CN104374854A - 一种hplc波长切换技术同时测定诺尼果汁中多种酚酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种HPLC波长切换技术同时测定诺尼果汁中多种酚酸含量的方法，该方法包括利用高效液相色谱波长切换技术，对诺尼果汁中的酚酸物质进行定性和定量分析：选用C18色谱柱，流动相为甲醇-冰醋酸水溶液，梯度洗脱，检测器为二极管阵列检测器，通过波长切换完成同时对多种酚酸成分的分离与测定，以标准品峰面积外标法定量。本发明特点在于运用波长切换技术去除干扰物质的影响、同时测定出诺尼果汁中6种酚酸的含量，测定组分在30min内可达到较好分离，准确度高、重现性好。本发明能有效分离、准确测定诺尼果汁中多种酚酸物质，对诺尼果汁功效性成分的研究和产品质量的评价具有重要意义。

Description

一种HPLC波长切换技术同时测定诺尼果汁中多种酚酸含量的方法

技术领域

本发明涉及一种HPLC波长切换技术同时测定诺尼果汁中多种酚酸含量的检测方法。

背景技术

诺尼(Noni)是一种热带常绿多年生阔叶灌木或小乔木，又名海巴戟，海巴戟天，萝荔。学名Morinda citrifolia Linn.，为茜草科巴戟天属植物，原产于一些太平洋岛屿、东南亚和澳大利亚等地，现引种于我国海南省。诺尼果有丰富的营养和药用价值，被人们称为“神奇果”富含大量活性成分如多糖、酚类、黄酮类和环烯醚萜类等，具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、降血脂和保护心血管等功能，对多种疾病有预防和治疗作用。

酚酸是植物多酚类物质的一类，具有独特的保健生物活性，具有抗氧化、清除自由基，抗肿瘤、增强免疫力、保护心血管等作用，与人体健康密切相关，逐渐成为研究热点。诺尼果汁含有丰富的多酚类活性物质，其中酚酸种类较多，目前，尚无对诺尼果汁中多种酚酸物质定性和定量的研究。因此需要建立一种测定诺尼果汁中酚酸类物质的检测方法，为诺尼果汁功效性成分的研究提供依据。

发明内容

本发明目的在于提供一种HPLC波长切换技术同时测定诺尼果汁中多种酚酸含量的检测方法，对诺尼果汁中酚酸类物质没食子酸、龙胆酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸同时进行测定，为诺尼果汁功效性成分的研究和产品质量的评价提供可信依据。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种HPLC波长切换技术同时测定诺尼果汁中多种酚酸含量的检测方法，采用高效液相色谱、二极管阵列检测器波长切换技术同时对诺尼果汁中6种酚酸进行定性和定量分析，其特征在于：

本发明所述检测6种酚酸，分别为：没食子酸、龙胆酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸。

本发明中标准品的制备方法为：

分别称取标准品没食子酸50mg、龙胆酸100mg、P-羟基苯甲酸500mg、绿原酸200mg、咖啡酸50mg、阿魏酸30mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得混合标准品储备液，于冰箱4℃避光保存。使用前，根据实验需要将此标准储备液用50%甲醇稀释10-100倍，配制成系列标准混合溶液，测定前经0.22 μm微孔滤膜过滤。

本发明中样品的制备方法为：

取15 mL诺尼果汁，每次用45mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有机相，浓缩后，残渣溶于1 mL50 %甲醇中，测定前样品经0.22 μm微孔滤膜过滤，用于进样分析。

本发明的色谱条件为：

色谱柱为Thermo Accucore XL C18 (250 mm×4.6 mm，4 μm)；柱温为30 ℃；流动相A 0.95 %冰醋酸溶液；流动相B甲醇；梯度洗脱条件为0-11 min，5 % B； 11-17min，20% B；17-22min，30 % B；22-50min，5% B；流速为0.8min/mL；检测器为Thermo DAD-3000；检测波长为280nm和330nm（龙胆酸、咖啡酸和阿魏酸波长切换为330nm处检测，没食子酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸在280nm处检测）。在上述色谱条件下，取标准品和样品制备溶液分别进样，记录色谱图。

本发明中所述的诺尼果汁为纯诺尼果汁或含诺尼成分的其它产品。

本发明采用高效液相色谱法，通过梯度洗脱，检测过程波长切换，同时测定诺尼果汁中6种酚酸的含量。结果6种酚酸组分的质量浓度与峰面积具有良好的线性关系；相关系数均大于0.991，且6种酚酸组分在30 min内可得到较好分离。平均回收率为91.18%～101.08 %，相对标准偏差为0.73%～2.17 %。本法快速、简便、准确、高效，可用于同时测定诺尼果汁中没食子酸、龙胆酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸6种酚酸的含量，为诺尼果汁功效性成分的研究和产品质量的评价提供科学、可信依据。

本发明由于采用以上技术方案，具有以下优点：

1. 采用波长切换技术进行检测，用二极管阵列检测器综合考虑不同酚酸组分最强吸收且杂质干扰较小的波长进行波长切换检测。可在一张色谱图中较好的对测定组分进行分离；去除干扰杂质，有利于组分含量准确计算，具有方便、快捷、高效、方法稳定、重现性好的优点；

2. 流动相的选择：本发明在流动相中添加少量冰醋酸作为酸性调节剂，使分离效果和峰形得到改善。考察了0.5%-9%不同浓度冰醋酸溶液对6种酚酸的分离效果，最终流动相选择采用A液（0.95%冰醋酸水溶液）和B液（甲醇），6种酚酸组分能较好分离，且各组分之间分离度均大于1.5；

3. 样品的制备方法：实验采用不同萃取溶剂对样品中酚酸进行提取，根据回收率最终确定采用乙酸乙酯提取，平均回收率可达91.18%～101.08 %；

4. 梯度洗脱条件：本发明进行了多种梯度洗脱条件研究，最终确定以下洗脱程序：0～11min，B为5%；11～17min，B为20%；17～22min，B为30%；22～50min，B为5%。在此梯度条件下，没食子酸、龙胆酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸均能得到较好的分离、峰形良好、保留时间稳定。

附图说明

图1 为本发明没食子酸、龙胆酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸6种酚酸混和标准品色谱图。其中1.没食子酸；2.龙胆酸；3.P-羟基苯甲酸；4.绿原酸；5.咖啡酸；6.阿魏酸。

图2 为本发明诺尼果汁样品的色谱图。其中1.没食子酸；2.龙胆酸；3.P-羟基苯甲酸；4.绿原酸；5.咖啡酸；6.阿魏酸。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明进行进一步说明，但本发明并不限于以下实施案例。

实施例1

1. 材料

1.1 仪器

Thermo UltiMate 3000型高效液相色谱仪（DAD-3000二极管阵列检测器，Chromeleon 7色谱工作站，Thermo Fisher公司）； Thermo Accucore XL C18 (250 mm×4.6 mm，4 μm) 色谱柱；旋转蒸发仪IKA-RV10（德国艾卡公司）。

1.2 试剂

标准品没食子酸、龙胆酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸购自北京百灵威科技有限公司（纯度≥98%）。甲醇、冰醋酸为色谱纯，乙酸乙酯为分析纯，实验所用水均为超纯水。

1.3 样品

诺尼果汁由海南诺尼生物工程开发有限公司生产，产品批次为20121228、20130105、20130603、20140313、20140325和20140326。

2. 方法与结果

2.1 混合标准品溶液制备

分别称取标准品没食子酸50mg、龙胆酸100mg、P-羟基苯甲酸500mg、绿原酸200mg、咖啡酸50mg、阿魏酸30mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得混合标准品储备液，于冰箱4℃避光保存。使用前，根据实验需要将此标准储备液用50%甲醇稀释10-100倍，配制成系列标准混合溶液，测定前经0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.2 样品的制备

取15 mL诺尼果汁，每次用45mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有机相，用旋转蒸发仪（真空，40℃）浓缩后，残渣溶于1 mL 50 %甲醇中，置于冰箱4℃避光保存，待液相分析用。测定前样品经0.22 μm微孔滤膜过滤。

2.3 色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore XL C18 (250 mm×4.6 mm，4 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A液 0.95 %冰醋酸溶液；B液 甲醇；梯度洗脱条件见表1；流速：0.8min/mL；检测器：Thermo DAD-3000；检测波长：280nm和330nm（龙胆酸、咖啡酸和阿魏酸波长切换为330nm处检测，没食子酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸在280nm处检测）。在上述色谱条件下，取标准品和样品制备溶液分别进样，记录色谱图。

表1  梯度洗脱条件

时间（min）	0~11	11~17	17~22	22~50
					A液	95	80	70	95
B液	5	20	30	5

2.4 样品的测定

取不同批次诺尼果汁，进行样品制备，在上述色谱条件下进样分析，每个样品平行进样3次，按外标法计算酚酸含量，取平均值。结果如表2所示。

表2  诺尼果汁中酚酸含量

实施例2

方法学考察

1. 线性范围及检出限

取系列标准品混合溶液进样1μL分析，每个浓度标准品重复进样3次，以标准品峰面积y对浓度 x(mg/mL)绘制标准曲线，得到6种标准品的回归方程及检出限见表3。

表3  6种酚酸组分的线性范围及回归方程

2. 精密度试验

取诺尼果汁（批号20140325）一份，进行样品制备，在上述色谱条件下连续进样 6 次，记录6种酚酸质量浓度，其 RSD值见表4。

表4   精密度测定结果

3.  重现性试验

取同一批诺尼果汁（批号20140325）6 份，进行样品制备，按上述色谱条件进样分析，测定6种酚酸质量浓度，其 RSD值见表5。

表5 重现性测定结果

4. 加标回收率

向已知6种酚酸含量的诺尼果汁（批号20140325）样品中定量添加标准品的混合溶液，进行样品制备，重复6次，根据测得样品中6种酚酸的含量分别计算相应组分的回收率及标准偏差（RSD），结果见表6。

表6  回收率测定结果

综上所述本发明建立了一种新型、简便、准确、高效同时测定诺尼果汁中6种酚酸的高效液相色谱分析方法。发明人综合考虑样品组分的提取率、峰分离度、峰对称性、峰最大吸收、去除杂质干扰、保留时间等因素，最终确定采用乙酸乙酯对样品进行提取，色谱条件采用：色谱柱为Thermo Accucore XL C18 (250 mm×4.6 mm，4 μm)；柱温为30 ℃；流动相A液 0.95 %冰醋酸溶液；B液 甲醇；梯度洗脱条件为0-11 min，5 % B； 11-17min，20% B；17-22min，30 % B；22-50min，5% B；流速为0.8min/mL；检测器为Thermo DAD-3000；检测波长为280nm和330nm（龙胆酸、咖啡酸和阿魏酸波长切换为330nm处检测，没食子酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸在280nm处检测）对样品和标准品进行测定。通过对液相色谱条件的选择和优化，6种酚酸在30min内得到了很好地分离且回收率均在91%以上，该方法简单、实用且准确度较高，重复性好，适用于诺尼果汁中酚酸类物质的测定。

Claims (7)

1.一种HPLC波长切换技术测定诺尼果汁中多种酚酸含量的方法，其特征在于：按照下述步骤同时对诺尼果汁中没食子酸、龙胆酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸6种酚酸进行定性和定量分析：

 (1) 混合标准溶液制备

分别精确称取标准品没食子酸50mg、龙胆酸100mg、P-羟基苯甲酸500mg、绿原酸200mg、咖啡酸50mg、阿魏酸30mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，为混合标准品储备液，于冰箱4℃避光保存；使用前，根据实验需要将此标准储备液用50%甲醇稀释10-100倍，配制成系列混合标准溶液, 测定前经0.22μm微孔滤膜过滤；

(2) 样品制备

取适量诺尼果汁，经有机溶剂多次萃取，合并有机相，浓缩，残渣溶于50 %甲醇中，测定前样品经0.22μm微孔滤膜过滤，用于进样分析；

(3) 高效液相色谱分离检测条件

采用C18反相色谱柱，以流动相A 冰醋酸溶液；流动相B 甲醇，采用梯度洗脱，二极管阵列检测器波长切换技术测定，检测温度25-35℃，流速0.8-1.0 mL/min；

(4) 样品定性和定量分析

采用系列标准混合溶液按照步骤(1)进行配制，按步骤(3)色谱条件进样；以峰面积y对质量浓度 x绘制标准曲线，得到6种酚酸标准品的回归方程；每个样品按步骤（2）进行前处理后，按步骤(3)色谱条件分别进样分析，样品峰与标准品峰保留时间比对定性，样品峰面积代入相对应的标准曲线回归方程定量。

2.根据权利要求书1所述的方法其特征在于：所述步骤(2)样品制备最优方法为取15 mL诺尼果汁，每次用45mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有机相，浓缩后，残渣溶于1 mL 50 %甲醇中，测定前样品经0.22 μm微孔滤膜过滤，用于进样分析。

3.根据权利要求书1所述的方法其特征在于：所述步骤(3)流动相A为冰醋酸溶液最佳浓度为0.95%。

4.根据权利要求书1所述的方法其特征在于：所述步骤(3)色谱条件流动相A为冰醋酸溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱分离程序如下表所示：

 时间（min） 0~11 11~17 17~22 22~50 A液 95 80 70 95 B液 5 20 30 5

。

5.根据权利要求书1所述的方法其特征在于：所述步骤(3)色谱条件采用二极管阵列检测器波长切换检测，检测波长为280nm和330nm（龙胆酸、咖啡酸和阿魏酸波长切换在330nm处检测，没食子酸、P-羟基苯甲酸、绿原酸波长切换在280nm处检测）。

6.根据权利要求书1所述的方法其特征在于：所述步骤(3)色谱条件最佳检测柱温为30℃，最佳流速为0.8mL/min，测定时间为50min（其中0-30min为组分分离时间，30-50min为流动相恢复梯度初始浓度平衡时间）。

7.根据权利要求书1-6所述的方法其特征在于：所述的诺尼果汁为纯诺尼果汁或含诺尼成分的其它产品。