(Clear zone(mm))의 직경을 측정하여 항균 활성을 확인하였다.

위와 같이 항균 활성을 측정한 결과를 하기 표 5 내지 표 7 및 도 3에 나타냈다.

[표 5] 항균 활성 측정(정제수 저온 숙성)

[표 6] 항균 활성 측정(미네랄수 저온 숙성)

[표 7] 항균 활성 측정(탄산수 저온 숙성)

표 7 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 탄산수 E-2 및 E-3 모두 P. acnes에 대한 항균력을 가지고 있는 것을 확인하였으며, 10 mg/ml 이상의 농도로 사용된 경우 각각 13 mm 이상 및 15 mm 이상의 저해환을 형성함을 확인하였다.

3) 세포 독성 측정(MTT assay) 및 항염증 활성 측정

i) 세포 배양

본 실험에 이용한 대식세포인 RAW 264.7의 배양을 위해 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin(100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 상기 대식세포를 37℃ 및 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

ii) MTT assay에 의한 세포 생존율 측정 및 결과

세포 생존율 측정은 상기 항목 i)에서 배양된 RAW 264.7 세포를 96-well plate에 1×104 cells/well이 되도록 100 μl를 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 이때, 총 폴리페놀 함량이 높고 항산화 활성이 우수한 탄산수 E-2 및 E-3를 시료로 사용하였다. 상기 배양물에 2.5 mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 40 ㎕를 첨가하여 3시간 배양하였다. 이어서, 배양액을 제거하고, 각 well당 DMSO 100 ㎕를 가하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 이어서, ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타냈다.

위와 같이 수행된 MTT assay에 의한 세포 생존율 측정 결과를 표 8 및 도 4에 나타냈다.

[표 8] 세포 생존율 측정 결과표

Raw 264.7 세포에 대해 탄산수 E-2 및 E-3를 농도별로 처리한 결과, 표 8 및 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 500 μg/ml의 농도에서 탄산수 E-2 및 E-3 둘 모두 90% 이상의 생존율을 나타냈다.

iii) Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정

상기 항목 i)에서 배양된 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂의 형태로 측정하였다.

구체적으로, 96-well plate에 RAW 264.7 세포를 1×10⁶ cells/well이 되도록 분주하였다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하고, LPS 10 μg/ml을 처리하였다(normal은 제외함). 2시간 후, 농도별로 조제한 시료 용액(탄산수 E-2 및 E-3)를 처리하여 24시간 동안 배양하고, 상층액을 얻었다. 이어서, 동량의 griess 시약을 첨가하여 96-well plate에서 10분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. NO 억제 활성을 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타냈다.

위와 같이 수행된 NO 생성 억제 활성 측정의 결과를 표 9 및 도 5에 나타냈다.

[표 9] NO 생성 억제 활성 측정 결과표

표 9 및 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, LPS를 처리한 군(Control)을 100%로 하였을 때 탄산수 E-2 및 E-3는 농도 의존적으로 NO 생성량을 감소시켰다.

iv) Western blot을 통한 단백질 발현 측정

염증 매개 인자인 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현량에 미치는 탄산수 E-2 및 E-3의 영향을 알아보기 위해, 다음과 같이 실험을 수행하였다.

상기 항목 i)에서 배양된 RAW 264.7 세포를 10 mm tissue culture dish에 시딩 후 24시간 동안 배양하였다. 농도별로 조제한 시료 용액(탄산수 E-2 및 E-3)를 처리한 배지에서 24시간 동안 배양한 후, Radio-immunoprecipitation assay(RIPA) buffer에 complete mini 1 tab을 가한 100 ㎕로 용해하였다. 이어서, 4℃ 및 13,200 rpm에서 원심 분리하여 얻은 상층액을 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE 상에서 전기영동하여 분리한 후, 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮겼다. blocking buffer(TBST(tris-buffered saline and tween 20) 중의 5% skim milk)을 제조하여 실온에서 1시간 동안 blocking을 수행하였다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 밤새 정치시킨 후, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하였다. 2차 항체를 희석하여 실온에서 1시간 30분 동안 반응시키고, 3회 세척한 후, 밴드를 확인 및 정량하였다.

위와 같이 수행된 단백질 발현 측정의 결과를 도 6에 나타냈다. 이때, house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.

도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, LPS 단독 처리군에서는 각 단백질의 발현량이 증가한 것으로 나타났고; 100 μg/ml의 농도로 처리한 경우, 탄산수 E-2(iNOS 및 COX-2의 단백질 발현량은 각각 92% 및 94%임)보다 탄산수 E-3(iNOS 및 COX-2의 단백질 발현량은 각각 34% 및 60%임)가 우수한 단백질 발현 억제를 나타냈다.

v) RT-PCR(reverse transcription PCR)을 통한 mRNA 발현 측정

염증 매개 인자인 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량에 미치는 탄산수 E-2 및 E-3의 영향을 알아보기 위해, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 다음과 같이 실시하였다. 이때, house keeping gene인 GAPDH을 positive control로 사용하였다.

[표 10] RT-PCR에 사용된 프라이머의 서열

실험에 사용된 프라이머의 서열을 표 10에 나타냈다. GAPDH 및 iNOS의 경우에는 96℃에서 2분, 96℃에서 10초, 64℃에서30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles)의 사이클링 조건으로 PCR을 수행하고, COX-2의 경우에는 96℃에서 2분, 94℃에서 10초, 51℃에서 30초, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분(40 cycles)의 사이클링 조건으로 PCR을 수행하였다. 이어서, 0.002% ethidium bromide가 첨가된 1.5% agarose gel 상에서 100 Ｖ에서 20분 동안 전기영동한 후, 밴드를 확인하여 분석 및 정량하였다.

그 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, LPS 단독 처리군에서는 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량이 증가한 것으로 나타났고; 100 μg/ml의 농도로 처리한 경우, 탄산수 E-2(iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량은 각각 29% 및 57%임)와 탄산수 E-3(iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량은 각각 19% 및 28%임)가 모두 우수한 mRNA 발현 억제를 나타냈다.

실시예 3 탄산수 E-3의 생리활성 물질 함량 분석

추출물에 대한 함유된 성분을 분석하기 위해 먼저 전문정보와 논문을 이용하여 문헌 조사를 수행한 후 추출물 성분과 표준물질의 분석 데이터를 수집하였으며, 생약 혼합물 각각의 대표 성분을 취합하여 선정하였다(문헌[Jeong SY, Kim HM, Lee KH, Kim KY, Huang DS, Kim JH, Seong RS (2015) Quantitative analysis of marker compounds in Angelica gigas, Angelica sinensis, and Angelica acutiloba by HPLC/DAD. Chem Pharm Bull 63:504-511 https://doi.org/10.1248/cpb.c15-00081]; 문헌[H. Hong, J.C. An, J.F. de La Cruz, S.G. HwangCnidium officinale Makino extract induces apoptosis through activation of caspase-3 and p53 in human liver cancer HepG2 cells Exp Ther Med, 14 (2017), pp. 3191-3197]; 문헌[Wu, M. and Gu, Z. (2009) Screening of Bioactive Compounds from Moutan Cortex and Their Anti-Inflammatory Activities in Rat Synoviocytes. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 6, 57-63]; 및 문헌[L Yu, A-G Wu, V-K-W Wong, L-Q Qu, N Zhang, D-L Qin, W Zeng, B Tang, H-M Wang, Q Wang* and B-Y-K Law*. The new application of UHPLC-DAD-TOF/MS in identification of inhibitors on beta-amyloid fibrillation from Scutellaria baicalensis. Front Pharmacol. 2019;10:194]을 참조하였음).

분석 조건은 다음과 같았다. HPLC 분석을 위해 waters ACQUITY H-Class Liquid Chromatograph를 사용하고, column은 waters BEH C18을 사용하고, 이동상은 acetonitrile과 물을 용매 기울기로 하여 1.0 ml/min의 유속에서 주입량 10 ul, column 온도 30℃, UV 흡광도 280 nm에서 실험하였다(표 11 참조). 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성한 결과, 0.9998 이상의 상관 계수 값이 확보되었다.

[표 11] HPLC 조건

위 조건으로 추출물 E-3를 분석한 결과, decursin 함량이 가장 많이 검출되었고, 다음으로 paeoniflorin, baicalein, ligustilice, luteolin 순으로 검출되는 것으로 확인되었다(표 12 및 도 8 참조). 결과적으로, 저온 숙성 과정에서 decursin 함량이 상대적으로 많이 추출된 것으로 분석되었는 바, 본 발명의 저온 숙성된 생약 혼합물 추출물의 주된 지표 성분을 decursin으로 확정하였다.

[표 12]

실시예 4. 추출물 E-3를 포함하는 화장품 제형의 제조 및 이의 효능 확인

1) 추출물 E-3를 포함하는 바디 로션(이하, “시험 바디 로션” 또는 간단히 “제품”이라 함) 및 바디 크림(이하, “시험 바디 크림” 또는 간단히 “제품”이라 함)의 제조

5가지 성분(미네랄 오일, 실리콘 오일, PEG, 색소 및 인공향)이 없고, 무향이며, EWG 그린 등급인, 상기 추출물 E-3(2%(w/w)), 젖소 초유 성분 및 바오밥나무씨 성분을 함유하는 시험 바디 로션 및 시험 바디 크림을 하기 표 13 및 표 14에 제시된 포뮬러에 기초하여 각각 제조하였다.

[표 13] 시험 바디 로션 포뮬러

[표 14] 시험 바디 크림 포뮬러

이렇게 제조된 pH 약산성이고 피부 저자극성인 시험 바디 로션 및 시험 바디 크림은 예민한 피부에 대한 피부 자극 완화 및 피부 진정 효과가 뛰어난 바, 피부 자극 및 피부 스트레스를 완화하고 진정시켜 건강한 피부를 완성시킬 수 있다. 또한, 이러한 바디 로션 및 바디 크림은 끈적임 없이 피부에 빠르게 흡수되어 건조하거나 민감한 피부에 수분과 영양을 공급함과 동시에 깊은 보습과 진정 효과로 피부를 편안하게 만들어 줄 수 있다. 이상 설명한 바와 같은 상기 시험 바디 로션 및 시험 바디 크림의 효능은 하기 기술되는 평가 결과로부터 자명하게 알 수 있는 사항이다.

2) 추출물 E-3를 포함하는 페이셜 크림(이하, “시험 페이셜 크림” 또는 간단히 “제품”이라 함)의 제조

5가지 성분(미네랄 오일, 실리콘 오일, PEG, 색소 및 인공향)이 없고, 무향이며, EWG 그린 등급인, 상기 추출물 E-3(2%(w/w)), 젖소 초유 성분 및 바오밥나무씨 성분을 함유하는 시험 페이셜 크림을 하기 표 15에 제시된 포뮬러에 기초하여 제조하였다.

[표 15] 시험 페이셜 크림 포뮬러

이렇게 제조된 pH 약산성이고 피부 저자극성인 시험 페이셜 크림은 예민한 피부에 대한 피부 자극 완화 및 피부 진정 효과가 뛰어난 바, 피부 자극 및 피부 스트레스를 완화하고 진정시켜 건강한 피부를 완성시킬 수 있다. 또한, 이 시험 페이셜 크림은 끈적임 없이 피부에 빠르게 흡수되어 건조하거나 민감한 피부에 수분과 영양을 공급함과 동시에 깊은 보습과 진정 효과로 피부를 편안하게 만들어 줄 수 있다. 이상 설명한 바와 같은 상기 시험 페이셜 크림의 효능은 하기 기술되는 다양한 성능 평가 결과로부터 자명하게 알 수 있는 사항이다.

3) 시험 바디 로션, 시험 바디 크림 및 시험 페이셜 크림의 다양한 성능 평가

가) 방부력 테스트(Challenge Test) 평가

시험의 객관성과 재현성을 확보하기 위하여 방부력 테스트를 수행하였는데, 방부력 테스트는 화장품 제형에 미생물을 접종하여 그 사멸 여부를 확인하는 것으로서, CTFA 시험법을 기준으로 하여 시험하였다. 방부력 테스트를 위해 EU 회원국의 정식적인 수집 균주에 유래하는 미생물을 시험 균주로 사용하였으며, 시험 균주는 세균 3종과 진균 2종을 사용하였다. 실험에서 사용한 균주 정보는 다음과 같았다:

① Bacteria : E coli KCTC2571, P aeruginosa KCTC2513, S aureus sub Aureus KCTC1916

② Fungi : Candida albicans KCTC7965 , Aspergillus niger KCTC6317

상기 각각의 제형(시험 바디 로션, 시험 바디 크림 및 시험 페이셜 크림)의 방부력 테스트 평가 결과를 하기 표 16 내지 표 18 및 도 9 내지 도 11에 나타냈다.

[표 16] 시험 바디 로션의 방부력 테스트 평가 결과

[표 17] 시험 바디 크림의 방부력 테스트 평가 결과

[표 18] 시험 페이셜 크림의 방부력 테스트 평가 결과

표 16 내지 표 18 및 도 9 내지 도 11로부터 알 수 있는 바와 같이, 각각의 제형은 1일차 이후부터 세균이 검출되지 않았고, 3일차 이후부터는 세균 및 진균 모두가 검출되지 않았다.

나) 피부첩포 안전성 평가

상기 각각의 제형(시험 페이셜 크림, 시험 바디 크림 및 시험 바디 로션)의 안전성을 알아보기 위하여, 건강한 성인 30명(평균 연령: 37.0±9.6세)을 시험 대상자로 하여 세명대학교 화장품임상연구지원센터 표준운영절차에 따라 IQ Ultra를 이용하여 피부 첩포 시험을 실시하였다.

IQ Ultra에 각각의 제형 25 ml를 적하하였다. 첩포는 24시간 동안 부착하였고, 패치 제거 30분 후(1차), 패치 제거 24시간 후(2차), 패치 제거 48시간 후(3차)에 2명의 전문가에 의하여 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group, ICDRG)의 판정 기준에 따라 자극지수를 계산하고 자극도를 판정하였다. 그 결과를 표 19 내지 표 21에 나타냈다.

[표 19] 시험 페이셜 크림의 피부 자극 판정 결과

[표 20] 시험 바디 크림의 피부 자극 판정 결과

[표 21] 시험 바디 로션의 피부 자극 판정 결과

표 19 내지 표 21로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 시험에 사용된 시험 이셜 크림, 시험 바디 크림 및 시험 바디 로션은 모두 피부에 무자극성인 것으로 판정되었다.

다) 피부 자극 평가

(i) 시험 페이셜 크림

상기 각각의 제형(시험 페이셜 크림, 시험 바디 크림 및 시험 바디 로션)의 피부 진정(붉은기 완화) 효과를 알아보기 위하여, 건강한 성인 20명을 시험 대상자로 하여 세명대학교 화장품임상연구지원센터 표준운영절차에 따라 시험 대상자의 전완부 상에 외부 자극(SLS에 의한 자극)에 의해 유발시킨 붉은기를 완화시키는 효과(피부 진정 효과)를 평가하였다.

시험 대상자로 하여금 각자의 전완부를 세정한 후 각각의 제형을 1일 2회(아침 및 저녁) 적당량 덜어 도포하게 하였다. 평가는 아래와 같이 기기적 평가 및 피부 자극 평가 둘 모두를 고려하여 이루어졌다:

- 기기적 평가: 색차계(Spectrophotometer CM-2600D, Minolta, Japan)를 이용한 *a value 측정; 및 Digital camera(EOS 70D, Canon, Japan)를 이용한 사진 촬영.

- 피부 자극 평가: 매 방문 시 각 제형을 사용한 부위에 대한 연구자 육안 평가 결과와 시험 대상자 설문 결과를 종합하여 연구자가 평가함.

위와 같이 이루어진 평가 결과를 표 22 내지 표 25에 나타냈다.

[표 22] 시험 페이셜 크림 사용 부위의 *a value 측정값 및 붉은기 완화율(%)

[표 23] 미사용 부위의 *a value 측정값 및 붉은기 완화율(%)

[표 24] 두 군(시험 페이셜 크림 사용군 및 미사용군)간 통계적 분석 결과

[표 25] 시험 대상자의 피부 자극 평가 결과

표 22 내지 표 24로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 페이셜 크림 사용 부위는 미사용 부위와 비교하여 차이가 있었고(p<0.05), 시험 페이셜 크림 사용 부위의 붉은기 완화율(%)은 24시간 후에 -9.80%, 48시간 후에 -6.09%, 및 72시간 후에 7.95%로 나타났다. 또한, 표 25로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 대상자 전원에서 시험 페이셜 크림에 대한 특별한 피부 이상 반응은 관찰되지 않았다. 따라서, 시험 페이셜 크림은 외부 자극에 의해 유발된 붉은기를 완화시키는 피부 진정 효과가 있는 것으로 판단된다.

(ii) 시험 바디 크림

상기 시험 바디 크림의 피부 진정(붉은기 완화) 효과를 알아보기 위하여, 건강한 성인 20명을 시험 대상자로 하여 세명대학교 화장품임상연구지원센터 표준운영절차에 따라 시험 대상자의 전완부 상에 외부 자극(SLS에 의한 자극)에 의해 유발시킨 붉은기를 완화시키는 효과(피부 진정 효과)를 평가하였다.

위와 같이 이루어진 평가 결과를 표 26 내지 표 29에 나타냈다.

[표 26] 시험 바디 크림 사용 부위의 *a value 측정값 및 붉은기 완화율(%)

[표 27] 미사용 부위의 *a value 측정값 및 붉은기 완화율(%)

[표 28] 두 군(시험 바디 크림 사용군 및 미사용군)간 통계적 분석 결과

[표 29] 시험 대상자의 피부 자극 평가 결과

표 26 내지 표 28로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 바디 크림 사용 부위는 미사용 부위와 비교하여 차이가 있었고(p<0.05), 시험 바디 크림 사용 부위의 붉은기 완화율(%)은 24시간 후에 -8.74%, 48시간 후에 -3.54%, 및 72시간 후에 10.00%로 나타났다. 또한, 표 29로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 대상자 전원에서 시험 바디 크림에 대한 특별한 피부 이상 반응은 관찰되지 않았다. 따라서, 시험 바디 크림은 외부 자극에 의해 유발된 붉은기를 완화시키는 피부 진정 효과가 있는 것으로 판단된다.

(iii) 시험 바디 로션

상기 시험 바디 로션의 피부 진정(붉은기 완화) 효과를 알아보기 위하여, 건강한 성인 20명을 시험 대상자로 하여 세명대학교 화장품임상연구지원센터 표준운영절차에 따라 시험 대상자의 전완부 상에 외부 자극(SLS에 의한 자극)에 의해 유발시킨 붉은기를 완화시키는 효과(피부 진정 효과)를 평가하였다.

위와 같이 이루어진 평가 결과를 표 30 내지 표 33에 나타냈다.

[표 30] 시험 바디 로션 사용 부위의 *a value 측정값 및 붉은기 완화율(%)

[표 31] 미사용 부위의 *a value 측정값 및 붉은기 완화율(%)

[표 32] 두 군(시험 바디 로션 사용군 및 미사용군)간 통계적 분석 결과

[표 33] 시험 대상자의 피부 자극 평가 결과

표 30 내지 표 32로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 바디 로션 사용 부위는 미사용 부위와 비교하여 차이가 있었고(p<0.05), 시험 바디 로션 사용 부위의 붉은기 완화율(%)은 24시간 후에 -8.62%, 48시간 후에 -0.16%, 및 72시간 후에 8.75%로 나타났다. 또한, 표 33으로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 대상자 전원에서 시험 바디 로션에 대한 특별한 피부 이상 반응은 관찰되지 않았다. 따라서, 시험 바디 로션은 외부 자극에 의해 유발된 붉은기를 완화시키는 피부 진정 효과가 있는 것으로 판단된다.

Claims

당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금으로 이루어진 생약 혼합물로부터 저온 숙성 공정을 이용하여 얻은 추출물을 포함하고,
상기 저온 숙성 공정은 상기 생약 혼합물에 용매를 가하여 2℃ 내지 6℃의 온도에서 5일 내지 10일 동안 숙성시키는 저온 숙성 단계를 포함하고,
상기 추출물은 상기 저온 숙성 단계를 거친 생약 혼합물을 열수 또는 70% 에탄올로 3회 반복 추출함으로써 얻어진 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 생약 혼합물은 당귀, 천궁, 작약, 숙지황 및 황금을 동일한 비율로 혼합함으로써 얻어진 것인, 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 저온 숙성 공정은 상기 생약 혼합물에 용매를 가하여 4℃의 온도에서 7일 동안 숙성시키는 저온 숙성 단계를 포함하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 용매는 정제수, 미네랄수 및 탄산수로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 용매는 탄산수인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 용매는 상기 생약 혼합물의 중량의 10배 양으로 사용되는, 화장료 조성물.
삭제
제6항에 있어서, 상기 추출물은 상기 저온 숙성 단계를 거친 생약 혼합물을 70% 에탄올로 3회 반복 추출함으로써 얻어진 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 여드름 개선을 위해 사용되는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 페이셜 크림, 바디 로션 또는 바디 크림으로 제형화되는, 화장료 조성물.
제11항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 우유 단백질 성분 및 바오밥나무씨 성분을 추가로 포함하는, 화장료 조성물.