CN103675188A - 一种药物组合物的薄层色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种药物组合物的薄层色谱鉴别方法，该药物组合物中含有贯叶金丝桃或刺五加中的一种或两种，该药物组合物经过提取、纯化、富集、溶解等处理后得到样品溶液，将该样品溶液点于硅胶薄层板上，以体积比为7~18:1~3:1乙酸乙酯：甲酸：水或体积比为4~8:1~8:1的甲苯：乙酸乙酯：甲醇为展开剂展开后显色，置于紫外光灯下检视。该方法对药物组合物中贯叶金丝桃和/或刺五加的活性成分均能有效分离，目标斑点定位清晰，检测结果准确有效、无干扰，且该方法操作简单，检测成本低。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物组合物的薄层色谱检测方法。
背景技术
薄层色谱法是将适宜的吸附剂或载体涂布于玻璃板上，将处理后的样品点样后经展开剂展开并显色后，与对照物质的斑点做比较，从而进行定性检测或者含量测定的方法，其主要原理是利用混合物中各组分与吸附剂及展开剂的吸附和溶解能力不同来达到不同组分之间分离的目的。薄层色谱法是中药检测、中药制剂质量研究和控制的主要手段之一，对中药的质量鉴定具有十分重要的意义。薄层色谱检测方法在我国各版药典中的均被广泛应用，如2005年版药典中共收载采用薄层色谱法检测的中药品种1507项，2010年版药典中仅新增就达2494项[中药薄层色谱影响因素分析及应用，李向军等，药学专论，2011,20（14）]。与其他中药质量鉴定方法相比，薄层色谱方法在中药质量控制当中具有以下优点：（1）所用设备简单，操作方便，检测成本低；（2）分离时间短且可以同时批量分离多个样品；（3）分离能力强，灵敏度高，检测限可低至微克级。
抑郁症是一种常见的精神疾病，主要表现为情绪低落、兴趣减低、悲观、思维迟缓、自责自罪、饮食睡眠差、担心或感到全身多处不适、严重者可出现自杀念头和行为。目前，抑郁症已迅速成为全球疾病中给人类造成严重负担的第二位重要疾病，对患者及其家属造成的痛苦和对社会造成的损失是其他疾病所无法比拟的。舒肝解郁胶囊是国内首个SFDA批准的用于治疗抑郁的中成药。主要的功效为健脾安神，适用于轻、中度单相抑郁症属肝郁脾虚证者，症见情绪低落、兴趣下降、迟滞、入睡困难、早醒、多梦、紧张不安、急躁易怒、食少纳呆、胸闷、疲乏无力、多汗、疼痛、舌苔白或腻，脉弦或细。该药是在吸取中医有关治疗抑郁的经验基础上，借鉴国内外现代医学治疗抑郁的最新研究成果配方而得。舒肝解郁胶囊的作用机制是通过其有效成分透过血脑屏障对海马神经元的萎缩以及中枢局部组织的生化失调产生重要的保护作用。有临床报道舒肝解郁胶囊对轻中度抑郁有效率为68.10%，远较安慰剂的29.0%高，差异具有统计学意义，临床总体疗效评估也证实了舒肝解郁胶囊抗抑郁疗效明显优于安慰剂，并且其安全性及耐受性良好[药物组合物治疗轻中度抑郁症的随机双盲安慰剂对照研究，孙新宇等，临床研究，2009,18(5)]。因此，舒肝解郁胶囊是一种疗效和安全性俱佳的纯中药制剂。
舒肝解郁胶囊由贯叶金丝桃、刺五加两味中药组成。贯叶金丝桃已经有2400年的使用历史，近年来对贯叶金丝桃的研究热点放在抗抑郁功效方面。贯叶金丝桃经醇提取后获得的主要成分为6类：萘并二蒽酮类（naphthoi-anthrones）、间苯三酚类（phloroglucinols）、黄酮类（flavonoids）、双黄酮类（biflavones）、苯丙烯酸类（phenylpropanes）、原花青素（proanthocyanidins）。另外，还有少量的单宁酸、氧杂蒽酮、挥发油和氨基酸等。刺五加始见于《神农本草经》，2010年版《中国药典》记载其有“益气健脾，补肾安神”的功效。文献报道其主要的化学成分有刺五加皂苷、黄酮类、多糖类、三萜皂苷类、木脂素和咖啡酰奎宁酸类等。由于药物组合物使用的药材贯叶金丝桃和刺五加均具有复杂的化学成分，因此，建立一种操作简单、快速、有效、灵敏度高的薄层色谱检测方法，对于舒肝解郁胶囊的质量控制来说具有十分重要的意义。
目前对于含有贯叶金丝桃和刺五加的药物组合物（如舒肝解郁胶囊）的薄层色谱检测尚未见报道。对于刺五加或贯叶金丝桃的单独药材的薄层色谱检测方法有一定报道，例如，现行的2010版《中国药典一部》中分别公开了刺五加和贯叶金丝桃的薄层色谱检测方法（以下简称药典方法）。但是，申请人通过实验获知，使用该药典方法检测刺五加药材、贯叶金丝桃药材以及含有刺五加和贯叶金丝桃的药物组合物存在诸多问题：1）色素干扰严重，由于色素在显色剂及紫外条件下显示棕红色，造成了目标斑点的不明显或难以辨别；2）所得色谱条带拖尾情况明显，斑点分离度差；3）不适合检测包含刺五加和贯叶金丝桃的药物组合物，不能有效分离药物组合物样品中所需检测的活性成分，所得样品的目标斑点分离度差，难以对其有效成分进行有效的定位和检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案。
本发明一方面提供一种药物组合物的薄层色谱检测方法，所述检测方法包含以下步骤：取药物组合物样品溶液按照中国药典2010版一部附录ⅥB的薄层层析法，点于硅胶薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：水为展开剂展开后显色，置于紫外光灯下检视；其中所述药物组合物中含有贯叶金丝桃或刺五加中的一种或两种；所述展开剂乙酸乙酯：甲酸：水的体积比为7~18:1~3:1；优选12~18:1~3:1；更优选为15:1:1。
上述检测方法中所述药物组合物中刺五加的薄层色谱检测时，展开剂也可以为甲苯：乙酸乙酯：甲醇；所述展开剂甲苯：乙酸乙酯：甲醇的体积比为4~8:1~8:1；优选4~8:2~6:1；更优选为5:4:1。
上述检测方法中所述药物组合物样品溶液的制备方法优选为：取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量20-40倍体积比的甲醇，超声处理20-50分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量10-30倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量5-30倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液。
所述药物组合物样品溶液的制备方法更优选为：取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量25倍体积比的甲醇，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液。
所述的药物组合物样品溶液的制备方法最优选为：取药物组合物2mg，加甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml使其溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇10ml溶解制成样品溶液。
本发明更进一步提供了一种药物组合物的薄层色谱检测方法，其包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量20-40倍体积比的甲醇，超声处理20-50分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量10-30倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量5-30倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；其中所述药物组合物中含有贯叶金丝桃或刺五加中的一种或两种；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；
芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
a）刺五加的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各5~10ul，点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇的混合溶液为展开剂，展开剂比例为4~8:1~8:1，取出，晾干，用1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b）贯叶金丝桃的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各2~5ul，点于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水混合溶液为展开剂展开，展开剂比例为7~18:1~3:1，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
本发明又进一步提供了一种药物组合物的薄层色谱检测方法，其包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量25倍体积比的甲醇，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；
芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
a）刺五加的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各10ul，点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇的混合溶液为展开剂，展开剂比例为5:4:1，取出，晾干，用1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b）贯叶金丝桃的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各2ul，点于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水混合溶液为展开剂展开，展开剂比例为15:1:1，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
本发明还提供了一种薄层色谱检测方法，其包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量20-40倍体积比的甲醇，超声处理20-50分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量10-30倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量5-30倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；其中所述药物组合物中含有贯叶金丝桃或刺五加中的一种或两种；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；
芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法试验，分别吸取药物组合物样品、对照品溶液各5~10ul，点于同一硅胶G薄层板上，以7~18:1~3:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
本发明更进一步提供了一种药物组合物的薄层色谱检测方法，其包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量25倍体积比的甲醇，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；
芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法试验，分别吸取药物组合物样品、对照品溶液各5~0ul，点于同一硅胶G薄层板上，以15:1：1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明提供的薄层色谱检测方法，能够有效去除样品中的色素，显著减少药物组合物（刺五加药材、贯叶金丝桃药材或含有刺五加和贯叶金丝桃的药物组合物）中所含色素在薄层色谱层析中的干扰，保证了目标斑点定位的准确识别，和结果的可靠性。
2、本发明提供的薄层色谱检测方法，药物组合物（刺五加、贯叶金丝桃药材或含有刺五加和贯叶金丝桃的药物组合物）薄层色谱展开效果好，目标斑点（对照品）清晰易于分辨，保证了目标斑点定位的唯一性。
3、本发明提供的薄层色谱检测方法，对于药物组合物（刺五加药材、贯叶金丝桃药材或含有刺五加和贯叶金丝桃的药物组合物）中各种活性成分的提取都非常有效，并且对于药物组合物中的各种成分，特别是成分复杂的舒肝解郁胶囊中的有效成分均有较好的分离，是上述药物组合物检测的有效方法。
4、本发明提供的薄层色谱检测方法提取方法操作简单，仅需要超声处理与溶剂提取相结合，无需渗漉、回流等较为复杂的提取手段，且药物组合物样品与两种对照药材的提取方法步骤相同，进一步简化了检测方法，节约检测成本。
附图说明
图1药典记载薄层色谱方法检测药物组合物中刺五加，其中1、2为异嗪吡啶对照品，3为刺五加对照药材、4为药物组合物样品，5、6为刺五加阴性对照品（即贯叶金丝桃药材浸膏）
图2药典记载薄层色谱方法检测药物组合物中贯叶金丝桃，其中1、2为贯叶金丝桃对照药材，3、4为药物组合物样品，5、6为贯叶金丝桃阴性对照品（即刺五加药材浸膏）
图3薄层色谱检测刺五加方法中展开剂研究，其中1、14为刺五加对照药材，2为刺五加阴性对照品（即贯叶金丝桃药材浸膏），3-13为药物组合物样品
图4薄层色谱检测贯叶金丝桃方法中展开剂研究，其中1为贯叶金丝桃对照药材，2为贯叶金丝桃阴性对照品（刺五加药材浸膏），3-13为药物组合物样品，14为芦丁对照品，15为金丝桃苷对照品，16为异槲皮苷对照品
图5本发明薄层色谱方法检测舒肝解郁胶囊中刺五加，其中1为刺五加对照药材，2为刺五加阴性对照品(贯叶金丝桃药材浸膏)，3-13为药物组合物样品，14为异嗪吡啶对照品
图6本发明薄层色谱方法检测药物组合物中贯叶金丝桃，其中1为贯叶金丝桃对照药材，2为贯叶金丝桃阴性对照品（刺五加药材浸膏），3-13为药物组合物样品，14为芦丁对照品，15为金丝桃苷对照品，16为异槲皮苷对照品
图7本发明薄层色谱方法检测舒肝解郁胶囊，其中1为贯叶金丝桃对照药材，2为贯叶金丝桃阴性对照品（刺五加药材浸膏），3-13为药物组合物样品（舒肝解郁胶囊），14为芦丁对照品，15为金丝桃苷对照品，16为异槲皮苷对照品
具体实施方式
本发明通过以下实施方式进行进一步阐述，本发明包括但不限于下述实施例。
实施例一2010版药典方法
1、药品
对照药材：刺五加对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：120991-200405）、贯叶金丝桃对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：121506-200501）
刺五加阴性对照：贯叶金丝桃药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111019）、贯叶金丝桃阴性对照：刺五加药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111108）
含有贯叶金丝桃和刺五加的药物组合物：图1、图2中样品（按照实施例六制备）
对照品：异嗪皮啶（来源：中国药品生物制品检定所，批次：110837-200304）、芦丁（来源：中国药品生物制品检定所，批次：100080-200707）、金丝桃苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111521-201004）、异槲皮苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111809-201102）。
2、试剂及仪器
试剂：甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、乙醚（分析纯，成都富宇精细化工有限公司）、乙酸乙酯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲苯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲酸（分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心）、三氯化铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、无水乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）
仪器：薄层色谱G板（青岛海洋化工厂分厂，100×200mm）、暗箱式紫外分析仪（ZF-20D，上海顾村电光仪器厂）、电热鼓风干燥箱（TST101A-3B，成都特斯特仪器有限公司）。
3、薄层色谱检测方法
按照2010版《中国药典一部》刺五加、贯叶金丝桃薄层色谱检测方法检测。
刺五加检测
样品制备：
药物组合物样品制备：取按照实施例六制备的样品（批号101002）粉末5g，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次5m1，合并三氯甲烷层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
刺五加药材样品制备：取刺五加对照药材5g，按上述药物组合物样品制备的方法制成溶液。
异嗪皮啶对照品制备：加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照品制备：加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对阴性照品溶液。
检测方法：
按照《薄层色谱法检验标准操作程序》(中国药典2010版附录ⅥB)，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷一甲醇(19：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。检测结果如图1所示。
贯叶金丝桃检测
样品制备：
药物组合物样品制备：取按照实施例六制备的样品（批号101002）粉末0.1g，加甲醇10ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
贯叶金丝桃药材样品制备：取贯叶金丝桃对照药材0.1g，按照上述药物组合物样品制备方法制成对照药材溶液。
检测方法：
按照《薄层色谱法检验标准操作程序》(中国药典2010版附录ⅥB)，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯一甲酸(25：1)为展开剂，展开，取出，立即置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，结果如图2所示。
实施例二含有刺五加和贯叶金丝桃的药物组合物的薄层色谱检测方法研究
本发明通过大量实验研究对所述药物组合物的薄层色谱检测方法进行研究，部分实验内容如下：
1、药品
对照药材：刺五加对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：120991-200405）、贯叶金丝桃对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：121506-200501）
刺五加阴性对照：贯叶金丝桃药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111019）、
贯叶金丝桃阴性对照：刺五加药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111108）
药物组合物：按照实施例六方法制备
对照品：异嗪皮啶（来源：中国药品生物制品检定所，批次：110837-200304）、芦丁（来源：中国药品生物制品检定所，批次：100080-200707）、金丝桃苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111521-201004）、异槲皮苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111809-201102）。
2、试剂及仪器
试剂：甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、乙醚（分析纯，成都富宇精细化工有限公司）、乙酸乙酯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲苯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲酸（分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心）、三氯化铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、无水乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）
仪器：薄层色谱G板（青岛海洋化工厂分厂，100×200mm）、暗箱式紫外分析仪（ZF-20D，上海顾村电光仪器厂）、电热鼓风干燥箱（TST101A-3B，成都特斯特仪器有限公司）。
3、药物组合物样品提取方法的研究及结果
（1）薄层色谱中的提取方法的研究，步骤为：取上述药物组合物样品2g，加适量提取溶剂，超声处理，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解后用萃取剂（纯化）振摇提取若干次，弃去乙醚后，水相用适量萃取剂（富集）振摇提取，合并萃取剂，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液。
上述步骤中的条件进行研究，其中部分结果如表1所示：
表1提取方法比较研究
从以上实验数据可以看出：
1）对纯化用萃取溶剂进行比较研究获知，乙醚提取比其余试剂能更有效的去除药材中的色素，减少色素干扰，同时获知乙醚总体积为药材质量30倍（v/w）以上时，色素去除较为干净；为更好的去除色素，可将乙醚分次加入振摇洗脱，因此，乙醚振摇次数优选为2-5次，更优选为3次，每次振摇乙醚体积优选为样品质量的10-30倍，更优选为10倍。
2）固定萃取剂乙醚及最佳倍数，考察富集萃取溶剂获知，乙酸乙酯、甲酸乙酯均能有效富集活性成分，且总体积为药材质量20倍（v/w）以上时，富集效果较好，为更好的去除色素，将富集萃取溶剂分次加入振摇洗脱。因此，富集萃取溶剂振摇次数优选为2-5次，更优选为3次；每次振摇富集萃取溶剂体积优选为样品质量的5-30倍，更优选为10倍。
3）固定萃取剂及富集溶剂的用量，考察甲醇、乙醇及正丁醇的提取效果获知，以甲醇为溶剂可以同时有效的提取药物组合物样品中的有效成分，而乙醇及正丁醇提取时，提取效率较差，进一步对甲醇用量进行考察后发现，甲醇体积为样品质量的20倍（v/w）以上时能够有效提取活性成分，根据节约试剂原则，优选20-40倍，更优选25倍。
4）固定上述3项考察后确定的因素，对提取方式及时间进行考察后发现，超声30min与回流90min的效果相当，且超声操作与回流相比简单可行，超声时间20min以上均能达到有效提取的目的，节约时间，因此本方法选用超声提取，超声时间优选20-50分钟，更优选30分钟。
4、薄层色谱层析方法的研究及结果
药物组合物样品（按照实施例六制备）制备：取样品2g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯液振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇10ml溶解制成样品溶液；
刺五加、贯叶金丝桃对照药材样品的制备：分别取刺五加、贯叶金丝桃对照药材，同药物组合物样品的制备方法制成对照药材溶液；
异嗪皮啶对照品制备：取异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；
金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、芦丁对照品的制备：分别取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、芦丁对照品分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液。
本发明中薄层色谱层析中步骤（a）（检测刺五加）为：分别取照上述方法制备的对照药材样品溶液、药物组合物样品溶液、对照品溶液，照薄层层析法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，点于同一硅胶G薄层板上。以甲苯一乙酸乙酯一水为展开剂展开后显色，置紫外光灯(365nm)下检视。
本发明中薄层色谱层析中步骤（b）（检测贯叶金丝桃）为：分别取照上述提取方法制备的对照药材样品溶液、药物组合物样品溶液、对照品溶液，照薄层层析法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，点于同一硅胶G薄层板上。以乙酸乙酯一甲酸一水为展开剂展开后显色，置紫外光灯(365nm)下检视。
本发明对上述步骤（a）及步骤（b）中的展开剂条件做了大量研究，其中部分研究如表2、表3，表4、表5所示：
表2步骤（a）展开条件比较1
表3步骤（a）展开条件比较2
从以上实验数据可以看出：
步骤a）中，当展开剂甲苯-甲酸-水范围为4~8:1~8:1时，均能分离出目标斑点，对有效成分定位清楚，当展开剂范围为4~8:2~6:1时，目标品斑点分离更清晰，特别是当展开剂范围为5:4:1时，对有效成分的分离最为有效，目标斑点清晰无拖尾；
当展开体系为乙酸乙酯-甲酸-水（15:1:1）时，检测结果如图3所示，虽然目标斑点Rf值略高，但目标斑点分离效果好，无拖尾，能够有效检测舒肝解郁胶囊中的刺五加、刺五加药材。
表4步骤（b）展开条件比较1
表5步骤（b）展开条件比较2
从以上实验数据可以看出：
步骤b）中，当展开剂范围为7~18:1~3:1时，均能分离出目标斑点，对各有效成分均能有效定位，当展开剂范围为12~18:1~3:1时，目标斑点分离更为清晰，无拖尾现象，特别是当展开剂范围为15:1:1时，不仅能有效分离所有有效成分目标斑点，且清晰无拖尾；
当展开体系为三氯甲烷-甲酸-水（13:6:1）时，检测结果如图4所示，无法分离目标斑点。
实施例三舒肝解郁胶囊薄层色谱检测方法
1、药品
对照药材：刺五加对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：120991-200405）、贯叶金丝桃对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：121506-200501）
刺五加阴性对照：贯叶金丝桃药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111019）、贯叶金丝桃阴性对照：刺五加药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111108）
舒肝解郁胶囊样品：图5、图6中3-13对应的样品的批号为100703、111114、100802、111212、111204、100601、120312、110412、111004、110705、101002，生产厂家：成都康弘药业集团股份有限公司
对照品：异嗪皮啶（来源：中国药品生物制品检定所，批次：110837-200304）、芦丁（来源：中国药品生物制品检定所，批次：100080-200707）、金丝桃苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111521-201004）、异槲皮苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111809-201102）。
2、试剂及仪器
试剂：甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、乙醚（分析纯，成都富宇精细化工有限公司）、乙酸乙酯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲苯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲酸（分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心）、三氯化铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、无水乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）
仪器：薄层色谱G板（青岛海洋化工厂分厂，100×200mm）、暗箱式紫外分析仪（ZF-20D，上海顾村电光仪器厂）、电热鼓风干燥箱（TST101A-3B，成都特斯特仪器有限公司）。
3、薄层色谱检测
样品制备：
舒肝解郁胶囊样品制备：取样品2g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯液振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇10ml溶解制成样品溶液；
刺五加、贯叶金丝桃对照药材样品的制备：分别取刺五加、贯叶金丝桃对照药材，同药物组合物样品的制备方法制成对照药材溶液；
异嗪皮啶对照品制备：取异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；
金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、芦丁对照品的制备：分别取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、芦丁对照品分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液。
刺五加、贯叶金丝桃阴性对照品制备：取贯叶金丝桃浸膏、刺五加浸膏加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对阴性照品溶液。
检测方法：
刺五加检测：分别吸取上述刺五加对照药材、药物组合物样品、异嗪皮啶对照品溶液10ul，照薄层层析法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，点于同一硅胶G薄层板上。以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(5：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色，在105℃烘箱中加热2-5分钟烘干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，薄层色谱图如图5所示。
贯叶金丝桃检测：分别吸取上述贯叶金丝桃对照药材、药物组合物样品、金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、芦丁对照品溶液2ul，照薄层层析法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，点于同一硅胶G薄层板上。以乙酸乙酯一甲酸一水(15：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色，在105℃烘箱中加热2-5分钟烘干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，薄层色谱图如图6所示。
4、结论
对比图1与图5、图2与图6可以看出：药典方法所得到的舒肝解郁胶囊中刺五加和贯叶金丝桃、刺五加药材、贯叶金丝桃药材的薄层色谱检测结果，均存在严重的色素干扰，在紫外条件下有明显的红色条带，导致基本难以辨别目标斑点，并且条带拖尾明显，目标斑点基本未能得到分离，因此该方法无法对舒肝解郁胶囊、刺五加药材和贯叶金丝桃药材进行有效的检测。而本发明所述方法得到的薄层色谱检测结果中，舒肝解郁胶囊样品以及刺五加、贯叶金丝桃药材均无红色色素干扰，且各活性组分对应的目标斑点分离度好，清楚明确，定位容易，是对舒肝解郁胶囊、刺五加药材和贯叶金丝桃药材进行检测的有效手段。
实施例四舒肝解郁胶囊薄层色谱检测方法
1、药品
对照药材：刺五加对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：120991-200405）、贯叶金丝桃对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：121506-200501）。
刺五加阴性对照：贯叶金丝桃药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111019）、贯叶金丝桃阴性对照：刺五加药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111108）
舒肝解郁胶囊样品：样品批次分别为100703、111114、100802、111212、111204、100601、120312、110412、111004、110705、101002。生产厂家：成都康弘药业集团股份有限公司。
对照品：异嗪皮啶（来源：中国药品生物制品检定所，批次：110837-200304）、芦丁（来源：中国药品生物制品检定所，批次：100080-200707）、金丝桃苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111521-201004）、异槲皮苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111809-201102）。
2、试剂及仪器
试剂：甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、乙醚（分析纯，成都富宇精细化工有限公司）、乙酸乙酯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲苯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲酸（分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心）、三氯化铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、无水乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）
仪器：薄层色谱G板（青岛海洋化工厂分厂，100×200mm）、暗箱式紫外分析仪（ZF-20D，上海顾村电光仪器厂）、电热鼓风干燥箱（TST101A-3B，成都特斯特仪器有限公司）。
3、薄层色谱检测方法
药物组合物样品溶液的制备：取舒肝解郁胶囊样品2g，加甲醇60ml，超声处理40分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇提取5次，每次30ml，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯液振摇提取3次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇6ml溶解制成样品溶液；
刺五加、贯叶金丝桃对照药材样品的制备：取刺五加、贯叶金丝桃对照药材，按照药物组合物溶液的制备方法制成对照药材溶液；
异嗪皮啶对照品的制备：取异嗪皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁对照品的制备：取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、芦丁对照品，分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液。
刺五加、贯叶金丝桃阴性对照品制备：取贯叶金丝桃浸膏、刺五加浸膏加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对阴性照品溶液。
检测方法：
刺五加的检测：分别吸取上述刺五加对照药材、药物组合物样品、异嗪皮啶对照品溶液5ul，照薄层层析法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，点于同一硅胶G薄层板上。以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(8：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色，在105℃烘箱中加热2-5分钟烘干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。薄层色谱无红色色素干扰，各目标斑点分离较好，定位清楚。
贯叶金丝桃的检测：分别吸取上述贯叶金丝桃对照药材、药物组合物样品、金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、芦丁对照品溶液3ul，照薄层层析法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，点于同一硅胶G薄层板上。以乙酸乙酯-甲酸-水(18：3：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色，在105℃烘箱中加热2-5分钟烘干，置紫外光灯(365nm)下检视。
供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。薄层色谱无红色色素干扰，各目标斑点分离较好，定位清楚。
实施例五舒肝解郁胶囊的薄层色谱检测
1、药品
对照药材：刺五加对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：120991-200405）、贯叶金丝桃对照药材（来源：中国药品生物制品检定所，批次：121506-200501）。
刺五加阴性对照：贯叶金丝桃药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111019）、贯叶金丝桃阴性对照：刺五加药材浸膏（成都华高药业有限公司：HG 20111108）
舒肝解郁胶囊样品：批次分别为100703、111114、100802、111212、111204、100601、120312、110412、111004、110705、101002对照品：异嗪皮啶（来源：中国药品生物制品检定所，批次：110837-200304）、芦丁（来源：中国药品生物制品检定所，批次：100080-200707）、金丝桃苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111521-201004）、异槲皮苷（来源：中国药品生物制品检定所，批次：111809-201102）。
2、试剂及仪器：
试剂：甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、乙醚（分析纯，成都富宇精细化工有限公司）、乙酸乙酯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲苯（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、甲酸（分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心）、三氯化铝（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、无水乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）
仪器：薄层色谱G板（青岛海洋化工厂分厂，100×200mm）、暗箱式紫外分析仪（ZF-20D，上海顾村电光仪器厂）、电热鼓风干燥箱（TST101A-3B，成都特斯特仪器有限公司）。
3、薄层色谱检测方法
取舒肝解郁胶囊样品2g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解制成样品溶液，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯液振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇10ml溶解制成样品溶液。
取刺五加、贯叶金丝桃对照药材，同法制成对照药材溶液。取异嗪皮啶、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml各含0.5mg的溶液。
取贯叶金丝桃浸膏、刺五加浸膏加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对阴性照品溶液。
照薄层层析法（中国药典2010版一部附录ⅥB）试验，分别吸取上述溶液各10ul，点于同一硅胶G薄层板上。以乙酸乙酯-甲酸-水(15：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色，在105℃烘箱中加热2-5分钟烘干，置紫外光灯(365nm)下检视。
实验结果如图7所示，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且斑点分离度好，无拖尾显现象，无色素干扰。
实施例六药物组合物的制备
贯叶金丝桃1800克 刺五加1500克
制备方法如下：
称取上述配方量的两味药物，其中贯叶金丝桃加70％乙醇回流提取2次，第一次加10倍量乙醇，第二次加8倍量乙醇，每次回流提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.10的浸膏，喷雾干燥得干浸膏粉；刺五加药材粉碎成碎块，加8倍量水，煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.18的浸膏，喷雾干燥得干浸膏粉。取上述两种提取物，加入适量预凝胶淀粉、滑石粉、硬脂酸镁混合均匀，装入1000粒胶囊，即得。
Claims (10)
1.一种药物组合物的薄层色谱检测方法，其特征在于所述检测方法包含以下步骤：取药物组合物样品溶液按照中国药典2010版一部附录ⅥB的薄层层析法，点于硅胶薄层板上，以乙酸乙酯：甲酸：水为展开剂展开后显色，置于紫外光灯下检视；其中所述药物组合物中含有贯叶金丝桃或刺五加中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于所述展开剂为乙酸乙酯：甲酸：水的体积比为7~18:1~3:1；优选12~18:1~3:1；更优选为15:1:1。
3.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于所述药物组合物中刺五加的薄层色谱检测时，展开剂可以为甲苯：乙酸乙酯：甲醇；所述展开剂甲苯：乙酸乙酯：甲醇的体积比为4~8:1~8:1；优选为4~8:2~6:1；更优选为5:4:1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的薄层色谱检测方法，其特征在于所述药物组合物样品溶液的制备方法为：取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量20-40倍体积比的甲醇，超声处理20-50分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量10-30倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量5-30倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液。
5.根据权利要求4所述的薄层色谱检测方法，其特征在于所述药物组合物样品溶液的制备方法为：取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量25倍体积比的甲醇，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液。
6.根据权利要求5所述的薄层色谱检测方法，其特征在于所述的药物组合物样品溶液的制备方法为：取药物组合物2mg，加甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml使其溶解，用乙醚振摇提取3次，每次20ml，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇10ml溶解制成样品溶液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的薄层色谱检测方法，其特征在于包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量20-40倍体积比的甲醇，超声处理20-50分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量10-30倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量5-30倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；其中所述药物组合物中含有贯叶金丝桃或刺五加中的一种或两种；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
a）刺五加的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各5~10ul，点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇的混合溶液为展开剂，展开剂比例为4~8:1~8:1，取出，晾干，用1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b）贯叶金丝桃的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各2~5ul，点于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水混合溶液为展开剂展开，展开剂比例为7~18:1~3:1，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
8.根据权利要求8所述的薄层色谱检测方法，其特征在于包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量25倍体积比的甲醇，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
a）刺五加的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各10ul，点于同一硅胶薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇的混合溶液为展开剂，展开剂比例为5:4:1，取出，晾干，用1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b）贯叶金丝桃的薄层色谱检测：照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法验，分别吸取药物组合物样品及对照品溶液各2ul，点于同一硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水混合溶液为展开剂展开，展开剂比例为15:1:1，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
9.根据权利要求1-2所述的薄层色谱检测方法，其特征在于包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量20-40倍体积比的甲醇，超声处理20-50分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量10-30倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取2-5次，每次体积为药物组合物样品质量5-30倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；其中所述药物组合物中含有贯叶金丝桃或刺五加中的一种或两种；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法试验，分别吸取药物组合物样品、对照品溶液各5~10ul，点于同一硅胶G薄层板上，以7~18:1~3:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
10.根据权利要求9所述的薄层色谱检测方法，其特征在于包含以下步骤：
1）供试品溶液的制备
取药物组合物样品若干，加药物组合物样品质量25倍体积比的甲醇，超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加适量水溶解，再用乙醚振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，弃去乙醚后，水相用乙酸乙酯或甲酸乙酯振摇提取3次，每次体积为药物组合物样品质量10倍，合并酯溶液，蒸干，残渣加甲醇适量溶解制成样品溶液；
2）对照品溶液的制备
异嗪皮啶对照品溶液：异嗪皮啶对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品溶液：芦丁、金丝桃苷或异槲皮苷对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液；
3）检测方法
照中国药典2010版一部附录ⅥB薄层层析法试验，分别吸取药物组合物样品、对照品溶液各10ul，点于同一硅胶G薄层板上，以15:1：1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液显色后烘干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
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