KR20090081956A

KR20090081956A - 오가피로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용화장료 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20090081956A
Application number: KR1020080008147A
Authority: KR
Inventors: 윤경섭; 임경란; 김미진; 정택규
Original assignee: 주식회사 사임당화장품
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2009-07-29
Also published as: KR100959393B1

Abstract

본 발명은 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 오가피로부터 추출된 클로로겐산 분획을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 부작용이 없으면서도 피부의 멜라닌 색소 생성을 억제하고 색소 침착을 저해함으로써 우수한 미백 효과를 제공한다. 본 발명은 또한 오가피 추출물의 피부 미백 효과를 높이는 제조방법을 제공한다.

오가피, 클로로겐산, 피부 미백

Description

오가피로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 그 제조방법{Skin whitening cosmetics composition containing an effective ingredient extracted from Acanthopanax sessiliflorum Seeman and manufacturing method thereof}

본 발명은 식물 추출물 또는 식물로부터 추출된 유효성분을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 그러한 화장료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

오가피(五加皮, Acanthopanacis Cortex, Acanthopanax sessiliflorum Seeman)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 오가피속(Acanthopanax) 식물로 낙엽 활엽 관목이다. 오가피는 대한약전에 수재된 생약으로 '오가피나무 Acanthopanax sessiliflorum Seeman 또는 동속식물의 뿌리, 줄기 및 가지의 껍질이다'라고 정의되어 있다.

이러한 오가피는 약용으로서 가치가 높이 평가되어 여러 나라에서 오가피의 성분분석에 대한 연구가 많이 진행되었다. 오가피에는 아칸토산(acanthoic acid)과 아칸토사이드(acanthoside) A-G, 시그마스테롤(sigmasterol), 클로로겐산(chlorogenic acid), 카페익산(caffeic acid), 세사민(sesamin), 치사노사이 드(chiisanoside) 등의 유용성분이 함유되어 생체기관의 전반적인 기능 증대, 중추신경 흥분 작용, 근육운동, 항암작용, 항당뇨작용, 수면연장, 해독작용, 환경변화에 대한 적응 등의 다양한 생리적 작용이 보고되어 있다. 이러한 효능 때문에 식품, 의약품, 화장품 등의 첨가제로 사용되고 있고, 오가피의 성분 분석과 효능에 관한 연구는 계속해서 진행되어 오고 있다.

지금까지 국내외적으로 오가피속(Acanthopanax)에 속하는 식물의 약리적, 생리적 작용 및 그 주된 생리활성 물질의 분리 및 정제에 관한 연구가 수행돼 왔다. 가시오가피(Acanthopanax Senticosus) 및 무취 마늘 혼합추출물이 피부노화 억제 활성을 보였으며(대한민국 공개특허 10-2000-0052725), 가시오가피 추출물(Acanthopanax Senticosus)의 여드름 및 뾰루지 치료효과(대한민국 공개특허 10-2000-0009820) 및 오가피 추출물(Acanthopanax sessiliflorum Seeman)의 피부 보호효과(대한민국 공개특허 10-1999-0053765)가 우수한 것으로 보고된 바 있다.

한편 멜라닌은 동식물계에 널리 존재하는 고분자의 천연색소로서 사람의 피부에서는 자외선 조사 등에 의한 피부손상에 대항하는 기작으로 생합성이 촉진된다. 멜라닌 색소는 피부를 보호하는 긍정적인 면이 있으나, 이의 과잉생성은 기미, 주근깨, 피부반점 등을 유발하며 멜라닌 전구물질의 독성으로 인한 세포의 사멸 및 피부암 생성이 촉진되기도 한다.

멜라닌의 생합성은 표피 기저층에 존재하는 멜라노싸이트(melanocyte)의 멜라노좀(melanosome)에서 타이로시네이즈(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein-1), DCT(dopachrome tautomerase) 등 특이적인 효소의 연속적 산화반응에 의해서 일어나는데, 그 중 멜라닌 합성의 주요 효소인 타이로시네이즈 활성 저해실험이 멜라닌 중합체 억제제 개발의 초기단계에서 채택되고 있다.

그러나 타이로시네이즈에 의한 산화반응 이외에, MSH(melanocyte stimulating hormone), 염증반응에 관여하는 각종 사이토카인류, 유전자 발현에 관여하는 인자 등 여러 가지 복잡한 요인들이 멜라닌 생성에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌고, 또한 in vitro에서의 타이로시네이즈 활성 억제 물질이 멜라노마(melanoma) 세포주에서는 활성이 전혀 나타나지 않는 등의 문제로 멜라닌 생성을 종합적으로 억제하는 물질의 개발에 초점이 맞추어지고 있다.

현재까지 자외선 흡수제나 산란제, 알부틴(arbutin), 코지산(kojic acid), 하이드로퀴논(hydroquinone) 등과 같은 타이로시네이즈 활성 저해제, 활성 산소종을 소거하는 아스코르브산(ascorbic acid) 및 유도체, 코엔자임 Q10 (coenzyme Q10) 등이 미백효과가 있다고 알려졌으나, 피부 안전성, 제형 안정성 등의 문제로 사용되지 않거나 제한된 양만이 사용되고 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 피부 부작용이 적으면서도 멜라닌 생성을 억제함으로써 우수한 피부 미백효과를 갖는 화장료 조성물 및 그 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 오가피로부터 추출된 클로로겐산(chlorogenic acid)이 풍부한 추출물 분획을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어, 오가피는 '오가피나무 Acanthopanax sessiliflorum Seeman 또는 동속식물의 뿌리, 줄기 및 가지의 껍질'을 의미한다.

본 발명은 또한 (S1) 오가피를 분쇄하는 단계; (S2) 오가피를 70 내지 85% 에탄올 수용액으로 상온 또는 냉침 추출하는 단계; (S3) 추출여액을 20 내지 50℃에서 감압농축하여 조추출물을 얻는 단계; (S4) 조추출물을 이온수지컬럼크로마토그래피에 충진시킨 후 순차적으로 에탄올의 함량을 높여가며 에탄올 수용액으로 용출하는 단계; 및 (S5) 10 내지 40% 에탄올 수용액 분획을 회수하여 클로로겐산의 함량을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 효과가 향상된 오가피 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명에 따른 오가피 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 그 조성물의 제조방법에 대해 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 피부 미백 유효성분으로 오가피로부터 추출된 클로로겐산이 풍부한 분획을 포함한다.

본 발명은 오가피 추출물 중 하기 화학식 1로 표시되는 클로로겐산(chlorogenic acid)이 증가할수록 피부 미백 효과가 증가한다는 놀라운 사실과 이러한 클로로겐산의 함량은 특정 제조방법을 통하여 증대될 수 있다는 놀라운 사실에 기초한다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물에 있어 상기 클로로겐산의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하다. 상기 활성성분의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 본래 목적하는 피부의 피부 미백효과를 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 함량이 10 중량%를 초과하는 경우에는 화장료의 안정성에 문제를 발생시킬 수 있고, 이로 인하여 화장료의 외관이나 사용 시 충분한 화장효과를 발현시킬 수 없는 단점이 있다.

본 발명에 따른 오가피 추출물은 오가피의 다양한 기관, 조직(예를 들어, 뿌리, 줄기, 열매, 꽃, 잎) 등을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 오가피의 줄기 및 뿌리로부터 얻은 추출물이다.

통상적인 오가피 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합 용매, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, 부틸아세테이트 등을 추출용매로 이용하여 얻을 수 있으나, 피부 미백 효과가 뛰어난 추출물을 얻기 위해서는 70 내지 85% 알코올 수용액을 사용하여 10 내지 100℃, 바람직하게는 15 내지 40℃에서 약 2시간 내지 5일 동안 추출하는 것이 바람직하며, 75% 에탄올 수용액을 이용하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다.

추출은 상온 추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법으로 얻을 수 있으나, 피부 미백 효과가 뛰어난 오가피 추출물을 얻기 위해서는 상온 추출방법으로 수회 반복 추출한 후 추출액을 여과하고 40℃에서 감압 농축하여 오가피 조추출물을 얻는 절차가 바람직하다. 오가피 조추출물의 제조시 추출온도가 50℃를 초과하면 전체 추출물의 양은 증가하나, 클로로겐산의 함량은 늘어나지 않으며 조추출물의 색상이 어두워지므로 10 내지 50℃에서 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 스킨류, 로션류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으며, 또한 상기 오가피 추출물 함유 화장료 조성물은 기초제품 화장료 또는 색조제품 화장료의 제조에 이용될 수도 있다. 또한 본 발명의 화장료 조성물은 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 통상적인 화장료 제조법을 이용하여 제조될 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 오가피로부터 추출된 클로로겐산 풍부 분획을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하며, 또한 이러한 피부 미백 효과가 뛰어난 화장료 조성물을 제조하는 방법, 즉, 오가피 추출물의 피부 미백 효과를 높이는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 오가피 추출물은 천연물로서 피부 부작용이 없어 안전할 뿐만 아니라, 항산화효과와 B16F1 멜라노싸이트를 이용한 세포 내의 멜라닌생성저해효과에서 우수한 활성을 나타내므로 피부 미백용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.　그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.　본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

<추출 실시예 1 내지 5>

오가피 줄기 50 g를 정량하여 추출기에 넣은 후, 하기 표 1과 같은 각각의 추출 용매 1 L을 넣고 환류 냉각 추출한 후, 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 추출여액을 회전식 증발 건조기(rotary evaporator)로 60℃로 감압 농축하여 표 1과 같이 오가피 추출물의 수득량 및 활성성분인 클로로겐산의 함량(%)을 나타내었다. 이때 고속액체크로마토그래피로 함량을 측정하였으며, 분석조건은 다음과 같다.

크로마마토그래피 : Agilent Technologies 1200 Series

칼럼 : Luna C18 (5 um, 250 × 4.6 mm)

검출기 :　자외부흡광광도계 (측정파장 330 nm)

유속 : 1.0 ml/min

이동상 : 용매 A(0.1% 아세트산, 아세토니트릴), 용매 B(0.1% 아세트산, 물)의 기울기 용매

추출 실시예	추출용매	수득량(g)	클로로겐산의 함량(%)
1	100% 에탄올 수용액	0.950	0.994
2	75% 에탄올 수용액	2.920	2.266
3	50% 에탄올 수용액	3.500	2.117
4	25% 에탄올 수용액	3.560	2.183
5	100% 정제수	3.870	1.180

100% 정제수 및 100% 에탄올의 단일 용매로의 추출보다 에탄올 수용액을 사용하여 추출시 클로로겐산의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 에탄올 수용액에서의 클로로겐산의 함량은 큰 차이가 없으므로 농축시의 시간을 고려하여 70 내지 85% 에탄올 수용액으로 추출하는 것이 바람직하였다.

또한 환류추출시 정제수 함량이 증가할수록 높은 열을 가하게 되며, 높은 열을 가한 추출물의 색상이 어두워졌다. 그러므로 오가피 추출물의 제조시 상온 추출이나 냉온 추출하는 것이 바람직하였다.

<추출 실시예 6 내지 8>

분쇄한 오가피 줄기 40 kg에 80% 에탄올수용액 400 L을 넣고 3일 동안 상온 교반 추출한 후 300 메시 여과포로 여과한 다음 추출여액을 회전식 증발 건조기로 40℃로 감압 농축하였다. 이를 다시 80% 에탄올수용액으로 재용해 후 상온에서 하룻밤동안 방치한 다음 상등액을 회전식 증발 건조기로 40℃로 감압 농축하여 오가피 조추출물(5.32 ㎏)을 얻었다. 다음, 추출물 전량을 미리 10% 에탄올수용액으로 평형화시켜 놓은 다이아이온 HP20으로 충진시킨 직경 40 cm, 길이 2 m의 칼럼에 충진 후 순차적으로 10% 에탄올수용액, 20% 에탄올수용액, 40% 에탄올수용액 및 60% 에탄올수용액으로 350 L을 각각 차례로 용출하여 20 L씩 분획하였다. 이때, 10%(추출실시예 6), 20%(추출실시예 7) 및 40%(추출실시예 8) 에탄올 수용액을 회전식 증발 건조기로 40℃로 감압 농축하여 오가피 분말을 얻었고, 고속액체크로마토그래피로 오가피의 주요구성 성분인 클로로겐산, 카페익산 및 아칸토사이드 D의 함량을 측정하여 표 2에 나타내었다.

추출 실시예	분획 추출 용매	함량 %
추출 실시예	분획 추출 용매	클로로겐산	카페익산	아칸토사이드 D
6	10 % 에탄올 수용액	3.020±0.080	-	-
7	20 % 에탄올 수용액	7.811±0.059	0.394±0.008	-
8	40 % 에탄올 수용액	-	12.270±0.360	1.670±0.140

10% 에탄올 후반부부터 클로로겐산이 용출되었고, 20% 후반부가 되면 클로로겐산이 더 이상 용출되지 않음을 알 수 있었다.

<지표성분 함량조절 실시예 1 내지 4>

상기 추출실시예 6 내지 8의 과정에서 다이아이온 HP20으로의 용매 분획시 순차적으로 10% 에탄올수용액, 20% 에탄올수용액, 40% 에탄올수용액 및 60% 에탄올수용액으로 350 L을 각각 차례로 용출하여 20 L씩 소분획하였다. 즉, 10% 에탄올수용액 10개의 소분획층, 20%, 40%, 60% 에탄올수용액은 각각 20개의 소분획층으로 나눈 후 각각의 소분획층(총 70개)의 건조감량을 측정하고 오가피의 주요구성성분인 클로로겐산의 함량을 측정하였다. 20% 에탄올 수용액 중반부의 클로로겐산의 함량은 30 내지 40%로 높게 용출되어 클로로겐산의 함량이 높은 20% 에탄올 소분획층과 10% 및 40% 에탄올 각각의 소분획층을 조합하여 클로로겐산의 함량을 표 3과 같이 조절하여 회전식 증발 건조기로 40℃로 감압 농축하여 오가피 분말을 얻었다.

지표성분 함량조절 실시예	클로로겐산의 함량(%)
1	5.208±0.016
2	9.971±0.061
3	15.194±0.622
4	20.500±1.150

<실험예 1> 항산화효과시험

본 발명의 상기 각 지표성분 함량조절 실시예 1 내지 4에서 제조한 오가피 추출물 시료들에 대하여 항산화효과를 알아보기 위하여 자유라디칼소거시험과 활성산소소거시험을 실시하였다.

자유라디칼소거시험은 Kim 등(Kor. J. Pharmacogn., 24(4), 299~303, 1993)의 방법을 변형한 것으로 안정한 자유라디칼인 DPPH(1,1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl radical)을 이용하였다. 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 상기 지표성분 함량조절 실시예 1 내지 4에 따라 수득된 각각의 추출 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 2 mL 혼합하고, 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료용액 대신 메탄올을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, DPPH 용액 대신 메탄올을 이용하여 추출 시료 및 대조군 각각에 대한 색 보정값을 얻었다.

하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼소거율을 수치로 계산하여 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표 4에서 IC₅₀은 자유라디칼소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 수치로서 값이 작을수록 소거율이 높음을 나타낸다.

활성산소소거실험은 Noro 등(Chem. Pharm. Bull., 31, 3984~3987, 1983)의 방법을 변형한 것으로 잔틴/잔틴옥시다제(xanthine/xanthine oxidase) 효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 니트로 블루 테트라졸리움(NBT, nitroblue tetrazolim)의 산화에 의한 흡광도의 변화를 측정하였다.

Na₂CO₃ 2.4 mL, 잔틴 0.1 mL, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 0.1 mL, BSA (bovine serum albumin) 0.1 mL, NBT 0.1 mL 및 시료 0.1 mL을 넣고 잘 혼합하여 25℃에서 10분간 정치하였다. 잔틴옥시다제 0.1 mL을 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지시켰다. 그 후, 광파장 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료용액 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 잔틴옥시다제 용액 대신 정제수를 이용하여 추출 시료 및 대조군 각각에 대한 색 보정값을 얻었다.

하기 수학식 2를 이용하여 활성산소소거율을 수치로 계산하여 나타내었다. 하기 표 4에서 IC₅₀은 활성산소소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 수치로서 값이 작을수록 소거율이 높음을 나타낸다.

하기 표 4에서 상기 지표성분 함량조절 실시예 1 내지 4의 오가피 추출 시료와 비타민인 아스코르브산(L-ascorbic acid)과 토코페롤(dl-alpha-tocopherol)의 항산화효과를 비교하였다.

시료	자유라디칼소거능, IC₅₀ (ug/mL)	활성산소소거능, IC₅₀ (ug/mL)
지표성분 함량조절 실시예 1	48.210 ± 0.558	422.333 ± 7.930
지표성분 함량조절 실시예 2	30.104 ± 0.380	257.778 ± 7.930
지표성분 함량조절 실시예 3	25.173 ± 0.375	188.362 ± 3.764
지표성분 함량조절 실시예 4	1.748 ± 0.098	131.419 ± 2.235
클로로겐산	6.692 ± 0.172	38.919 ± 1.523
아스코르브산	3.018 ± 0.167	-
토코페롤	18.316 ± 0.030	225.327 ± 4.278

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 오가피 추출물의 주요성분인 클로로겐산은 토코페롤에 비하여 월등하며, 아스코르브산 동등 정도의 항산화효과를 나타내었다. 또한 클로로겐산의 함량에 의존적으로 오가피 추출물의 항산화효과가 증가함을 알 수 있었다. 특히, 지표성분 함량조절 실시예 4는 주요성분인 클로로겐산 및 비교용 항산화제인 아스코르브산보다 자유라디컬소거능이 월등함을 알 수 있었다.

<실험예 2> 세포생존율 시험

오가피 추출물(지표성분 함량조절 실시예 4) 및 클로로겐산의 화장품 원료로서의 1차 안전성을 검증하기 위하여 B16F1 (C57BL/6 유래 마우스 멜라닌 형성세포)을 이용한 세포생존율 평가 실험을 수행하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1은 ATCC (American Type Culture Collection)으로부터 분양받아 사용하였다.

세포를 10% 소혈청을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 1×10⁴ 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 시료를 농도별로 세포 배양 배지에 희석하여 처리하고 2일간 배양 후 세포 염색용 염료(MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가한 후, 4시간 동안 더 배양하였다. 염색결정체를 디메틸설폭시드(dimethy sulfoxide)로 녹여내어 540 nm에서 흡광도를 측정하여 상대 비교하였다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 배양액을 사용하였다. 하기 수학식 3을 이용하여 세포의 생존능력을 수치로 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.

시료	세포생존율(%)
시료	0 ug/mL	15 ug/mL	50 ug/mL	100 ug/mL	500 ug/mL
지표성분 함량조절 실시예 4	100	80.141	76.500	82.499	75.962
클로로겐산	100	84.940	82.706	84.485	81.175

상기 표 5에 나타낸 결과에서와 같이, 지표성분 함량조절 실시예 4 및 클로로겐산은 500 ug/mL의 고농도에서도 75% 이상의 세포생존율 보여 안전성이 우수함을 알 수 있었다.

<실험예 3> B16F1 멜라노싸이트를 이용한 세포 내의 멜라닌생성저해시험

전술한 지표성분 함량조절 실시예 4 및 클로로겐산의 미백효과를 검정하는 방법으로써, B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌생성저해율을 측정하여 미백효과를 판단하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Culture Collection)으로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌생성저해효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 10% 소혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제를 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 1×10⁵ 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 알파-MSH (melanocyte stimulating hormone, 0.2 uM)가 처리된 DMEM 10%에 10 mg/mL 농도로 시료를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 멜라닌 함량을 측정할 세트는 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내의 멜라닌 정량은 Lotan (Cancer Res., 40:3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 세포 펠렛에 1N NaOH (10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로플레이트 리더기로 490 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정하였으며, 멜라닌 표준곡선을 이용하여 멜라닌을 정량하였다. 정량된 멜라닌은 총단백질로 보정하여 나타내었다. 대조군으로는 시료를 처리하지 않은 배양액을 사용하였다. 하기 수학식 4를 이용하여 멜라닌생성저해율을 수치로 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 6에서는 상기 지표성분 함량조절 실시예 4 및 클로로겐산의 미백효과를 평가하기 위하여 미백제로 알려진 알부틴을 대조물질로 이용하였다.

시료	멜라닌 함량(%)
대조군	100
지표성분 함량조절 실시예 4	80.719±10.648
클로로겐산	72.700±16.884
알부틴	77.846±19.554

상기 표 6에 나타낸 결과에서와 같이, 지표성분 함량조절 실시예 4 및 클로로겐산은 10 mg/mL의 농도에서도 미백제로 알려진 알부틴과 유사한 정도의 미백효과를 나타내었다.

<제형 실시예 1 및 그 비교예 1>

상기 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 포함한 영양스킨의 성분구성을 하기 표 7과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	정제수	잔량	잔량
2	카보머	0.05	0.05
3	하이드록시에칠셀루로오스	0.05	0.05
4	부틸렌글라이콜	3.0	3.0
5	글리세린	2.0	2.0
6	피이지-1500	0.5	0.5
7	에탄올	4.0	4.0
8	폴리소르베이트 80	0.2	0.2
9	트리에탄올아민	0.05	0.05
10	방부제	미량	미량
11	지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물	0.2	－

상기 표 7의 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 6을 가하고, 성분 8 내지 10을 성분 7에 용해시킨 물질과 분취된 성분 4에 용해시킨 성분 11을 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다.

상기 제형 실시예 1에 대한 그 비교예 1은 성분 11인 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형 실시예 2 및 그 비교예 2>

상기 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 함유한 영양로션의 성분구성을 하기 표 8과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형 실시예 2	제형 비교예 2
1	세테아릴알코올	1.0	1.0
2	글리세릴스테아레이트	0.7	0.7
3	폴리소르베이트 60	1.2	1.2
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	세틸옥타노에이트	6.0	6.0
6	스쿠알란	4.0	4.0
7	마카데이나넛오일	3.0	3.0
8	부틸렌글라이콜	4.0	4.0
9	글리세린	4.0	4.0
10	카보머	0.15	0.15
11	산탄검	0.03	0.03
12	방부제	미량	미량
13	정제수	잔량	잔량
14	아르기닌	0.15	0.15
15	지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물	0.5	－

상기 표 8의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 7을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 8 내지 12를 성분 13에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화하였다. 이후, 상기 유화한 것을 성분 14로 중화하고, 56℃의 온도로 냉각한 후, 분취된 성분 8에 용해시킨 성분 15를 가하여 교반하고 실온에서 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 2에 대한 그 비교예 2는 성분 15인 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형 실시예 3 및 그 비교예 3>

상기 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 함유한 영양에센스의 성분구성을 하기 표 9와 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형 실시예 3	제형 비교예 3
1	정제수	잔량	잔량
2	카보머	0.2	0.2
3	하이드록시에칠셀루로오스	0.1	0.1
4	부틸렌글라이콜	8.0	8.0
5	글리세린	6.0	6.0
6	소듐히아루로네이트	150	15.0
7	에탄올	4.0	4.0
8	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.1	0.1
9	트리에탄올아민	0.2	0.2
10	방부제	미량	미량
11	지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물	5.0	-

상기 표 9의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 5 및 6을 가하고, 성분 8 내지 10을 성분 7에 용해시킨 물질과 분취된 성분 4에 용해시킨 성분 11을 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다.

상기 제형 실시예 3에 대한 그 비교예 3은 성분 11인 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형 실시예 4 및 그 비교예 4>

상기 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 함유한 영양크림의 성분구성을 하기 표 10과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형 실시예 4	제형 비교예 4
1	세테아릴알코올	1.5	1.5
2	글리세릴스테아레이트	1.0	1.0
3	폴리소르베이트 60	1.2	1.2
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	세틸옥타노에이트	6.0	6.0
6	스쿠알란	8.0	8.0
7	아프리코드커넬오일	4.0	4.0
8	디메치콘	1.0	1.0
9	부틸렌글라이콜	5.0	5.0
10	그릴세린	4.0	4.0
11	마그네슘알루미늄실리케이트	0.2	0.2
12	산탄검	0.05	0.05
13	방부제	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
15	지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물	1.0	－

한편, 상기 표 10의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 8을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 9 내지 13을 성분 14에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화하였다. 이후, 상기 유화한 것을 56℃의 온도로 냉각한 후, 분취된 성분 9에 용해시킨 성분 15를 가하여 교반하고 실온에서 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 4에 대한 그 비교예 4는 성분 15인 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형 실시예 5 및 그 비교예 5>

상기 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 함유한 영양팩의 성분구성을 하기 표 11과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형 실시예 5	제형 비교예 5
1	정제수	잔량	잔량
2	부틸렌글라이콜	3.0	3.0
3	글리세린	2.0	2.0
4	폴리비닐알코올	2.0	2.0
5	폴리비닐피롤리돈	10.0	10.0
6	셀룰로오스검	0.3	0.3
7	마이카	2.0	2.0
8	카올린	2.0	2.0
9	에탄올	5.0	5.0
10	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.3	0.3
11	방부제	미량	미량
12	지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물	2.0	-

상기 표 11의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 첨가한 후, 성분 4 내지 6을 가하여 교반 분산시키면서 70℃로 가열하였다. 다음 성분 7 내지 8을 가하여 충분히 분산시키고 56℃의 온도로 냉각하였다. 성분 10 내지 11을 성분 9에 용해시킨 물질과 분취된 성분 2에 용해시킨 성분 12를 차례로 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 5에 대한 그 비교예 5는 성분 12인 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 오가피 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<실험예 5> 피부의 미백효과 및 피부자극 관능시험

본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물의 피부 미백효과 및 피부자극을 평가하기 위하여, 상기 제형 실시예 4와 제형 비교예 4에서 제조된 영양크림을 이용하여 관능시험을 실시하였다.

구체적으로, 제형 실시예 4와 제형 비교예 4의 영양크림을 피부에 각각 도포했을 때 피부의 미백효과를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 20명에게 안면 왼쪽 부분에는 제형 실시예 4의 영양크림(시험군)을, 안면 오른쪽 부분에는 제형 비교예 4의 영양크림(대조군)을 1일 1회 12주간 지속적으로 사용하게 하였다.

관능시험에서 피부의 미백효과 항목에 대하여는 제형 비교예 4의 영양크림을 기준으로 제형 실시예 4의 영양크림이 나타내는 미백효과를 상대적으로 평가하게 하였고, 피부자극에 대한 관능평가는 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 등의 현상을 평가하게 하였다. 평가는 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 표 12에서 피부자극은 피부자극이 없는 정도를 나타낸다.

번호	피부자극		미백효과
번호	제형 실시예 4	제형 비교예 4	미백효과
1	4	5	5
2	5	5	5
3	5	4	5
4	3	4	4
5	4	4	5
6	5	5	5
7	4	4	4
8	4	4	4
9	5	5	5
10	4	4	4
11	5	5	5
12	5	5	5
13	3	4	4
14	4	4	4
15	5	4	4
16	4	4	4
17	5	5	5
18	5	5	5
19	5	5	5
20	4	4	4
평균	4.40	4.45	4.55

상기 표 12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제형 실시예 4의 화장료 조성물에 대한 피부자극 평가점수는 4.40점으로 매우 양호하게 평가되어, 제형 비교예 4와 마찬가지로 피부자극 정도가 낮아 피부 안전성이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 제형 비교예 4 대비 제형 실시예 4의 화장료 조성물이 가진 상대적인 피부의 미백효과는 평가점수 4.55점으로 개선 정도가 매우 우수함을 알 수 있었다.

<실험예 6> 피부의 안전성 실험

상기 지표성분 함량조절 실시예 4에 따른 미백추출물과 제형 실시예 4에 대한 피부 안전성, 즉 피부반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 한국식품의약품안전청 기준 피부안전성 검사법에 따라 인체첩포시험을 실시하였다.

피험자로 20세 이상 50세 이하의 건강한 성인 남, 여 30명을 선정하였고, 첩포시험은 대상자 상박 내측에 첩포를 부착하였으며 48시간이 지난 후 첩포를 제거하였다. 약 60분간 안정을 취하도록 한 후 첫 판독을 시행하였고, 첩포 부착 후 96시간이 경과한 후 2차 판독을 시행하였다. 판정기준은 하기 표 13에 나타낸 바와 같다.

반응	가중치	판정의 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포

첩포 부착 후 48시간과 96시간에 판독한 결과를 하기 수학식 5를 이용하여 시료에 대한 피부 반응도로 산출하였다.

첩포시험의 검사 결과에 근거하여 계산된 양성 반응을 보인 시료의 피부 자극도를 하기 표 14에 나타내었다.

시료	48시간		96시간		반응도(%)
시료	+	++	+	++	48시간	96시간	평균
지표성분 함량조절 실시예 4 (0.2% in 증류수)	-	-	-	-	0.00	0.00	0.00
지표성분 함량조절 실시예 4 (1.0% in 증류수)	-	-	-	-	0.00	0.00	0.00
제형 실시예 4	-	-	-	-	0.00	0.00	0.00

상기 표 14에 제시된 바와 같이, 각각의 지표성분 함량조절 실시예 4와 제형 실시예 4는 인체첩포시험에서 하기 표 15에 따른 피부 반응도 판정 기준에 의하면 무자극으로 민감한 피부에 사용해도 좋은 결과로 나타났다. 따라서 상기 추출 실시예들에 따른 오가피 추출물은 천연물로서 피부부작용이 없는 안전한 성분으로 나타났다.

피부의 평균 반응도	판정 기준
0.0 ∼ 0.9	무자극
1.0 ∼ 2.9	경자극
3.0 ∼ 4.9	중자극
5.0 이상	강자극

Claims

오가피로부터 추출된 클로로겐산(chlorogenic acid) 분획을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장수, 에센스, 스킨, 로션, 크림, 팩, 파운데이션 및 메이크업베이스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
(S1) 오가피를 분쇄하는 단계;

(S2) 오가피를 70 내지 85% 에탄올 수용액으로 상온 또는 냉침 추출하는 단계;

(S3) 추출여액을 20 내지 50℃에서 감압농축하여 조추출물을 얻는 단계;

(S4) 조추출물을 이온수지컬럼크로마토그래피에 충진시킨 후 순차적으로 에탄올의 함량을 높여가며 에탄올 수용액으로 용출하는 단계; 및

(S5) 10 내지 40% 에탄올 수용액 분획을 회수하여 클로로겐산의 함량을 조절하는 단계를

포함하는 것을 특징으로 하는 미백 효과가 향상된 오가피 추출물을 제조하는 방법.