CN114924005B - 地锦草的指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地锦草的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：步骤1、地锦草供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备；步骤3、线性关系考察；步骤4分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤5，将步骤4中获得的地锦草供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A，生成地锦草特征指纹图谱；并通过比对各峰与混合对照品色谱峰保留时间，对地锦草特征指纹图谱进行归属。本发明所提供的检测方法，能全面，客观地表征地锦草的质量。并且具有稳定性好、重现性好、精密度和准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及地锦草的指纹图谱检测方法。
背景技术
地锦草为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbiamaculata L.的干燥全草。味辛、性平，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄之功效，主治痢疾、泄泻、咯血、尿血、便血、崩漏、疮疖痈肿、湿热黄疸。
地锦草中含有黄酮、鞣质等多种类型的成分，目前的检测方法，检测成分比较有限，不能全面反映地锦草的质量，或者检测方法对仪器要求高，不能很好的推广应用。中药指纹图谱能全面、系统的反映复方制剂的整体特征，已成为中药质量控制的有效手段。为控制地锦草及其制剂的有效性，有必要在现有的技术基础上开发出能准确全面检测地锦草及其制剂有效成分的检测方法。并采用HPLC法建立地锦草的指纹图谱，为地锦草的质量评价提供方法及依据。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种地锦草的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价地锦草的质量，对控制地锦草的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种地锦草的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
步骤1、供试品溶液的制备
取地锦草粉末，精密称定，置玻璃容器中，精密加入甲醇或乙醇，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇或乙醇补足减失的重量，过滤，离心，取上清液，过微孔滤膜，即得供试品溶液；
步骤2、混合对照品溶液的制备
精密称取对照品化合物没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素，加适量甲醇或乙醇使溶解，配制成单标储备液；
定量吸取各单标储备液，制得没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素的混合对照品溶液；
步骤3、线性关系考察
将步骤2的混合对照品溶液用甲醇按照逐级稀释法逐级稀释，制成5个不同浓度的混合对照品溶液，然后分别注入高效液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到各对照品的回归方程：
步骤4、精密吸取步骤1的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤5、将步骤4中获得的不同批次的地锦草供试品溶液的指纹图谱导出，将其导入中药指纹图谱相似度评价系统2012版，生成地锦草特征指纹图谱；
步骤6、通过比对地锦草特征指纹图谱与混合对照品色谱峰保留时间，对地锦草特征指纹图谱进行归属；
步骤7、根据步骤3建立的回归方程，计算不同批次地锦草中10个成分的含量。
作为优选方案，以上所述的地锦草的指纹图谱检测方法，步骤1：供试品溶液制备方法为：取地锦草粉末，过三号筛，精密称定，置锥形瓶中，精密加入体积浓度80％甲醇，称定重量，超声提取30～45min，放冷，再称定重量，用体积浓度80％甲醇补足减失的重量，过滤，离心，取上清液过0.22μm有机微孔滤膜，即得供试品溶液。
作为优选方案，以上所述的地锦草的指纹图谱检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备方法为：
精密称取对照品化合物没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素，加适量甲醇使溶解，配制成浓度为2mg/mL的单标储备液；
定量吸取各单标储备液，制得浓度分别为400ug/mL、800ug/mL、400ug/mL、1328ug/mL、400ug/mL、320ug/mL、200ug/mL、50ug/mL、50ug/mL、24ug/mL的没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的地锦草的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤3和4中，液相色谱条件为：色谱柱：Waters Sun Fire C18色谱柱，规格250mm×4.6mm,5μm，柱温30℃，进样体积：10μL，流动相：以甲醇为A相，0.2％甲酸水为B相，梯度洗脱，流速：0.8mL/min，检测波长254nm。梯度洗脱条件如下：
本发明所述的地锦草的指纹图谱检测方法，步骤6中地锦草特征指纹图谱中，峰1为没食子酸、峰3为没食子酸乙酯、峰4为槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、峰6为木犀草苷、峰8为鞣花酸、峰10为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、峰12为紫云英苷、峰13为槲皮素、峰14为木犀草素、峰16为芹菜素。
本发明所述的地锦草的指纹图谱检测方法，步骤3各对照品的回归方程如下：
优化筛选实验：
1、本发明前期对供试品的制备方法进行了优化。比较80％甲醇加热回流和80％甲醇超声提取，发现两者所提取的成分类似，但超声提取方式更为简便；比较60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇的提取效率，发现以80％甲醇为提取溶剂时，各成分的峰面积较高；比较80％甲醇超声提取30min、45min、60min，发现超声45min相较于30min提取成分的峰面积更高，相较于60min提取效率类似；故选择80％甲醇超声提取45min的供试品制备方式。
2、本发明对色谱条件进行了优化。比较了色谱柱Waters Sun Fire C18、ThermoHypersil BDS C18、Agilent Zorbax SB C18的洗脱效果，结果表明，Waters Sun Fire C18对应图谱的色谱峰分离最佳，峰型最好，因此选用Waters Sun Fire C18色谱柱。
3、本发明对流动相甲醇-0.4％磷酸水溶液、甲醇-0.2％甲酸水溶液、乙腈-0.2％甲酸水溶液进行了考察，发现以甲醇-0.2％甲酸水溶液溶液洗脱时，基线较平稳，色谱峰分离度较好，保留时间适中，故流动相确定为以甲醇-0.2％甲酸水溶液。对供试液进行全波长扫描，结果在检测波长为254nm时，图谱信息最为丰富，响应值普遍较高，且分离效果较好，因此选择254nm为检测波长。
4、梯度洗脱筛选实验：本发明筛选了不同梯度洗脱方式，以甲醇为A相，0.2％甲酸水为B相，流速：0.8mL/min，梯度洗脱，洗脱条件一：0～5min，A 10-15％；5-35min，15-40％；35-65min，40-45％，65-70min，45-95％；70-75min，95-10％；75-80min，10-10％。洗脱条件二：0～10min，A 10-25％；10～20min，A 24-25％；20～30min，A 25-30％；30～40min，A 30-35％；40～50min，A 35-40％；50～60min，A40-40％；60～65min，A40-70％；65～75min，A70-90％；75～77min，A 90-10％；77～80min，A 10-10％。洗脱条件三：0～12min，A 10-24％；12～17min，A 24-25％；17～22min，A 25-25％；22～27min，A 25-27％；27～47min，A27-31％；47～49min，A 31-38％；49～54min，A 38-40％；54～64min，A40-40％；64～69min，A40-60％；69～74min，A 60-90％；74～76min，A 90-10％；76～80min，A 10-10％。可见洗脱条件三对应图谱的色谱峰分离最佳，峰型最好。如图4所示。图4从上到下依次为洗脱条件一、二、三分别对应的色谱图。
有益效果：
1、本发明根据地锦草中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱和柱温等分析条件，并建立了地锦草的指纹图谱检测方法和10个有效成分的回规方程。可以全面、客观、准确的检测和评价地锦草的质量，为保证临床地锦草疗效具有重要意义。
2、本发明提供的地锦草的检测方法，经方法学验证表明，具有稳定性好、精密度高、重现性好、准确度高等优点。
附图说明
图1为混合对照品的UPLC色谱图。
图2为地锦草供试品溶液的UPLC色谱图。
图3为本发明48批地锦草的UPLC指纹图谱。
图4为不同梯度洗脱条件下地锦草供试品溶液的UPLC色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例用到的仪器与试剂如下：
1、材料
1.1仪器
Waters ACQUITY UHPLC系统，购自美国Waters公司；Milli-Q超纯水仪，购自德国Merck公司；离心机，购自美国Beckman公司；超声波清洗机，购自昆山禾创超声仪器有限公司。
1.1药物与试剂
地锦草，为大戟科植物地锦Euphorbia humifusaWilld.的干燥全草，采集自安徽、湖南、湖北、山东、河南、内蒙古、浙江产地共48批次，见表1。化学对照品：没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素，购自上海源叶生物科技有限公司，纯度大于98％。甲醇，色谱纯，购自德国Merck公司；甲酸，色谱纯，购自科密欧公司。
表1地锦草样品信息表
| 序号 | 编号 | 产地 | 批号 | 序号 | 编号 | 产地 | 批号 |
| 1 | AH1 | 安徽 | 20190615 | 25 | HB9 | 湖北 | 20190810 |
| 2 | AH2 | 安徽 | 20190611 | 26 | HB10 | 湖北 | 20190620 |
| 3 | AH3 | 安徽 | 20190523 | 27 | HB11 | 湖北 | 20190612 |
| 4 | AH4 | 安徽 | 20190510 | 28 | SD1 | 山东 | 20190601 |
| 5 | AH5 | 安徽 | 20190616 | 29 | SD2 | 山东 | 20190612 |
| 6 | AH6 | 安徽 | 20190612 | 30 | SD3 | 山东 | 20190613 |
| 7 | AH7 | 安徽 | 20190606 | 31 | SD4 | 山东 | 20181220 |
| 8 | AH8 | 安徽 | 20190601 | 32 | SD5 | 山东 | 20181206 |
| 9 | AH9 | 安徽 | 20190525 | 33 | SD6 | 山东 | 20190606 |
| 10 | AH10 | 安徽 | 20190620 | 34 | SD7 | 山东 | 20190620 |
| 11 | AH11 | 安徽 | 20190629 | 35 | SD8 | 山东 | 20190812 |
| 12 | AH12 | 安徽 | 20190512 | 36 | SD9 | 山东 | 20190615 |
| 13 | HN1 | 湖南 | 20190810 | 37 | H1 | 河南 | 20190812 |
| 14 | HN2 | 湖南 | 20190812 | 38 | H2 | 河南 | 20190601 |
| 15 | HN3 | 湖南 | 20190316 | 39 | H3 | 河南 | 20190612 |
| 16 | HN4 | 湖南 | 20190310 | 40 | H4 | 河南 | 20190613 |
| 17 | HB1 | 湖北 | 20190606 | 41 | NM1 | 内蒙古 | 20181220 |
| 18 | HB2 | 湖北 | 20190907 | 42 | NM2 | 内蒙古 | 20181206 |
| 19 | HB3 | 湖北 | 20190618 | 43 | NM3 | 内蒙古 | 20190606 |
| 20 | HB4 | 湖北 | 20190619 | 44 | NM4 | 内蒙古 | 20190612 |
| 21 | HB5 | 湖北 | 20190708 | 45 | ZJ1 | 浙江 | 20190618 |
| 22 | HB6 | 湖北 | 20190718 | 46 | ZJ2 | 浙江 | 20190816 |
| 23 | HB7 | 湖北 | 20190725 | 47 | ZJ3 | 浙江 | 20180907 |
| 24 | HB8 | 湖北 | 20190816 | 48 | ZJ4 | 浙江 | 20191101 |
实施例1一种地锦草的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
步骤1、供试品溶液的制备
按表1分别取48批次的地锦草粉末(过三号筛)约1.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80％甲醇50mL，称定重量，超声提取45min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，过滤，离心，取上清液过0.22μm有机微孔滤膜，即得48批次地锦草的供试品溶液。
步骤2、混合对照品溶液的制备
精密称取对照品化合物没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素，加适量甲醇使溶解，配制成浓度为2mg/mL的单标储备液；
定量吸取各单标储备液，制得浓度分别为400ug/mL、800ug/mL、400ug/mL、1328ug/mL、400ug/mL、320ug/mL、200ug/mL、50ug/mL、50ug/mL、24ug/mL的没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素的混合对照品溶液。
步骤3、线性关系考察
将步骤2的混合对照品溶液用甲醇按照逐级稀释法逐级稀释，制成5个不同浓度的混合对照品溶液，然后分别注入高效液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到各对照品的回归方程如下表2所示：
表2地锦草各成分的线性关系和LOD、LOQ
步骤4、精密吸取步骤1的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤5、将步骤4中获得的不同批次的地锦草供试品溶液的指纹图谱导出，将其导入中药指纹图谱相似度评价系统2012版，生成地锦草特征指纹图谱，如图3所示；
步骤6、通过比对地锦草特征指纹图谱与混合对照品色谱峰保留时间，对地锦草特征指纹图谱进行归属，分别为峰1(没食子酸)、峰3(没食子酸乙酯)、峰4(槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰6(木犀草苷)、峰8(鞣花酸)、峰10(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰12(紫云英苷)、峰13(槲皮素)、峰14(木犀草素)、峰16(芹菜素)。图1为混合对照品溶液的特征色谱图。图2为地锦草(编号AH1，批号20190615)供试品溶液的特征色谱图。
步骤7、根据步骤3建立的回归方程，计算不同批次地锦草中10个成分的含量，如下表3和表4所示。
表3 48批次地锦草中各成分的百分含量(％)
表4 48批次地锦草中各成分的百分含量(％)
由以上地锦草样品含量测定结果显示，没食子酸、没食子酸乙酯、鞣花酸、紫云英苷、槲皮素、木犀草素，这6个成分在48批次地锦草样品中均可检测到，槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素这4个成分在部分批次地锦草中低于检测限，这10个成分的平均含量为0.1177±0.0874％、0.0525±0.0611％、0.0157±0.0090％、0.8300±0.9868％、0.1370±0.0680％、0.0613±0.0810％、0.0267±0.0171％、0.0097±0.0029％、0.0101±0.0038％、0.0044±0.0059％。
以上所述的地锦草的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤3和4中，液相色谱条件为：色谱柱：Waters Sun Fire C18色谱柱，规格250mm×4.6mm,5μm，柱温30℃，进样体积：10μL，流动相：以甲醇为A相，0.2％甲酸水为B相，梯度洗脱，流速：0.8mL/min，检测波长254nm。梯度洗脱条件如下：
| 时间/分钟 | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0～12 | 10％→24％ | 90％→76％ |
| 12～17 | 24％→25％ | 76％→75％ |
| 12～22 | 25％→25％ | 75％→75％ |
| 22～27 | 25％→27％ | 75％→73％ |
| 27～47 | 27％→31％ | 73％→69％ |
| 47～49 | 31％→38％ | 69％→62％ |
| 49～54 | 38％→40％ | 62％→60％ |
| 54～64 | 40％→40％ | 60％→60％ |
| 64～69 | 40％→60％ | 60％→40％ |
| 69～74 | 60％→90％ | 40％→10％ |
| 74～76 | 90％→10％ | 10％→90％ |
| 76～80 | 10％→10％ | 90％→90％ |
实施例2指纹图谱检测方法学研究
1、精密度考察：取混合对照品溶液，按实施例1的色谱条件进行UPLC分析，1天内连续进样6次，测定10个成分的峰面积，用各成分峰面积的相对标准偏差(RSD)评价日内精密度；混合对照品溶液进样3针，重复3天，用各成分峰面积的RSD评价日间精密度；RSD小于5％，表明精密度良好。
2、重复性考察：取批次201906151样品1.5g，精密称定，共6份；按实施例1方法制备得到供试品溶液，按实施例1的色谱条件进行UPLC分析，测定10个成分的峰面积，用各成分峰面积的RSD评价重复性，RSD在1.36％-2.93％，表明重复性良好。
3、稳定性考察：取批次201906151，按实施例1方法制备得到供试品溶液，按实施例1色谱条件进行UPLC分析，分别在0，2，4，8，12，24h测定其峰面积，RSD在0.82％-2.95％，表明其稳定性较好。
4、加样回收率考察
取批次201906151样品1.5g，精密称定；加入三种不同浓度(低80％、中100％、高120％)混合标准品溶液，制成供试品溶液，按实施例1色谱条件进行UPLC分析，根据峰面积及加入对照品的量计算回收率，回收率在91.26％-104.39％范围内。
5、实验结果
如表5，精密度RSD<5％，重复性和稳定性RSD<3％，加样回收率在91.26％-104.39％范围内。
表5地锦草各成分的精密度、重复性、稳定性、加样回收率
以上试验结果表明，本发明建立的指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价地锦草的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种地锦草的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、供试品溶液的制备
取地锦草粉末，精密称定，置玻璃容器中，精密加入甲醇或乙醇，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇或乙醇补足减失的重量，过滤，离心，取上清液，过微孔滤膜，即得供试品溶液；
步骤2、混合对照品溶液的制备
精密称取对照品化合物没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素，加适量甲醇或乙醇使溶解，配制成单标储备液；
定量吸取各单标储备液，制得没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素的混合对照品溶液；
步骤3、线性关系考察
将步骤2的混合对照品溶液用甲醇按照逐级稀释法逐级稀释，制成5个不同浓度的混合对照品溶液，然后分别注入高效液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到各对照品的回归方程：
步骤4、精密吸取步骤1的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤5、将步骤4中获得的不同批次的地锦草供试品溶液的指纹图谱导出，将其导入中药指纹图谱相似度评价系统2012版，生成地锦草特征指纹图谱；
步骤6、通过比对地锦草特征指纹图谱与混合对照品色谱峰保留时间，对地锦草特征指纹图谱进行归属；
步骤7、根据步骤3建立的回归方程，计算不同批次地锦草中10个成分的含量；
步骤3和4中，液相色谱条件为：色谱柱：Waters Sun Fire C18色谱柱，规格为长度250mm、内径4.6mm、色谱柱填料颗粒直径5μm，柱温30℃，进样体积：10μL，流动相：以甲醇为A相，0.2％甲酸水为B相，梯度洗脱，流速：0.8mL/min，检测波长254nm；
梯度洗脱条件如下：
。
2.根据权利要求1所述的地锦草的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤1：供试品溶液制备方法为：取地锦草粉末，过三号筛，精密称定，置锥形瓶中，精密加入体积浓度80％甲醇，称定重量，超声提取30～45min，放冷，再称定重量，用体积浓度80％甲醇补足减失的重量，过滤，离心，取上清液过直径0.22μm有机微孔滤膜，即得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的地锦草的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备方法为：
精密称取对照品化合物没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素，加适量甲醇使溶解，配制成浓度为2mg/mL的单标储备液；
定量吸取各单标储备液，制得浓度分别为400ug/mL、800ug/mL、400ug/mL、1328ug/mL、400ug/mL、320ug/mL、200ug/mL、50ug/mL、50ug/mL、24ug/mL的没食子酸、没食子酸乙酯、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷、鞣花酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的地锦草的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤6的地锦草特征指纹图谱中，峰1为没食子酸、峰3为没食子酸乙酯、峰4为槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、峰6为木犀草苷、峰8为鞣花酸、峰10为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、峰12为紫云英苷、峰13为槲皮素、峰14为木犀草素、峰16为芹菜素。
5.根据权利要求1所述的地锦草的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤3各对照品的回归方程如下：
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| CN102078363A (zh) * | 2009-11-30 | 2011-06-01 | 江西济民可信药业有限公司 | 地锦草中药制剂的检测方法 |
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| CN113049700A (zh) * | 2021-03-18 | 2021-06-29 | 江苏弘典中药产业研究院有限公司 | 五味消毒饮的指纹图谱检测方法 |
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