KR101704874B1

KR101704874B1 - 노근, 함초 및, 매실 추출물을 함유하는 항산화 및 미백 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101704874B1
Application number: KR1020140107288A
Authority: KR
Inventors: 유민정; 김수관; 이숙영; 김세율
Original assignee: 유민정
Priority date: 2014-08-18
Filing date: 2014-08-18
Publication date: 2017-02-09
Also published as: KR20160021676A

Abstract

본 발명은 노근, 함초 및, 매실 추출물을 함유하는 항산화 및 미백 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 항산화 및 미백 화장료 조성물은 노근의 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트 추출 분획물과, 함초의 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트 또는 부탄올 추출 분획물과, 매실의 에탄올 추출 동결 건조물의 혼합물을 포함하며, 우수한 항산화 및 미백 활성 효능을 나타내고, 특히 이들의 에탄올 추출의 동결 건조물에 대한 특정한 추출 용매 분획을 이용하는 것에 의하여 항산화에 의한 우수한 피부노화 및 주름 방지와 피부 미백 효과를 나타낸다.

Description

노근, 함초 및, 매실 추출물을 함유하는 항산화 및 미백 화장료 조성물{Cosmetic Compositions with Whitening and Anti-oxidative Effect Comprising of Phragmitis Rhizoma, Salicomia herbacea L. and Prunus mume}

본 발명은 노근, 함초 및, 매실 추출물을 함유하는 항산화 및 미백 화장료 조성물에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 항산화 및 미백 활성 효능이 있는 노근, 함초 및 매실에 대한 특정 용매 분획 추출물의 혼합물을 이용한 효과적인 항산화 및 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

근래 들어 사회 전반의 웰빙 붐에 따라 합성물에 의한 피부안전성에 대한 우려감 증대 및 천연성분에 의한 피부건강 증진 욕구 증가 추세에 따라 천연 한약재를 원료로 하는 한의학적 효능에 근거한 식물성 천연 화장품인 한방화장품에 대한 선호도가 높아지는 추세에 있다.

우리나라의 순천만에는 다양한 염생식물 및 수생식물과 그 외 육생 식물이 자생 또는 재배되고 있으며, 그 중에서도 갈대, 함초 및, 매실은 순천 지역의 대표적인 특산식물로서 독성이 없어 식용이 가능하고 그 약리활성에 대한 연구가 진행되고 있어, 그 활용성과 가치에 대한 새로운 평가가 이루어지고 있다.

순천지역의 특산식물인 갈대(Phragmitis commuinis Thin)는 키가 큰 여러해살이풀로 한약방에서 약재로 이용되고 있는 뿌리인 노근(Phragmitis Rhizoma)은 열을 내리게 하고 진액을 생기게 하여 구역질을 멎게 하는 효능이 있고, 열병에 의한 구토, 식도암, 폐의 농양을 치료하고 복어독을 해독하는데 사용되어왔다. 노근에는 코익솔(coixol) 및 비타민 C가 함유되어 있기 때문에 자외선 차단작용을 하고 멜라닌 세포의 증식을 촉진하여 두발을 검고 윤기 있게 하며, 미백작용을 하는 것으로 보고되어 있다. 노근의 생리활성 연구로는 추출물을 대상으로 혈청 내 포도당(glucose), 인슐린(insulin) 및 지질 합성에 미치는 영향이 보고되어 있고, 노근의 근경을 메탄올로 추출한 추출물은 혈중 콜레스테롤(Cholesterol)과 포도당 수치를 낮추는 효과가 있음이 보고되어 있다.

한편, 함초(Salicomia herbacea L.)는 명아주과에 속하는 일년초로서 잎과 줄기가 통통하고 마디가 불룩하게 튀어나와있어 퉁퉁마디라고도 불리며, 고혈압과 당뇨에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 여드름 원인균인 P.acnes의 증식을 억제하는 것으로 보고되어 있으며, 항산화 작용과 티로시나제(Tyrosinase) 활성 저해능이 있는 것으로 보고되어 있다. 피부미용과 관련하여 함초는 여드름균 증식 억제, DPPH 라디칼 소거능 및 항산화 활성, 티로시나제 저해능, 피부수렴 효과, 멜라노마(melanoma) 세포억제 등의 효과를 가지는 것으로 알려져 있으며, 그 약리작용으로는 여성의 냉대하증과 변비, 비만증에 효과적이며, 위의 기능을 촉진하고 신장염, 간염 및 고혈압, 저혈압, 빈혈증과 혈당강하, 갑상선 기능 향상 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

또한 알칼리성 식품인 매실(Prunus mume)은 예로부터 술, 차, 장아찌 등과 같은 각종 식품원으로 사용되어 왔으며, 특히 말린 매실은 오매라 하여 한방에서는 해독 및 구충 등에, 그리고 뿌리, 잎, 꽃, 미숙 과일은 건위, 지갈, 가담, 해독, 주독, 소독 등의 효과가 있는 것으로 알려져 한방 약재로서 널리 이용되어 왔다. 매실은 구연산, 사과산, 호박산, 주석산 등 유기산이 풍부하여 신 맛을 내고 위장 기능을 활발하게 하며 소화를 촉진하여 식욕을 증진시키고 피로를 풀어줄 뿐 만 아니라 변비로 거칠어진 피부에도 좋은 것으로 알려져 있으며, 매실의 유기산은 항균, 살균력이 있어 각종 식중독균에 대한 살균 효과가 있으므로 식중독 사고가 다발하는 여름에 먹으면 효과적인 것으로 보고되어 있다.

매실에 대한 효능에 관한 연구로는 혈중 유산농도 및 혈청 지질에 미치는 영향, 간장 장애 및 당뇨병에 미치는 영향, 식중독 유산 세균의 증식에 미치는 영향 등이 보고되어 있으며, 생체 외(in vitro)에서 매실추출물의 항산화활성 물질에 관한 연구가 보고되어 있다. 또한 매실은 생체의 저항성 및 지구력을 향상 시키고, 항암 능력 및 생체기능을 증진시키는 것으로 보고되어 있으며, 매실의 구연산(citric acid) 등 유기산과 무기성분은 체내에서 위액 분비를 촉진시켜 식욕을 돋우며 소화흡수에 도움을 주고 간장 활동을 왕성하게 하며 신진대사를 원활히 하여 피로 회복에 큰 효과가 있다고 보고된 바 있다. 최근 항산화제 역할을 하는 것으로 알려진 구연산이나 베타카로틴, 비타민(vitamin) E 등이 매실에 풍부하여 노화, 항암 등 성인병에 유효한 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 매실은 해독작용이 뛰어나고 피크린산에 의한 독성물질 분해 작용도 있는 것으로 보고되어 있다.

한편, 피부의 노화는 내인적 노화 및 외인적 노화에 의해 진행되는 것으로 알려져 있으며, 내인적 노화는 노령화에 따른 피부 생리적 기능의 저하에 의한 자연적인 노화 현상이고 외인적 노화는 자외선, 활성 산소종(Reactive oxygen species) 및, 스트레스 등과 같은 외인적 요인에 의해 발생하는 노화 현상으로서, 피부 노화의 임상학적 특징은 피부탄력 감소, 피부결의 거칠어짐, 주름, 그리고 색소 침착이다.

피부의 노화 기작을 규명하기 위한 다양한 연구에 따르면, 피부가 온도의 변화, 습도의 저하, 빛, 또는 바람 등과 같은 외인적 요소에 의해 건조한 상태가 지속되면, 피부 생리 활성이 저하에 따른 노화가 촉진되는 것으로 알려져 있다.

또한 생체 내에서 빛이나 각종 외인성 화합물 등에 의해 과잉 생성된 유해 활성산소종 또는 자유 라디칼은 체내의 산화 작용에 의해 과산화 지질이 생성되어 피부를 구성하는 지질, 단백질, 핵산 등과 샅은 생체 물질들을 변성시켜 유발하게 되어 노화의 원인 또는 발암의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 항산화제는 화장료에 광범위하게 이용되고 있으며, 화장료에 첨가되는 항산화제는 화장품의 유연제 원료로 사용되는 유지나 오일 등이 공기 또는 물중에 녹아있는 용존 산소 및 자외선 등으로부터 유발되는 활성 라디칼에 의해 산화되고 분해되는 것을 방지 내지 지연하여 완화시킬 목적으로 사용되고 있으며, 그 전형적인 물질로는 부틸하이드록시톨루엔(BHT)과 같은 합성 항산화제와 토코페롤과 같은 천연 항상화제를 들 수 있다. 그러나 일반적으로 합성 항산화제는 항산화 효과는 우수하지만 독성이 강하거나 또는 피부 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있으므로, 근래 들어서는 자연계로부터 피부 부작용이 거의 없는 천연 항산화제를 얻으려는 노력이 다각도로 수행되고 있다.

화장료에 대한 항산화제의 선별 방법으로서는 일반적으로 지용성 성분의 항산화 활성 측정을 위한 SOD(superoxide dismutase) 유사 활성 측정법과 수용성 성분의 항산화 활성 측정을 위한 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhtdrazyl) 라디칼 소거능 측정방법이 이용되고 있다.

한편, 피부색은 주로 피부 세포 속에 함유되어 있는 멜라닌 색소의 양에 따라 크게 좌우되며, 멜라닌 색소는 과도한 자외선으로부터 피부를 보호하며 광에 의한 피부손상 및 피부암의 발생을 억제함에 있어 중요한 역할을 하나, 일광, 호르몬변화, 염증, 약제 등에 의해 멜라닌이 과다 생성되는 경우에는 피부에 색소가 과다 침착되어 미용 상의 여러 문제, 예컨대, 피부의 과색소 질환인 기미나 주근깨 등을 유발하게 된다.

화장료에 있어서의 미백 작용은 통상적으로 멜라닌 색소의 침착으로 인한 기미나 주근깨의 생성을 억제하는 작용을 일컬으며, 상기한 멜라닌 색소는 티로신(Tyrosine) 또는 도우파(Dopa)로부터 티로시나제(Tyrosinase)에 의해 도우파크롬(Dopachrome)으로 되고 일련의 자동 산화 반응을 통하여 멜라닌 고분자로 변화되어 생성되는 것으로 알려져 있다. 따라서 멜라닌 생성 경로를 차단하는 항산화물질 또는 미백 성분을 이용한 화장료에 대한 연구가 최근 활발히 이루어지고 있다.

현재 피부미용을 위한 미백제의 개발은 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색시키는 방법과 멜라닌 색소를 형성하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있으며, 여기서 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민 류등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색 효과가 미미한 것으로 알려져 있으므로, 티로시나제의 활성을 저해함으로써 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 저해제가 오늘날 주목받고 있다.

근래 들어 널리 사용되고 있는 미백제 선별 방법으로서는 버섯으로부터 정제된 티로시나제를 이용하여 티로시나제의 활성을 저해시키는 저해제를 선택하는 방법과 쥐의 흑색종 세포를 이용하여 미백원에 대한 흑색종 세포의 상태를 평가하여 선택하는 방법이 있다.

티로시나아제는 모노페놀류의 산화 반응을 촉매하는 효소로서 고등동물의 멜라닌 세포 속에 주로 존재하며, 전술한 바와 같은 티로신에 대한 일련의 산화 반응을 거쳐 멜라닌 색소를 생성하게 되며, 멜라닌 색소는 생체 내에서 과량의 빛을 흡수하여 갈색이나 흑색을 띠게 되므로 피부미용에 나쁜 영향을 미치게 된다.

따라서 티로시나제의 활성을 억제시키면 멜라닌 색소의 생성을 억제할 수 있으므로, 종래의 화장품에서는 미백성분으로서 히드로퀴논, 트레티노인, 코지산, 알부틴, 아스코르빈산, 글루타치온 등을 티로시나제의 활성저해물질로 이용하는 방법이 널리 이용되어 왔으나, 상기 성분들을 포함하는 화장료는 제조과정 또는 제품 보관 중 빛과의 반응에 의해 산화되어 화장료가 변색될 우려가 크다는 문제점이 있고, 따라서 이러한 변색 우려를 저감시킬 목적으로 산화방지제, UV 흡수제, 금속 킬레이트제 등의 첨가제를 첨가하고 있으나, 이러한 첨가제는 상대적으로 다량 사용할 경우 피부 자극을 유발하는 등 피부 안정성에 문제점이 있고, 목적하는 정도의 충분한 미백효과를 얻을 수 없다는 문제점이 있었다.

또한 화장료에 대한 미백제의 선별 방법으로서는 일반적으로 버섯으로부터 정제된 티로시나제를 이용하여 티로시나제의 활성을 저해시키는 저해제를 선택하는 방법과 쥐의 흑색종 세포를 이용하여 미백원에 대한 흑색종 세포의 상태를 평가하여 선택하는 방법이 이용되고 있다.

종래, 한약재를 포함한 각종 천연 식물원(plant source)의 추출물에 대한 항산화 활성 및 미백 효과에 대한 다양하고 광범위한 연구가 진행되어 왔으나, 상기한 추출물은 본질적으로 복합물로서 추출 용매의 선택 및 추출 조건에 따라 복합물의 내용도 다양하게 변화되며 그 항산화 활성 및/또는 미백 효과도 매우 현저한 차이를 나타내게 된다.

등록특허공보 제10-1363413호(2014.02.10. 등록) 등록특허공보 제10-0907865호(2009.07.07. 등록) 공개특허공보 제10-2002-0043339호(2002.06.10. 공개) 등록특허공보 제10-0362498호(2002.11.13. 등록) 등록특허공보 제10-0845723호(2008.07.07. 등록) 등록특허공보 제10-1226089호(2013.01.18. 등록)

따라서 본 발명자들은 우리나라 순천지역의 다양한 특산식물 중 우수한 항산화 활성 및 미백 효과를 지니는 천연물을 발굴하고, 특정 용매에 의한 분획 추출물의 혼합물을 선택하기 위한 다양하고 광범위한 연구를 수행하였으며, 그 결과 노근, 함초, 매실의 혼합물에서 우수한 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

본 발명의 목적은 순천 지역의 특산물인 노근, 함초 및, 매실에 대한 특정한 용매 추출물의 혼합물을 포함하는 항산화 및 미백 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 원활히 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 양태(樣態: aspect)에 따르면, 노근(Phragmitis Rhizoma)의 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트 추출 분획물과, 함초(Salicomia herbacea L.)의 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트 또는 부탄올 추출 분획물과, 매실(Prunus mume)의 에탄올 추출 동결 건조물의 혼합물을 화장료 조성물 전 중량 기준으로 0.01~50.0중량% 함유하며: 상기한 노근, 함초 및, 매실의 에탄올 추출 동결 건조물이 각각의 건조 분체를 에탄올에 1:1w/v의 양으로 1~5일간 각각 침지하여 얻어지는 추출액을 필터 여과하여 여액을 농축한 다음, 동결 건조시켜 분체화한 것으로서, 토너, 젤, 로션, 크림, 또는 연고제의 제형을 가지는 항산화 및 미백 화장료 조성물이 제공된다.

삭제

본 발명에 따른 노근, 함초 및, 매실 추출물을 함유하는 항산화 및 미백 화장료 조성물은 우수한 항산화 및 미백 활성 효능을 나타내며, 특히 이들의 에탄올 추출의 동결 건조물에 대한 특정한 추출 용매 분획을 이용하는 것에 의하여 항산화에 의한 우수한 피부노화 및 주름 방지와 피부 미백 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 유효 성분 증 하나인 매실 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 유효 성분 증 하나인 함초 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 유효 성분 증 하나인 노근 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 항산화 및 미백 화장료 조성물에는 노근(Phragmitis Rhizoma), 함초(Salicomia herbacea L.) 및, 매실(Prunus mume)의 건조 분체 각각에 대한 에탄올 추출물의 동결 건조 혼합물이 적용되며, 상기한 노근, 함초 및, 매실의 에탄올 추출물은 우수한 항산화 및 미백 효과를 나타내면서도 부작용이 거의 없다.

또한 상기한 동결 건조 혼합물의 혼합비는 중량비로 1:0.1~10:0.1~10의 범위일 수 있으나, 통상적으로는 노근, 함초 및, 매실의 등중량 건조 분체에 대한 동일 부피량의 에탄올 추출물으로서 그 혼합비는 중량비로 1:1:1일 수 있다.

상기한 각각의 에탄올 추출물은 자연 건조된 노근, 함초 및, 매실을 분말 형태로 분쇄하고 이에 대하여 에탄올(1:1 w/v)을 첨가하여 수일간, 구체적으로는 1 내지 5일간 침지하여 추출한 다음, 필터 페이퍼를 이용하여 여과한 후, 여액을 농축한 다음, 동결 건조하여 분체화한 것이 사용된다.

또한 상기한 동결 건조 혼합물은 상기한 에탄올 추출 동결 건조물을 에틸 아세테이트, 부탄올, 헥산, 또는 물을 이용하여 재차 추출한 분획물이며, 보다 구체적으로는, 노근의 경우에는 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트, 부탄올, 헥산, 또는 이들의 혼합 추출 분획물, 바람직하게는 에틸아세테이트 추출 분획물을 사용할 수 있으며, 함초의 경우에는 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트, 부탄올, 헥산, 또는 이들의 혼합 추출 분획물, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 부탄올 추출 분획물을 사용할 수 있으며, 매실의 경우에는 에탄올 추출 동결 건조물을 그대로 사용할 수 있고, 본 발명에 있어서는 이들의 혼합물을 사용한다.

삭제

또한 상기한 동결 건조 혼합물이 노근, 함초 및, 매실의 건조 분체를 에탄올에 1~5일간 침지하여 얻어지는 추출액을 필터 여과 후 여액을 농축한 다음, 동결 건조시켜 분체화한 것으로 이루어질 수 있다.

상기한 에탄올 추출물에 대한 상기한 용매에 의한 추출 분획물은 그대로 사용할 수도 있으나, 여과 후 농축한 엑스 형태로 사용될 수도 있고, 농축한 다음 동결 건조하여 동결건조물의 형태로서 사용될 수도 있다. 바람직하게는 여과 후 농축한 엑스를 동결 건조한 동결 건조물의 형태로서 사용하는 것이다.

상기한 노근, 함초 및, 매실 추출물은 조성물 전 중량 기준으로 0.01~50.0중량% 함유될 수 있으며, 각각의 추출물은 전술한 바와 같은 범위 내의 임의의 혼합비로 혼합 사용할 수 있으나, 통상적으로는 등중량 혼합비의 혼합물을 사용할 수 있다.

또한 상기한 화장료 조성물은 토너, 젤, 로션, 크림, 또는 연고제와 같은 당업계 공지의 다양한 제형으로 제형화될 수 있다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예 및 실험예, 그리고 제형예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하기로 하나, 이는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1-3: 노근, 함초 및, 매실의 에탄올 추출물의 제조

실시예 1: 노근의 에탄올 추출물의 제조

갈대는 전남 순천에서 채집하였으며 시료는 농약이나 중금속의 오염이 되지 않은 조건의 지역에서 채집하여 실험에 사용하였다. 갈대의 뿌리 부분인 노근을 취한 후, 이물질을 제거하고 자연건조 한 후 냉장고에 보관하여 추출에 사용하였다.

노근의 에탄올 추출물은 냉장고에 보관된 건조시료를 분말형태로 분쇄하여 같은 비율의 에탄올(1:1 w/v)을 첨가하여 3일간 침지시켜 추출하였다. 추출된 시료액은 와트만 필터 페이퍼를 사용하여 여과한 후, 감압농축기를 이용하여 추출용매를 제거하고 6시간 동안 농축시켰다. 그 후 동결 건조하여 분말화한 다음 냉장보관(4 ℃ 이하)하면서 실험에 사용하였다.

실시예 2: 함초의 에탄올 추출물의 제조

함초는 전남 순천에서 채취하여 깨끗한 물로 수세한 후 이물질을 제거하여 그늘에서 자연건조 한 후 냉장고에 보관하여 추출에 사용하였다.

함초 추출물은 냉장고에 보관된 건조시료를 분말형태로 분쇄하여 같은 비율의 에탄올(1:1 w/v)을 첨가하여 3일간 침지시켜 추출하였다. 추출된 시료액은 와트만 필터 페이퍼를 사용하여 여과한 후, 감압농축기를 이용하여 추출용매를 제거하고 6시간 동안 농축시켰다. 그 후 동결 건조하여 분말화한 다음 냉장보관(4 ℃ 이하)하면서 실험에 사용하였다.

실시예 3: 매실의 에탄올 추출물의 제조

매실은 순천시 소재의 농협에서 구입하여 깨끗한 물로 세척하여 이물질을 제거하고 자연건조 한 후 냉장고에 보관하여 추출에 사용하였다.

매실 에탄올 추출물은 냉장고에 보관된 건조시료를 분말형태로 분쇄하여 같은 비율의 에탄올(1:1 w/v) 첨가하여 3일간 침지시켜 추출하고 와트만 필터 페이퍼로 여과한 후, 감압농축기를 이용하여 추출용매를 제거하고 6시간 동안 농축시켰다. 그 후 동결 건조하여 분말화한 다음 냉장보관(4 ℃ 이하)하면서 실험에 사용하였다.

실시예 4: 노근 에탄올 추출물의 분획 추출물의 제조

실시예 1에서 얻은 노근 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물의 순서로 분획 퓨넬을 사용하여 분획하였다.

실시예 5: 함초 에탄올 추출물의 분획 추출물의 제조

실시예 2에서 얻은 함초 에탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물의 순서로 분획 퓨넬을 사용하여 분획하였다.

실험예 1 및 2 : 항산화 활성

활성산소는 피부의 면역기능을 억제시키고, 염증을 유발하여 탄력 감소, 주름 및 기미, 주근깨 등의 각종 피부질환을 유발하며, 결국 피부노화를 가속화시키는 원인이 되므로, 피부노화 방지를 위한 활성산소로부터 피부세포를 보호할 수 있는 능력을 검증하기 위한 분석법으로서 항산화 활성을 측정하였다.

식물은 고착생활을 하므로 외부 스트레스에 대한 환경적응 능력이 다른 생물체보다 높은 것으로 여겨져 왔으므로, 노근, 함초, 매실 추출물의 농도별 항산화력을 측정하였다.

실험예 1: SOD(superoxide dismutase) 활성 측정

SOD 활성을 Beauchamp and Fridovich(1971)의 방법을 응용하여 측정하였다.

실시예 1 내지 3 각각의 시료를 추출 완충액(extraction buffer)(50mM 인산염 완충용액(phosphate buffer), pH 7.0;1% 트리톡스(Tritox) X-100; 1% PVP-40)에 1:4의 비율로 혼합한 후 균질화시키고 12000rpm에서 20분 동안 원심분리한 다음 상층액을 취하여 항산화 활성 측정에 사용하였다.

50 mM 탄산 완충액(carbonic buffer)(pH 10.2), 0.1 mM EDTA,,0.1mM 잔틴(Xanthine), 0.025 mM 니트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium: NBT), 상기한 효소액이 포함된 용액을 25℃에서 10분간 반응한 후, 잔틴 옥시다제(Xanthine oxidase)(3.3x10^-6mM)를 참가하여 반응을 측정하였다. SOD 활성 측정은 550nm에서 30초 단위로 5분간 흡광도를 측정하였다.

에탄올 추출물의 농도별(125~1000㎍/㎖)로 SOD 유사활성을 분석한 결과(표 1), 500㎍/㎖에서는 매실 추출물의 활성이 가장 높게 나타났으며, 최대농도인 1000 ㎍/㎖에서는 노근 추출물에서 높게 나타났으나 3종 모두에서 크게 유의할만한 차이를 보이진 않았다.

최종농도에서 높은 활성을 보였던 노근의 에탄올 추출물을 실시예 4에서의 4가지 유기용매(hexane, EtoAc, BuOH, water)로 처리하여 분획물을 조제한 후, 다시 SOD 유사활성을 분석하여 활성물질을 함유한 용매분획을 확인하였다(표 2). 분획물의 농도가 31.3㎍/㎖일때 EtoAc 분획물의 활성이 가장 높게 나타났으며, 다른 농도군(62.5~1000㎍/㎖) 모두에서 계속적으로 우수한 활성을 보였다.

함초의 경우에도 노근과 마찬가지 방법으로 실시예 5에서의 4가지 용매로 분획하여 SOD 유사활성을 분석하였으며(표 3), EtoAc와 BuOH 층 분획물에서 높은 활성을 보였다.

에탄올 추출물의 SOD-유사 활성

	SOD-유사 활성(%)
	추출물 농도(ug/mL)
	125	250	500	1000
실시예 1	5.6±0.4	12.2±0.1	21.1±0.7	35.6±0.0
실시예 2	5.6±1.2	11.7±0.9	17.2±0.0	32.8±0.1
실시예 3	6.1±0.9	13.9±1.9	28.3±0.0	32.3±0.1

노근 에탄올 추출물의 4가지 분획에 대한 SOD-유사 활성

실시예 4	SOD-유사 활성(%)
	추출물 농도(ug/mL)
	31.3	62.5	125	250	500	1000
Hexane	3.5±0.4	16.1±0.3	20.±1.9	24.4±1.4	28.4±1.3	36.8±1.0
EtOAc	9.4±1.2	20.5±0.9	30.3±0.9	52.8±0.0	42.5±0.6	59.8±0.5
BuOH	5.1±0.3	15.0±0.4	23.0±0.6	30.7±0.7	33.9±1.2	37.4±1.5
Water	2.4±1.6	10.4±1.5	20.8±1.6	28.5±1.2	31.5±1.0	37.0±1.0

함초 에탄올 추출물의 4가지 분획에 대한 SOD-유사 활성

실시예 5	SOD-유사 활성(%)
	추출물 농도(ug/mL)
	31.3	62.5	125	250	500	1000
Hexane	1.2±0.2	2.3±0.4	4.6±0.8	8.1±0.1	14±0.5	28.1±1.1
EtOAc	2.7±0.6	4.8±0.8	9.7±0.7	15.1±0.2	23.3±1.0	44.7±0.6
BuOH	6.6±0.6	8.7±0.3	11.5±0.2	17.7±1.6	24.3±0.6	46.6±4.5
Water	4.5±0.5	6.2±0.6	6.7±1.1	7.8±0.4	8.7±0.8	15.3±0.2

실험예 2: DPPH(2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질) 라디칼 소거능 측정

DPPH 자유 라디칼은 517nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물로서 유기용매 중에서 안정하며, 여러 항산화 기작 중 양성자 라디칼에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있으며, 본 실험에서는 Blois의 방법을 약간 변형한 DPPH법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. 1x10^-4M DPPH와 농도별 추출물을 각각 100㎕씩 취하여 혼합한 30분간 암 상태에서 방치한 후 잔존 라디칼l 농도를 ELISA 판독기(Bio-RAD, USA)를 이용하여 517nm에서 측정하였다.

시료의 환원력의 크기는 라디칼 소거활성(Scavenging activity)으로 표시하며, RC₅₀은 DPPH 농도가 1/2로 감소하는데 필요한 시료의 양(㎍)으로 나타냈다.

DPPH 라디칼 소거 활성(%) = (Ac-As)/Ac x 100

Ac : 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도

As : 시료를 첨가한 반응구의 흡광도

3종의 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과, 매실 추출물은 모든 농도(31.3~1000㎍/㎖)에서 가장 유의할 만한 활성을 보였으며, 최대 농도에서는 노근과 매실의 활성이 유사한 값을 나타냈다(표 4). 또한 실시예 4에서의 4가지 용매(hexane, EtoAc, BuOH, water)로 분획물을 조제하여 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과, 노근의 경우에는 헥산층과 에틸아세테이트 층에서 유의할만한 활성을 보였으며 특히 250~500㎍/㎖의 농도에서는 70% 이상의 소거능을 보였다(표 5). 함초의 경우에는 실시예 5에서의 4가지 용매(hexane, EtoAc, BuOH, water)로 분획물을 조제하여 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과, 부탄올 층과 에틸아세테이트 층이 다른 용매 추출물보다 높은 소거능을 보였으나 노근에 비하여 낮은 소거능을 나타냈다(표 6).

에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능

	DPPH 라디칼 소거능(%)
	추출물 농도(ug/mL)
	31.3	62.5	125	250	500	1000
실시예 1	2.7±1.0	5.0±1.0	6.7±1.0	12.2±0.0	19.0±2.4	40.4±0.9
실시예 2	1.5±0.8	3.6±0.1	4.1±0.5	4.9±0.7	8.7±0.6	16.6±1.2
실시예 3	16.2±0.8	21.9±1.6	22.8±2.5	24.6±1.9	32.7±3.5	41.4±1.1

노근 에탄올 추출물의 4가지 분획에 대한 DPPH 라디칼 소거능

실시예 4	DPPH 라디칼 소거능(%)
	추출물 농도(ug/mL)
	15.6	31.3	62.5	125	250	500
Hexane	8.8±0.3	12.2±4.3	20.3±3.9	30.3±1.5	38.2±2.0	63.6±1.8
EtOAc	12±0.2	21.9±0.9	35.8±0.1	56.6±0.0	73.7±0.9	89.5±0.7
BuOH	1.1±0.3	4.2±0.4	8.9±0.5	17.1±0.5	27.8±0.2	43.6±1.0
Water	1.4±1.6	2.8±1.7	4.3±2.6	5.9±1.5	8.0±1.2	12.9±1.3

함초 에탄올 추출물의 4가지 분획에 대한 DPPH 라디칼 소거능

실시예 5	DPPH 라디칼 소거능(%)
	추출물 농도(ug/mL)
	15.6	31.3	62.5	125	250	500
Hexane	1.2±0.2	2.3±0.4	4.6±0.8	8.1±0.1	14±0.5	28.1±1.1
EtOAc	2.7±0.6	4.8±0.8	9.7±0.7	15.1±0.2	21.3±1.0	40.7±0.6
BuOH	6.6±0.6	8.7±0.3	11.5±0.2	17.7±1.6	25.3±0.6	49.6±4.5
Water	4.5±0.5	6.2±0.6	6.7±1.1	7.8±0.4	8.7±0.8	15.3±0.2

실험예 3 내지 5 : 피부 미백 효과

노근, 함초 및, 매실 추출물의 피부 미백 효과를 시험관 내(in vitro) 타이로신 저해 활성 및 생체 내(in vivo) 멜라닌 생성 억제능에 대한 실험을 통하여 측정하였다.

실험예 3: 시험관 내 타이로신 저해 활성

실시예 1 내지 3의 매실, 함초, 노근의 에탄올 추출물을 세 가지 농도(0.1~1%)로 처리하여 타이로시나제 저해활성을 분석한 결과, 농도가 높아질수록 저해활성도 높아짐을 확인할 수 있었으며(표 7), 3종의 추출물 간에 현저한 차이를 보이지 않았으며 유사한 정도의 저해활성을 나타냈다.

타이로시나제 저해활성

	추출물 농도(%)	타이로시나제 저해활성(%)
실시예 1	1	28.8
	0.5	27.5
	0.1	11.7
실시예 2	1	23.3
	0.5	22.5
	0.1	22.0
실시예 3	1	31.8
	0.5	29.1
	0.1	17.0

실험예 4: 추출물의 세포 독성 실험

B16F10 흑색종 세포주를 각 웰(well)에 1x10⁴개의 농도로 넣어준 다음 1일 후 실시예 1 내지 3의 추출물을 일정 농도로 첨가하였다. 각 추출물로 처리하여 2일째에 MTT 용액(0.5mg/mL)을 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 살아있는 세포는 MTT와 반응하여 보라색 불용성 포마잔(formazan) 침전물이 형성되며 이것을 용해시키기 위하여 상층액을 버리고 DMSO를 150㎕씩 넣어 용해하여 ELISA 판독기로 540nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다(표 8).

분석결과, 세포 농도가 90% 이상 생존 가능한 추출물의 농도는 100㎍/㎖로 나타났으며, 이 농도를 기준으로 후술하는 실험예 5에서의 멜라닌 함량 저해능을 분석하였다.

B16F10 흑색종 세포주 생존능에 대한 추출물의 효과

농도(㎍/㎖)	실시예 3	실시예 2	실시예 1
400	37.26	51.60	85.80
200	54.90	72.57	89.80
100	94.88	92.03	96.60
50	96.77	94.50	100
25	100	100	100

실험예 5: 멜라닌 생성 억제능 측정

멜라닌은 멜라닌 세포의 세포소기관인 멜라닌소체(melanosome)에서 일련의 효소 반응에 의해 생성된다.

실험예 5에서는 실험예 4에서 B16F10 세포의 생존에 영향을 미치지 않았던 농도를 결정하여 추출물이 세포내에서 멜라닌 생성에 미치는 영향을 살펴보았다(도 1 내지 도 3; 표 9).

멜라닌 정량은 Hosei 등(Hosoi et al ., 1985)의 방법을 변형하여 사용하였다.

멜라닌 세포인 B16 흑색종 세포를 배양하여 24 웰 플레이트의 각 웰 당 세포를 1x10⁴cell/well로 각각의 세포생존율에 따라 농도를 처리한 후 48시간 배양하였다. 48시간 배양한 후 각 웰을 PBS로 세척한 후 1% DMSO가 첨가된 1N NaOH 용액으로 60℃에서 1시간 동안 용해하였으며, ELISA 판독기를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포독성이 없는 추출물 농도인 100㎍/㎖에서 실시예 1 내지 3의 각각의 추출물을 세포에 처리한 결과, 생성된 멜라닌의 함량은 실시예 3의 매실 추출물이 82.89%, 실시예 2의 함초 추출물이 82.90%, 실시예 1의 노근 추출물이 79.70%로 나타나 노근 추출물이 가장 효과적으로 세포내에서 멜라닌 생성을 억제했음을 확인할 수 있었다(도 1 내지 도 3; 표 9).

B16F10 흑색종 세포주에서의 멜라닌 생성 억제능

	대조	실시예 3	실시예 2	실시예 1
	대조	100㎍/㎖	100㎍/㎖	100㎍/㎖
멜라닌 함량(%)	100±1.20	82.60±4.36	82.90±1.99	79.70±2.86

제형예 1: 토너제의 제조

상기 실시예 1 내지 3에서 얻은 추출물을 함유하는 토너제를 하기의 표 10에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

토너제

성 분	함량(중량%)
실시예1-3의 등중량 혼합물	1.0
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	2.0
폴리옥시에칠렌(60) 경화 피마자유	0.5
폴리솔페비트80	0.5
에탄올	10.0
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 2: 연고제의 제조

실시예 4 및 5의 에틸아세테이트 분획 추출물과, 실시예 3의 에탄올 추출물을 함유하는 연고제를 하기의 표 11에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

연고제

성 분	함량(중량%)
실시예 4(EtoAc분획물)	1.0
실시예 5(EtoAc분획물)	1.0
실시예 3	1.0
밀납	10.0
폴리솔페비트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	38.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
카르복시 비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.2
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 3: 크림제의 제조

실시예 4의 헥산 분획 추출물과 실시예 5의 부탄올 분획 추출물과, 실시예 3의 에탄올 추출물을 함유하는 연고제를 하기의 표 11에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

상기 실시예 3에서 얻은 추출물을 함유하는 크림제를 하기의 표 12에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

크림제

성 분	함량 (중량 %)
실시예 4(BuOH분획물)	1.0
실시예 5(Hexane분획물)	1.0
실시예 3	1.0
글리세릴스테아레이트/피이지-100스테아레이트	2.0
폴리솔베이트60	0.5
소르비탄 스테아레이트	0.5
피토스쿠알란	5.0
호호바 오일	3.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	9.0
알로에 버터	3.0
밀납	1.0
스테아릴 알코올	0.5
베헤릴 알코올	0.5
스테아린산	0.5
글리세린	6.0
부틸렌 글리콜	5.0
카르복시 비닐폴리머	0.2
아르기닌	0.3
디메치콘	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

이상, 본 발명에 관하여 상세히 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 이로부터 다양한 변화 및 수정이 가능함은 물론이나, 이 또한 본 발명의 영역 내이다.

Claims

노근(Phragmitis Rhizoma)의 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트 추출 분획물과, 함초(Salicomia herbacea L.)의 에탄올 추출 동결 건조물에 대한 에틸아세테이트 또는 부탄올 추출 분획물과, 매실(Prunus mume)의 에탄올 추출 동결 건조물의 혼합물을 화장료 조성물 전 중량 기준으로 0.01~50.0중량% 함유하며:
상기한 노근, 함초 및, 매실의 에탄올 추출 동결 건조물이 각각의 건조 분체를 에탄올에 1:1w/v의 양으로 1~5일간 각각 침지하여 얻어지는 추출액을 필터 여과하여 여액을 농축한 다음, 동결 건조시켜 분체화한 것으로서,
토너, 젤, 로션, 크림, 또는 연고제의 제형을 가지는 항산화 및 미백 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제