CN103529136A - 一种舒肝解郁胶囊的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种舒肝解郁胶囊质量的控制方法，通过高效液相色谱法测定舒肝解郁胶囊指纹图谱从而有效监控该药物质量。该方法包括：首先建立舒肝解郁胶囊对照指纹谱图，再测定舒肝解郁胶囊待测产品指纹谱图，最后将所述舒肝解郁胶囊待测产品指纹图谱与所述舒肝解郁胶囊对照指纹图谱进行比较，识别其相同吸收峰数量，确定产品质量是否合格。该方法通过比对指纹图谱中主要化学成分的信息，从该药物的物质群整体，从宏观的角度给予药物质量控制，更加合理地反映舒肝解郁胶囊药品质量。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种舒肝解郁胶囊的质量控制方法。
背景技术
抑郁症是一种常见的精神疾病，主要表现为情绪低落、兴趣减低、悲观、思维迟缓、自责自罪、饮食睡眠差、担心或感到全身多处不适、严重者可出现自杀念头和行为。随着现代社会经济的发展，人们生活、工作压力的增大，抑郁症发病率逐年增长。目前，抑郁症已迅速成为全球疾病中给人类造成严重负担的第二位重要疾病，对患者及其家属造成的痛苦和对社会造成的损失是其他疾病所无法比拟的。因此，社会对抑郁症治疗的药物需求是巨大的。相对于西医使用特定作用靶点药物治疗来讲，中医使用活性物质群，能够作用于多靶点，呈现多效性，而调整是其主要作用机制，显示出传统医药的独特性。
舒肝解郁胶囊是国内首个SFDA批准的用于治疗抑郁的中成药。主要的功效为健脾安神，适用于轻、中度单相抑郁症属肝郁脾虚证者，症见情绪低落、兴趣下降、迟滞、入睡困难、早醒、多梦、紧张不安、急躁易怒、食少纳呆、胸闷、疲乏无力、多汗、疼痛、舌苔白或腻，脉弦或细。该药是在吸取中医有关治疗抑郁的经验基础上，借鉴国内外现代医学治疗抑郁的最新研究成果配方而得。舒肝解郁胶囊的作用机制是通过其有效成分透过血脑屏障对海马神经元的萎缩以及中枢局部组织的生化失调产生重要的保护作用。有临床报道舒肝解郁胶囊对轻中度抑郁有效率为68.10%，远较安慰剂的29.0%高，差异具有统计学意义，临床总体疗效评估也证实了舒肝解郁胶囊抗抑郁疗效明显优于安慰剂，并且其安全性及耐受性良好[舒肝解郁胶囊治疗轻中度抑郁症的随机双盲安慰剂对照研究，孙新宇等，临床研究，2009,18(5)]。另有临床实验证实舒肝解郁疗效与氟西汀相当，且起效快，治疗一周就表现出显著疗效，其不良反应发生率(20.0%)较氟西汀组(43.3%)少，且症状轻，历时短，依存性更好[舒肝解郁胶囊与氟西汀治疗抑郁症的对照研究，承德医学院学报,赵敬平，2011]。因此，舒肝解郁胶囊是一种疗效和安全性俱佳的纯中药制剂。
舒肝解郁胶囊由贯叶金丝桃、刺五加两味中药组成。贯叶金丝桃已经有2400年的使用历史，1876年美国处方集记载金丝桃对于由情绪低落引起的神经系统不平衡的有治疗作用。2010版《中国药典》记载其有“疏肝解郁，清热利湿，消肿通乳”的功效。贯叶金丝桃醇提取的主要成分为6类：萘并二蒽酮类（naphthoi-anthrones）、间苯三酚类（phloroglucinols）、黄酮类（flavonoids）、双黄酮类（biflavones）、苯丙烯酸类（phenylpropanes）、原花青素（proanthocyanidins）。另外，还有少量的单宁酸、氧杂蒽酮、挥发油和氨基酸等。刺五加始见于《神农本草经》，2010版《中国药典》记载其有“益气健脾，补肾安神”的功效。文献报道其主要的化学成分有刺五加皂苷、黄酮类、多糖类、三萜皂苷类、木脂素和咖啡酰奎宁酸类等。由于舒肝解郁胶囊使用的药材贯叶金丝桃和刺五加均具有复杂的化学成分，因此如何对其具体活性成分进行有效检测，从而控制舒肝解郁胶囊的质量，获得安全有效的药物，成为了目前亟待解决的问题。
随着中药现代化、国际化的不断发展，现代分析技术如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、X光衍射法、毛细管电泳、分子生物技术以及其他分析方法不断在中药鉴定中药质控等方面的应用，建立了一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量控制以及对其复杂成分检出的方法即指纹图谱。目前，美国FDA，英国和印度草药典，德国药用植物学会，加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。此外，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。
因此，通过指纹图谱信息来控制舒肝解郁胶囊质量，是从该药物的物质群整体，从宏观的角度给予质量控制，能更加合理、真实地反映舒肝解郁胶囊药品质量。目前对于舒肝解郁胶囊指纹图谱的建立以及其标准指纹图谱尚未见报道。由于舒肝解郁胶囊所用药材刺五加和贯叶连翘中的药物活性成分都比较多，因此这两种药物同时检测（即检测舒肝解郁胶囊）时得到的指纹图谱必须清晰表现出刺五加和贯叶连翘中各自的有效活性成分，避免不同成分的峰出现重叠，这就给其指纹图谱的建立带来了不小的困难。现有技术中有大量报道刺五加或贯叶连翘指纹图谱的检测方法，然而我们通过实验得知现有技术关于刺五加或贯叶连翘的HPLC指纹图谱检测条件并不能用于舒肝解郁胶囊指纹图谱的测定，其存在不能有效分离刺五加和贯叶连翘中各自的有效活性成分，检测时间长，效率低，操作复杂等缺点。
发明内容
本发明提供一种舒肝解郁胶囊的质量控制方法，包括以下步骤：
（a）舒肝解郁胶囊对照指纹谱图的建立
舒肝解郁胶囊对照样品溶液制备：取舒肝解郁胶囊对照品内容物，置于量瓶中，加入甲醇与水的混合溶液超声溶解，定容，滤过，即为对照样品溶液；
舒肝解郁胶囊对照样品指纹图谱的测定：吸取上述对照品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到舒肝解郁胶囊对照指纹图谱；色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长240-300nm；
（b）舒肝解郁胶囊待测产品指纹谱图的测定
取舒肝解郁胶囊待测产品内容物，按照（a）中所述步骤及条件测定该待测产品的指纹图谱；
（c）将所述舒肝解郁胶囊待测产品指纹图谱与所述舒肝解郁胶囊对照指纹图谱进行比较，识别其相同吸收峰数量，确定产品质量是否合格。
其中（a）步骤中优选所述甲醇与水的混合溶液为20%~75%的甲醇溶液，检测波长为240-300nm，柱温为25-35℃，进样体积为1-10ul；更优选所述甲醇与水的混合溶液为50%甲醇溶液，检测波长为265nm，柱温为30℃，进样体积为5ul。
其中所述舒肝解郁胶囊的质量控制方法中（a）步骤中舒肝解郁胶囊对照样品溶液制备方法优选为：取舒肝解郁胶囊对照品内容物0.25g，置于25ml量瓶中，加入50%CH3OH溶液，超声30min，溶解，加50%CH3OH定容至刻度，滤过，即得对照样品溶液。
所述舒肝解郁胶囊的质量控制方法（a）步骤中所述色谱条件进一步优选为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
所述梯度洗脱程序优选为：
0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；
20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；
30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；
40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；
45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
本发明采用高效液相色谱法测定获得的舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中含有7个单峰面积占总峰面积百分比超过4%的吸收峰，分别是：
2号峰，平均保留时间RT为17.40min，RSD为0.09%，平均峰面积535.48，RSD%为25.40%；
3号峰，平均保留时间RT为17.81min，RSD为0.09%，平均峰面积543.92，RSD%为33.10%；
6号峰，平均保留时间RT为25.02min，RSD为0.06%，平均峰面积2136.24，RSD%为13.35%；
7号峰，平均保留时间RT为25.70min，RSD为0.05%，平均峰面积1934.51，RSD%为25.88%；
8号峰，平均保留时间RT为25.97min，RSD为0.05%，平均峰面积2221.12，RSD%为13.79%；
9号峰，平均保留时间RT为27.60min，RSD为0.05%，平均峰面积804.87，RSD%为12.59%；
11号峰，平均保留时间RT为33.70min，RSD为0.04%，平均峰面积1757.78，RSD%为27.66%；
本发明采用高效液相色谱法测定获得的舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中含有11个单峰面积占总峰面积的百分比超过1.5%的吸收峰，分别是：
1号峰，平均保留时间RT为13.85min，RSD为0.14%，平均峰面积272.90，RSD%为31.95%；
2号峰，平均保留时间RT为17.40min，RSD为0.09%，平均峰面积535.48，RSD%为25.40%；
3号峰，平均保留时间RT为17.81min，RSD为0.09%，平均峰面积543.92，RSD%为33.10%；
4号峰，平均保留时间RT为18.31min，RSD为0.09%，平均峰面积279.93，RSD%为35.21%；
6号峰，平均保留时间RT为25.02min，RSD为0.06%，平均峰面积2136.24，RSD%为13.35%；
7号峰，平均保留时间RT为25.70min，RSD为0.05%，平均峰面积1934.51，RSD%为25.88%；
8号峰，平均保留时间RT为25.97min，RSD为0.05%，平均峰面积2221.12，RSD%为13.79%；
9号峰，平均保留时间RT为27.60min，RSD为0.05%，平均峰面积804.87，RSD%为12.59%；
10号峰，平均保留时间RT为27.94min，RSD为0.05%，平均峰面积416.84，RSD%为19.74%；
11号峰，平均保留时间RT为33.70min，RSD为0.04%，平均峰面积1757.78，RSD%为27.66%；
12号峰，平均保留时间RT为37.51min，RSD为0.04%，平均峰面积307.31，RSD%为16.64%；
本发明采用高效液相色谱法测定获得的舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中还含有1个单峰面积未超过总峰面积1.0%的吸收峰，是：
5号峰，平均保留时间RT为21.56min，RSD为0.08%，平均峰面积95.12，RSD%为57.86%；
本发明采用如下方法控制舒肝解郁胶囊的质量：取待测舒肝解郁胶囊，采用与舒肝解郁胶囊对照品的制备方法、色谱条件、测定方法完全相同的方法进行测定，获取指纹图谱，将待测品指纹图谱和对照品指纹图谱比较，二者指纹图谱有7个或7个以上相同的吸收峰时，认为舒肝解郁胶囊待测品质量合格。
优选，将待测品指纹图谱和对照品指纹图谱比较，二者指纹图谱有11个或11个以上相同的吸收峰时，认为舒肝解郁胶囊待测品质量合格。
更优选，将待测品指纹图谱和对照品指纹图谱比较，二者指纹图谱有12个或12个以上相同的吸收峰时，认为舒肝解郁胶囊待测品质量合格。
同时本申请发明人考察获知，当采用甲酸水-乙腈体系作为流动相时更适合于高效液相色谱-质谱联用检测舒肝解郁胶囊，舒肝解郁胶囊中刺五加和贯叶连翘的主要活性物质能达到较理想的分离，没有重叠，且峰形优异。
本申请发明人通过二极管阵列检测器（DAD检测器检测）检测舒肝解郁吸收波长，发现舒肝解郁中的各个成分在200-400nm范围内有吸收，其在240-300nm处均有吸收，均适合作为检测波长条件，其中当检测波长为265nm时样品中的各个成分均有吸收且主要化合物具有较强吸收。
本申请发明人还考察了不同提取液对待测品的提取效果对检测结果的影响，包括水、乙醇水溶液以及甲醇水溶液。结果显示乙醇水溶液提取的效果不如水和甲醇水溶液：例如75%CH3OH提取样品的各峰峰高和峰面积均明显大于75%CH3CH2OH提取的样品。当使用水或含有甲醇的水溶液（含量包括75%CH3OH、50%CH3OH、25%CH3OH）时，样品的检测结果均可以，其中当使用50%CH3OH时，其检测效果最好。
本发明与现有技术相比，其具有以下优势：
1、本发明提供了一种通过指纹图谱对舒肝解郁胶囊质量进行有效评价的方法，避免了只测定其中一、二个化学成分就对舒肝解郁胶囊整体质量判断的局限性，更好的使舒肝解郁胶囊的质量控制更加客观和准确；
2、本发明所提供的指纹图谱检测方法其刺五加主要有效成分在22分钟之前出峰，贯叶连翘主要成分在24分钟后出峰，两种药材各自有效成分的峰分离性好；
3、本发明所提供的指纹图谱检测方法所需检测时间合理，主要活性成分的峰在40分钟内出峰，并且峰强度都较大，因此使得检测效率高效；
4、本发明所提供的指纹图谱检测方法其重复性和稳定性好；
5、本发明所提供的指纹图谱检测方法避免了在流动相中使用磷酸，使其能够在经高效液相色谱检测后直接与质谱仪联用，有效确定相关物质的结构，更好的监控相关药物的质量。
附图说明：
图1有效成分对照品HPLC色谱图
其中：峰1为紫丁香苷，峰2为绿原酸，峰3为芦丁，峰4为金丝桃苷，峰5为异嗪吡啶，峰6为槲皮苷，峰7为槲皮素。
图2空白基线HPLC色谱图
图3舒肝解郁胶囊对照品HPLC指纹图谱
图4贯叶金丝桃提取物HPLC指纹图谱
图5刺五加提取物HPLC指纹图谱
图6不同批次舒肝解郁胶囊HPLC指纹图谱（10个批次）
图7实施例三HPLC色谱图
具体实施方式
实施例一贯叶金丝桃指纹图谱的测定
1、试剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲酸为分析纯（Sigma aldrichCompany Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）。
2、仪器：Agilent Infinity 1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(SanJose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。
3、贯叶金丝桃提取物样品制备：取贯叶金丝桃提取物（按照实施例五制备）称量0.22g，置于25ml量瓶中，加入50%CH3OH溶液，超声30min，溶解，加50%CH3OH定容至刻度，滤过，即得贯叶金丝桃提取物样品溶液；
4、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：
0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；
20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；
30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；
40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；
45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
检测波长265nm，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为5ul；
5、测定：吸取上述贯叶金丝桃提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到贯叶金丝桃提取物指纹图谱（见附图4），其中主要化学成分吸收峰有7个，分别是：
1号峰，平均保留时间RT为25.02，RSD为0.06%，占总峰面积百分比为20.15%；
2号峰，平均保留时间RT为25.71，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为18.63%；
3号峰，平均保留时间RT为25.97，RSD为0.06%，占总峰面积百分比为19.95%；
4号峰，平均保留时间RT为27.61，RSD为0.04%，占总峰面积百分比为7.31%；
5号峰，平均保留时间RT为27.95，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为3.25%；
6号峰，平均保留时间RT为33.72，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为13.85%；
7号峰，平均保留时间RT为37.55，RSD为0.03%，占总峰面积百分比为2.59%；
实施例二刺五加指纹图谱的测定
1、本实验中试剂和仪器同实施例一
2、刺五加提取物样品制备：取刺五加提取物（按照实施例六制备）称量0.20g，置于25ml量瓶中，加入50%CH3OH溶液，超声30min，溶解，加50%CH3OH定容至刻度，滤过，即得刺五加提取物样品溶液；
3、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：
0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；
20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；
30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；
40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；
45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
检测波长265nm，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为5ul；
4、测定：吸取上述刺五加提取物样品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到刺五加提取物指纹图谱（见附图5），其中主要化学成分吸收峰有5个，分别是：
1号峰，平均保留时间RT为13.83，RSD为0.04%，占总峰面积百分比为12.37%；
2号峰，平均保留时间RT为17.41，RSD为0.06%，占总峰面积百分比为18.56%；
3号峰，平均保留时间RT为17.80，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为13.99%；
4号峰，平均保留时间RT为18.31，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为12.62%；
5号峰，平均保留时间RT为21.56，RSD为0.04%，占总峰面积百分比为5.89%。
实施例三舒肝解郁胶囊质量控制检测
1、样品：舒肝解郁胶囊对照品，由成都康弘药业集团股份有限公司提供，批号：110902。
2、试剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲酸为分析纯（Sigma aldrichCompany Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）、醋酸铵（广东光华化学厂有限公司，中国）。
3、仪器：Agilent Infinity 1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(SanJose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。
4、舒肝解郁胶囊对照品溶液制备：取对照品胶囊内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相以0.5%甲酸和20mM醋酸铵水溶液（0.5%HCOOH，20mMNH4Ac）为流动相A，为乙腈流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为：
0-3min时，95%的流动相A，5%的流动相B
20min时，85%的流动相A，15%的流动相B
40min时，80%的流动相A，20%的流动相B
55min时，55%的流动相A，45%的流动相B
65min时，30%的流动相A，70%的流动相B
75min时，0%的流动相A，100%的流动相B
85min时，0%的流动相A，100%的流动相B
86-94min时，95%的流动相A，5%的流动相B
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。
6、结果：上述条件检测方法需要较长的梯度时间才能检测出所有有效成分，总时间长达94min。检测结果见图7。
该方法同本发明实验方法对比见表1：
表1对比例同本发明检测方法对比
从上表可明显看出：这两个主要成分峰面积基本一致，但峰高方面本发明方法至少是对比例方法的2倍右左，且本发明方法流动相配制简单，甲酸比例为0.1%，对质谱检测干扰很小。
实施例四舒肝解郁胶囊的制备
本发明所涉及的舒肝解郁胶囊主要由贯叶金丝桃提取物和刺五加提取物组成。该药物的制备方法优选为贯叶金丝桃1800g，刺五加1500g，以上两味药材，贯叶金丝桃加75%乙醇回流提取两次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.10（70℃），喷雾干燥得干浸膏粉；刺五加加8倍量水，煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.18（70℃）的浸膏，喷雾干燥得干浸膏粉。取上述两种干浸膏粉，加入适量辅料（预胶化淀粉52g，滑石粉18g，硬脂酸镁2g）混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。
实施例五贯叶金丝桃提取物的制备
贯叶金丝桃药材1800g粉碎后用75%乙醇回流提取两次，第一次10倍量75%乙醇，第二次8倍量75%乙醇，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.10（70℃），喷雾干燥得贯叶金丝桃提取物。
实施例六刺五加提取物的制备
取刺五加药材1500g粉碎，加8倍量水，煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.18（70℃）的浸膏，喷雾干燥得刺五加提取物。
实施例七舒肝解郁胶囊对照指纹图谱建立
（1）舒肝解郁胶囊对照指纹图谱测定
1、样品：舒肝解郁胶囊对照品，由成都康弘药业集团股份有限公司提供，批号：110902。
2、试剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲酸为分析纯（Sigma aldrichCompany Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）
3、仪器：Agilent Infinity 1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(SanJose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。
4、舒肝解郁胶囊对照品溶液制备：取舒肝解郁胶囊对照品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：
0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；
20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；
30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；
40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；
45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。
6、指纹图谱数据（见附图3）：
采用上述高效液相色谱法测定获得的舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中含有7个单峰面积超过总峰面积4%的吸收峰，分别是：
2号峰，平均保留时间RT为17.41min，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为4.13%；
3号峰，平均保留时间RT为17.80min，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为4.23%；
6号峰，平均保留时间RT为25.02min，RSD为0.06%，占总峰面积百分比为16.24%；
7号峰，平均保留时间RT为25.71min，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为14.50%；
8号峰，平均保留时间RT为25.97min，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为16.83%；
9号峰，平均保留时间RT为27.61min，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为6.05%；
10号峰，平均保留时间RT为33.72min，RSD为0.04%，占总峰面积百分比为13.16%。
采用上述高效液相色谱法测定获得的舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中含有11个单峰面积占总峰面积的百分比超过1.5%的吸收峰，分别是：
1号峰，平均保留时间RT为13.83min，RSD为0.14%，占总峰面积百分比为2.12%；
2号峰，平均保留时间RT为17.41min，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为4.13%；
3号峰，平均保留时间RT为17.80min，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为4.23%；
4号峰，平均保留时间RT为18.31min，RSD为0.09%，占总峰面积百分比为2.19%；
6号峰，平均保留时间RT为25.02min，RSD为0.06%，占总峰面积百分比为16.24%；
7号峰，平均保留时间RT为25.71min，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为14.50%；
8号峰，平均保留时间RT为25.97min，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为16.83%；
9号峰，平均保留时间RT为27.61min，RSD为0.05%，占总峰面积百分比为6.05%；
10号峰，平均保留时间RT为27.95min，RSD为0.04%，占总峰面积百分比为3.13%。
11号峰，平均保留时间RT为33.72min，RSD为0.04%，占总峰面积百分比为13.16%；
12号峰，平均保留时间RT为37.55min，RSD为0.04%，占总峰面积百分比为2.32%。
采用上述高效液相色谱法测定获得的舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中还含有1个单峰面积未超过总峰面积1.5%的吸收峰有，是：
5号峰，平均保留时间RT为21.56min，RSD为0.08%，占总峰面积百分比为0.75%。
（2）舒肝解郁胶囊对照指纹图谱中有效成分的鉴定
本发明通过测定有效成分对照品的保留时间，鉴定了舒肝解郁胶囊对照指纹图谱中6个化合物的结构。该有效成分对照品高效液相色谱法的测定为：
1）有效成分对照品：分别是金丝桃苷（批号111521-2001004）、芦丁（批号100080-200707）、紫丁香苷（批号111574-200502）、绿原酸（批号110753-200413）、槲皮素（批号100081-200406）、槲皮苷（批号111538-200302）和异嗪吡啶（批号110837-201005）、均购自中国药品生物制品检定所。
2）有效成分对照品溶液的制备：分别取适量的对照品，置加入50%甲醇水1ml的EP管中，超声10min，即得。
3）液相色谱条件和测定方法同“（1）舒肝解郁胶囊对照指纹图谱测定”中的液相色谱条件和测定方法相同。
4）有效成分对照品HPLC色谱图详见附图1。
通过谱图对比，本发明舒肝解郁胶囊12个特征吸收峰中6个吸收峰所对应的有效成分见表2，分别是：
表2舒肝解郁胶囊有效成分鉴定结果
| 2号峰 | 3号峰 | 6号峰 | 7号峰 | 10号峰 | 11号峰 |
| 紫丁香苷 | 绿原酸 | 芦丁 | 金丝桃苷 | 槲皮苷 | 槲皮素 |
实施例八舒肝解郁胶囊的质量控制检测
1、样品：按照实施例四制备的舒肝解郁胶囊，批号100701。
2、试剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲酸为分析纯（Sigma aldrichCompany Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）
3、仪器：Agilent Infinity 1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(SanJose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。
4、舒肝解郁胶囊样品溶液制备：取舒肝解郁胶囊样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：
0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；
20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；
30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；
40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；
45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。
6、检测
（1）溶液稳定性实验
按照上述方法，测定提取后溶液在4℃条件下，放置0、4、16和48h的溶液稳定性，测定结果见表3：
表3溶液稳定性实验结果
以上结果显示所有成分峰面积的RSD%<3%，证明该溶液在4℃条件下48h内稳定。
（2）重现性实验
按上述试验方法，平行测定6份，测定结果见表4：
表4重现性实验结果
以上结果显示平行6份样品间峰面积的RSD%<3%，证明该方法重现性良好。
实施例九舒肝解郁胶囊指纹图谱检测
1、样品：按照实施例四制备的舒肝解郁胶囊各批次样品（批号100601、100603、100701、100702、100703、100704、100705、100801、100802、100901、100902、101001、110412、110601、110511、110705、110803、110903、111003、111111、111113、111122、111203、111204、111205、111206、111207、111208、111211、111212）
2、试剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲酸为分析纯（Sigma aldrichCompany Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）
3、仪器：Agilent Infinity 1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(SanJose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。
4、舒肝解郁胶囊供试品溶液制备：取实施例四制备的舒肝解郁胶囊各批次样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%CH3OH约20ml，超声30min，加50%CH3OH至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18，5um，250*4.6mm，Agilent）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：
0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；
20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；
30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；
40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；
45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
流速为1.0ml/min，柱温：30℃，UV检测波长为265nm，进样体积：5ul。
6、数据分析
共对30批舒肝解郁胶囊进行了指纹图谱检测，其相似度在90%以上，所有图谱平均保留时间、峰面积平均值以及RSD数据见表5。其中十批次检测谱图见附图6。
表5舒肝解郁胶囊指纹图谱检测结果（30批次）
Claims (10)
1.一种舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于包括以下步骤：
（a）舒肝解郁胶囊对照指纹谱图的建立
舒肝解郁胶囊对照样品溶液制备：取舒肝解郁胶囊对照品内容物，置于量瓶中，加入甲醇与水的混合溶液超声溶解，定容，滤过，即为对照样品溶液；
舒肝解郁胶囊对照样品指纹图谱的测定：吸取上述对照品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到舒肝解郁胶囊对照指纹图谱；色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长240-300nm；
（b）舒肝解郁胶囊待测产品指纹谱图的测定
取舒肝解郁胶囊待测产品内容物，按照（a）中所述步骤及条件测定该待测产品的指纹图谱；
（c）将所述舒肝解郁胶囊待测产品指纹图谱与所述舒肝解郁胶囊对照指纹图谱进行比较，识别其相同吸收峰数量，确定产品质量是否合格。
2.根据权利要求1所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于：（a）步骤中所述甲醇与水的混合溶液为20%~75%的甲醇溶液，检测波长为240-300nm，流速为0.5ml/min，柱温为25-35℃，进样体积为1-10ul；优选甲醇与水的混合溶液为50%甲醇溶液，检测波长为265nm，柱温为30℃，进样体积为5ul。
3.根据权利要求1所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于：（a）步骤中所述舒肝解郁胶囊对照样品溶液制备方法为，取舒肝解郁胶囊对照品内容物0.25g，置于25ml量瓶中，加入50%CH3OH溶液，超声30min，溶解，加50%CH3OH定容至刻度，滤过，即得对照样品溶液。
4.根据权利要求1所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于：（a）步骤中所述流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。
5.根据权利要求1所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于所述梯度洗脱程序如下：
0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；
10min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；
20min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；
30min时，流动相A为65%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为35%的乙腈；
40min时，流动相A为45%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为55%的乙腈；
45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
50min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；
51-60min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于所述舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中含有7个单峰面积占总峰面积百分比超过4%的吸收峰，分别是：
2号峰，平均保留时间RT为17.40min，RSD为0.09%，平均峰面积535.48，RSD%为25.40%；
3号峰，平均保留时间RT为17.81min，RSD为0.09%，平均峰面积543.92，RSD%为33.10%；
6号峰，平均保留时间RT为25.02min，RSD为0.06%，平均峰面积2136.24，RSD%为13.35%；
7号峰，平均保留时间RT为25.70min，RSD为0.05%，平均峰面积1934.51，RSD%为25.88%；
8号峰，平均保留时间RT为25.97min，RSD为0.05%，平均峰面积2221.12，RSD%为13.79%；
9号峰，平均保留时间RT为27.60min，RSD为0.05%，平均峰面积804.87，RSD%为12.59%；
11号峰，平均保留时间RT为33.70min，RSD为0.04%，平均峰面积1757.78，RSD%为27.66%。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于所述舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中含有11个单峰面积总峰面积的百分比超过1.5%的吸收峰，分别是：
1号峰，平均保留时间RT为13.85min，RSD为0.14%，平均峰面积272.90，RSD%为31.95%；
2号峰，平均保留时间RT为17.40min，RSD为0.09%，平均峰面积535.48，RSD%为25.40%；
3号峰，平均保留时间RT为17.81min，RSD为0.09%，平均峰面积543.92，RSD%为33.10%；
4号峰，平均保留时间RT为18.31min，RSD为0.09%，平均峰面积279.93，RSD%为35.21%；
6号峰，平均保留时间RT为25.02min，RSD为0.06%，平均峰面积2136.24，RSD%为13.35%；
7号峰，平均保留时间RT为25.70min，RSD为0.05%，平均峰面积1934.51，RSD%为25.88%；
8号峰，平均保留时间RT为25.97min，RSD为0.05%，平均峰面积2221.12，RSD%为13.79%；
9号峰，平均保留时间RT为27.60min，RSD为0.05%，平均峰面积804.87，RSD%为12.59%；
10号峰，平均保留时间RT为27.94min，RSD为0.05%，平均峰面积416.84，RSD%为19.74%；
11号峰，平均保留时间RT为33.70min，RSD为0.04%，平均峰面积1757.78，RSD%为27.66%；
12号峰，平均保留时间RT为37.51min，RSD为0.04%，平均峰面积307.31，RSD%为16.64%。
8.根据权利要求7所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于所述舒肝解郁胶囊对照品指纹图谱中还含有1个单峰面积未超过总峰面积1.0%的吸收峰，具体是：
5号峰，平均保留时间RT为21.56min，RSD为0.08%，平均峰面积95.12，RSD%为57.86%。
9.根据权利要求1-5中任意一项所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于所述舒肝解郁胶囊待测产品指纹图谱与所述舒肝解郁胶囊对照指纹图谱比较，二者指纹图谱有7个或7个以上相同的吸收峰时，认为舒肝解郁胶囊待测品质量合格。
10.根据权利要求1-5所述的舒肝解郁胶囊的质量控制方法，其特征在于所述舒肝解郁胶囊待测产品指纹图谱与所述舒肝解郁胶囊对照指纹图谱比较，二者指纹图谱有11个或11个以 上相同的吸收峰时，认为舒肝解郁胶囊待测品质量合格；优选二者指纹图谱有12个或12个以上相同的吸收峰。
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Application publication date: 20140122 Assignee: Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co., Ltd. Assignor: Chengdu Kanghong Pharmaceuticals Group Co., Ltd. Contract record no.: 2017510000031 Denomination of invention: A kind of method of quality control of capsule for reliving liver and reliving upset Granted publication date: 20150520 License type: Common License Record date: 20171018 |
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Effective date of registration: 20201113 Address after: Pengzhou City, Chengdu City, Sichuan province 611930 days Peng Zhen Hua Long Road No. 89 Patentee after: Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 610036 Jinniu District, Sichuan, Sichuan West Road, No. 36, No. Patentee before: CHENGDU KANGHONG PHARMACEUTICAL GROUP Co.,Ltd. |
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