CN113804773B - 一种治疗肝病中药指纹图谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗肝病中药的指纹图谱的检测方法。该方法为，采用高效液相色谱法建立一种全新的治疗肝病中药的指纹图谱，并利用建立的指纹图谱同时测定出治疗肝病中药中的各组成组分，该检测方法可以客观、全面、准确的评价该复方中药的质量，对控制其质量和保证临床疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂的质量控制方法领域，具体涉及一种治疗肝病中药的指纹图谱的检测方法，并由此方法得到其的指纹图谱。
背景技术
由于中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法。中药指纹图谱作为对中药进行质量控制的一种技术，自2010年已载入《中国药典》，其优势比起单一组分甚至多组分定性定量更加明显，特别是针对药物来源广、成分复杂、物质基础不明确的中药复方制剂。中药指纹图谱可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。
治疗肝病中药作为复方制剂，属于新药研发中的第六类治疗肝病中药，具有益气疏肝、活血软坚的功效，其组成及制法如中国专利申请CN101214288B“一种治疗肝病的中药组合物及其制备方法”所记载，其主要活性成为没食子酸，葛根素，芍药苷，三七皂苷R1，黄芪甲苷和丹参酮IIA等。目前，针对治疗肝病中药的检测方式只是采用高效液相色谱进行测定，但使用高效液相色谱一次只能检测出治疗肝病中药中的一种成分，无法同时检测出几种成分，因此这种检测很难真正控制中药的产品质量，无法彻底杜绝中药掺假、伪劣等现象，也不能客观反映和评价中药质量的一致性。
因此，迫切需要建立一种针对该治疗肝病中药的新的质量控制方法，以建立可溯源的、与临床疗效高度关联的全程质量控制体系。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，提出了本发明的一种治疗肝病中药的指纹图谱的检测方法，以便克服上述问题或者至少部分地解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供一种治疗肝病中药的指纹图谱的检测方法，该方法采用高效液相色谱法建立治疗肝病中药的指纹图谱，该高效液相色谱条件为，
色谱柱：Waters Symmetry C18色谱准，规格为250mm*4.6mm,5μm；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例均为体积百分比：
0-25min，流动相A为5％-30％，流动相B为95％-70％；
25-50min，流动相A为30％-35％，流动相B为70％-65％；
50-65min，流动相A为35％-45％，流动相B为65％-55％；
65-95min，流动相A为45％-95％，流动相B为55％-5％；
95-105min，流动相A为95％，流动相B为5％；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：270nm；
漂移管温度：70℃；
载气流速：2.0L/min；
进样量：5μl。
可选地，
1)供试品溶液的制备：精密称取不同批次的中药样品，加入50％甲醇溶液，超声处理，微孔滤膜过滤，得不同批次的供试品溶液；
2)混合对照品溶液的制备：精密称取各对照品加入50％甲醇溶液，超声处理，得混合对照品溶液；
3)测定：按所述高效液相色谱条件对不同批次的供试品溶液进行测定，根据中药色谱指纹图谱软件，得到有共有特征峰构成的中药指纹图谱，并计算出各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积；
按所述高效液相色谱条件对所述混合对照品溶液进行测定，计算出混合对照品溶液中各组分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积；
以所述混合对照品中各组分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为参照，确定所述供试品溶液各组成组分。
可选地，所述为治疗肝病中药。
可选地，所述对照品包括：没食子酸、葛根素、芍药苷、三七皂苷R1、黄芪甲苷和丹参酮IIA。
可选地，所述治疗肝病中药指纹图谱的共有特征峰为11个，保留时间分别为：1号峰为7.8min，2号峰为22.8min，3号峰为27.5min，4号峰为29.6min，5号峰为30.5min，6号峰为31.8min，7号峰为75.8min，8号峰为77.8min，9号峰为88.9min，10号峰为91.8min，11号峰为95.6min。
可选地，所述共有特征峰中，1号峰为没食子酸，3号峰为葛根素，4号峰为芍药苷，7号峰三七皂苷R1，10号峰为黄芪甲苷，11号峰为丹参酮IIA。
可选地，所述中药色谱指纹图谱软件为《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》。
可选地，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm，所述超声时间为30min。
本发明的技术方案是，采用高效液相色谱法建立一种全新的治疗肝病中药指纹图谱，利用建立的指纹图谱同时测定出该复方中的各组成组分，该检测方法可以客观、全面、准确的评价该治疗肝病中药的质量，对控制其质量和保证临床疗效具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中提供的一种治疗肝病中药的指纹图谱；
图2为本发明的一个实施例中提供的一种混合对照品溶液的指纹图谱。
其中，1号峰为没食子酸；3号峰为葛根素；4号峰为芍药苷；7号峰为三七皂苷R1；10号峰为黄芪甲苷；11号峰为丹参酮IIA。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的治疗肝病中药的批号和对照品见下表：
仪器
Agilent 1260Infinity II高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent 1260Infinity II蒸发光检测器(美国Agilent公司)，KQ－500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，电子天平(SQP赛多利斯有限公司)，JJ100(常熟市双杰测试仪器厂)。
试剂
甲醇(色谱纯)Merck公司，甲醇(分析纯)广州化学试剂厂，乙醇(分析纯)广州化学试剂厂，冰醋酸(色谱纯)山东西亚试剂有限公司，水为超纯水。
实施例1
本发明采用高效液相色谱法建立治疗肝病中药的指纹图谱：该高效液相色谱条件为，
色谱柱：Waters Symmetry C18色谱准，规格为250mm*4.6mm,5μm；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例均为体积百分比：
0-25min，流动相A为5％-30％，流动相B为95％-70％；
25-50min，流动相A为30％-35％，流动相B为70％-65％；
50-65min，流动相A为35％-45％，流动相B为65％-55％；
65-95min，流动相A为45％-95％，流动相B为55％-5％；
95-105min，流动相A为95％，流动相B为5％；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：270nm；
漂移管温度：70℃；
载气流速：2.0L/min；
进样量：5μl。
本发明为采用建立的指纹图谱测定检测治疗肝病中药，包括如下步骤：
1)供试品溶液的制备：
分别取批号为1805311、1805312、1805313、20180610和20190615的治疗肝病中药各4g，研细，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇溶液补重，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2)混合对照品溶液的制备：
精密称取没食子酸对照品、葛根素对照品、芍药苷对照品、三七皂苷R1对照品、黄芪甲苷对照品和丹参酮IIA对照品，加入50％甲醇溶液稀释制成混合对照品溶液，超声处理，得混合对照品溶液。其中，没食子酸的浓度为1.444mg/ml、葛根素的浓度为2.118mg/ml、芍药苷的浓度为1.074mg/ml、三七皂苷R1的浓度为0.2180mg/ml、黄芪甲苷的浓度为0.1151mg/ml、丹参酮IIA的浓度为0.06670mg/ml。
3)测定后，将批号为1805311、1805312、1805313、20180610和20190615的治疗肝病中药样品图谱导入到《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A》，选择5批次治疗肝病中药的色谱图中特征色谱峰作为共有峰，用平均值计算法生成治疗肝病中药的指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，同时将测定的混合对照品溶液的指纹图谱与治疗肝病中药共有峰比对，确认治疗肝病中药中各成分的峰的保留时间和峰面积。
结果如图1和图2所示，治疗肝病中药中的共有峰为11个，按照出峰的先后顺序，11个共有峰分别为图1中的1号峰，2号峰，3号峰，4号峰，5号峰，6号峰，7号峰，8号峰，9号峰，10号峰，11号峰，1号峰的保留时间为7.8min，2号峰的保留时间为22.8min，3号峰的保留时间为27.5min，4号峰的保留时间为29.6min，5号峰的保留时间为30.5min，6号峰的保留时间为31.8min，7号峰的保留时间为75.8min，8号峰的保留时间为77.8min，9号峰的保留时间为88.9min，10号峰的保留时间为91.8min，11号峰的保留时间为95.6min。
并将图1中的11个共有峰与混合对照品溶液中色谱峰的保留时间进行比对，确认11个共有峰中的1号峰为没食子酸，3号峰为葛根素，4号峰为芍药苷，7号峰为三七皂苷R1，10号峰为黄芪甲苷，11号峰为丹参酮IIA。需要说明的是，1号峰，3号峰和11号峰是使用检测波长为270nm的紫外检测器测出，4号峰，7号峰，10号峰是使用蒸发光散射检测器测出。
下面是对治疗肝病中药的指纹图谱的检测方法的方法学验证
1、精密度研究
按实施例1的方法将治疗肝病中药制备成供试品溶液，按实施例1中的检测方法分析，重复进样6次，记录色图谱。以3号峰为参照峰，分析治疗肝病中药的指纹图谱的共有峰的相对峰面积及相对保留时间并计算RSD值，结果见表1和表2。
表1精密度试验(相对保留时间)结果
| 编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 | 峰11 |
| 1 | 0.28 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.75 | 2.81 | 3.21 | 3.33 | 3.48 |
| 2 | 0.28 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.20 | 3.32 | 3.48 |
| 3 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.82 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 4 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 5 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 6 | 0.28 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.48 |
| RSD | 1.93 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.15 | 0.15 | 0.13 | 0.13 | 0.16 |
表2精密度试验(相对峰面积)结果
| 编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 | 峰11 |
| 1 | 0.42 | 0.13 | 1.00 | 0.26 | 0.17 | 0.28 | 0.02 | 0.11 | 0.23 | 0.04 | 0.02 |
| 2 | 0.42 | 0.13 | 1.00 | 0.24 | 0.17 | 0.28 | 0.03 | 0.12 | 0.23 | 0.04 | 0.02 |
| 3 | 0.42 | 0.14 | 1.00 | 0.23 | 0.17 | 0.28 | 0.03 | 0.12 | 0.24 | 0.04 | 0.02 |
| 4 | 0.41 | 0.14 | 1.00 | 0.24 | 0.17 | 0.28 | 0.03. | 0.12 | 0.23 | 0.04 | 0.02 |
| 5 | 0.41 | 0.13 | 1.00 | 0.23 | 0.17 | 0.28 | 0.03 | 0.12 | 0.24 | 0.04 | 0.02 |
| 6 | 0.41 | 0.13 | 1.00 | 0.23 | 0.17 | 0.28 | 0.03 | 0.11 | 0.23 | 0.04 | 0.02 |
| RSD | 1.32 | 3.88 | 0 | 4.91 | 2.43 | 0 | 14.5 | 4.43 | 2.22 | 0 | 0 |
由表1和表2可知，仪器精密度良好。
2、稳定性考察
按实施例1方法将治疗肝病中药制备成供试品溶液，按实施例1中的检测方法分析，分别在放置0h，2h，4h，8h，12h，24h的时间点进样采集数据，记录色谱图，以3号峰为参照峰，分析治疗肝病中药指纹图谱的共有峰的相对峰面积及相对保留时间并计算RSD值，结果见表3、表4。
表3稳定性试验(相对保留时间)结果
| 编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 | 峰11 |
| 0 | 0.28 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.75 | 2.82 | 3.22 | 3.33 | 3.48 |
| 2 | 0.28 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.22 | 3.32 | 3.48 |
| 4 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 8 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 12 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 24 | 0.28 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.82 | 3.22 | 3.32 | 3.48 |
| RSD | 1.93 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.15 | 0.19 | 0.18 | 0.13 | 0.16 |
表4稳定性试验(相对峰面积)结果
由表3和表4可知，治疗肝病中药在24h内较稳定。
3、重复性考察
按实施例1方法将治疗肝病中药制备成供试品溶液6份，按实施例1的色谱条件进样釆集数据，记录色谱图，以3号峰为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表5、表6。
表5重复性试验(相对保留时间)结果
| 编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 | 峰11 |
| 1 | 0.29 | 0.84 | 1.00 | 1.08 | 1.10 | 1.15 | 2.75 | 2.82 | 3.22 | 3.33 | 3.48 |
| 2 | 0.28 | 0.84 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.48 |
| 3 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.08 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 4 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 5 | 0.29 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.81 | 3.21 | 3.32 | 3.47 |
| 6 | 0.28 | 0.83 | 1.00 | 1.07 | 1.10 | 1.15 | 2.74 | 2.82 | 3.22 | 3.32 | 3.47 |
| RSD | 1.45 | 0.62 | 0 | 0.49 | 0 | 0 | 0.15 | 0.15 | 0.13 | 0.13 | 0.15 |
表6重复性试验(相对峰面积)结果
| 编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 | 峰11 |
| 1 | 0.42 | 0.14 | 1.00 | 0.26 | 0.17 | 0.29 | 0.02 | 0.11 | 0.23 | 0.06 | 0.02 |
| 2 | 0.42 | 0.13 | 1.00 | 0.24 | 0.16 | 0.28 | 0.03 | 0.12 | 0.23 | 0.06 | 0.02 |
| 3 | 0.42 | 0.13 | 1.00 | 0.23 | 0.16 | 0.28 | 0.03 | 0.12 | 0.24 | 0.06 | 0.02 |
| 4 | 0.41 | 0.13 | 1.00 | 0.24 | 0.16 | 0.28 | 0.03 | 0.12 | 0.24 | 0.06 | 0.02 |
| 5 | 0.41 | 0.13 | 1.00 | 0.23 | 0.15 | 0.27 | 0.03 | 0.12 | 0.23 | 0.06 | 0.02 |
| 6 | 0.41 | 0.13 | 1.00 | 0.23 | 0.16 | 0.28 | 0.03 | 0.11 | 0.23 | 0.05 | 0.02 |
| RSD | 1.32 | 3.11 | 0 | 4.91 | 3.96 | 2.26 | 14.5 | 4.43 | 2.22 | 7.00 | 0 |
由表5和表6可知，该检测方法重复性良好。
以上试验结果表明，本发明提供的治疗肝病中药的指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价其的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
本发明的技术方案的优点如下：
1、本发明根据治疗肝病中药的有效成分的结构性质，通过大量试验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速、检测波长、柱温、色谱柱等分析条件，经多次试验验证表明，本发明提供的治疗肝病中药指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价该复方中药的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
2、用本发明所提供的方法所建立的该复方中药的指纹图谱，能有效的表征其质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定该复方中药质量的片面性。
3、本发明提供的治疗肝病中药的指纹图谱的检测方法，稳定性好、方法简便、精密度高、重现性好。
Claims (5)
1.一种治疗肝病中药的指纹图谱的检测方法，其特征在于，该方法采用高效液相色谱法建立治疗肝病中药的指纹图谱，该高效液相色谱条件为，色谱柱：WatersSymmetryC18色谱柱，规格为250mm*4.6mm,5μm；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例均为体积百分比：
0-25min，流动相A为5％-30％，流动相B为95％-70％；
25-50min，流动相A为30％-35％，流动相B为70％-65％；
50-65min，流动相A为35％-45％，流动相B为65％-55％；
65-95min，流动相A为45％-95％，流动相B为55％-5％；
95-105min，流动相A为95％，流动相B为5％；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：270nm；
漂移管温度：70℃；
载气流速：2.0L/min；
进样量：5μl；
所述检测方法包括如下步骤：
1)供试品溶液的制备：精密称取不同批次的中药样品，加入50％甲醇溶液，超声处理，微孔滤膜过滤，得不同批次的供试品溶液；2)混合对照品溶液的制备：精密称取各对照品加入50％甲醇溶液，超声处理，得混合对照品溶液；3)测定：按所述高效液相色谱条件对不同批次的供试品溶液进行测定，根据中药色谱指纹图谱软件，得到有共有特征峰构成的中药指纹图谱，并计算出各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积；按所述高效液相色谱条件对所述混合对照品溶液进行测定，计算出混合对照品溶液中各组分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积；以所述混合对照品中各组分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为参照，确定所述供试品溶液各组成组分；
所述对照品包括：没食子酸、葛根素、芍药苷、三七皂苷R1、黄芪甲苷和丹参酮IIA。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述治疗肝病中药指纹图谱的共有特征峰为11个，保留时间分别为：1号峰为7.8min，2号峰为22.8min，3号峰为27.5min，4号峰为29.6min，5号峰为30.5min，6号峰为31.8min，7号峰为75.8min，8号峰为77.8min，9号峰为88.9min，10号峰为91.8min，11号峰为95.6min。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述共有特征峰中，1号峰为没食子酸，3号峰为葛根素，4号峰为芍药苷，7号峰三七皂苷R1，10号峰为黄芪甲苷，11号峰为丹参酮IIA。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中药色谱指纹图谱软件为《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm，所述超声时间为30min。
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