CN102721778A - 一种快速高效测定葡萄酒中酚酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速高效测定葡萄酒中13种酚酸的方法，属于葡萄酒风味物质分析技术领域。本发明利用超高效液相色谱，对葡萄酒中的酚酸物质进行定性和定量分析：选取BEHC18色谱柱，流动相为2%乙酸水和甲醇，流速设定为0.3mL/min，紫外检测波长龙胆酸为320nm，其余均为280nm，柱温50℃，进样量为1μL，以峰面积外标法定量，可以在10min内同时对葡萄酒中13种酚酸进行检测分析。本发明无需进行任何样品前处理，避免因前处理导致的损失；与传统HPLC相比，本发明可同时检测出更多的酚酸类化合物，并且分离效果好，分析过程大大缩短，方便易操作，极大的提高了检测效率及节省流动相成本。本发明为进一步系统研究葡萄酒中的风味物质，提高葡萄酒品质有重要意义。
Description
技术领域
一种快速高效同时测定葡萄酒中13种酚酸的方法，属于葡萄酒风味物质分析技术领域。
背景技术
酚酸类物质是葡萄酒中一类重要的酚类化合物，这类化合物具有一个苯核，主要为对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸的衍生物，包括没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等。越来越多的研究表明，酚酸类物质是一类具有独特的保健作用的生物活性物质，具有抗氧化、清除自由基、抑制突变和抗肿瘤、抗血小板凝集、促进前列腺素的释放、抗菌、抗病毒、止血、增高白血球，缩短血凝和出血时间等重要的生理功能。此外，酚酸与葡萄酒的品质也有着密切的关系。在葡萄酒中，酚酸（如咖啡酸、香豆酸等）可与花色素和酒石酸相结合，从而影响着葡萄酒的色度与颜色稳定性。没食子酸是主要的对羟基苯甲酸类酚酸，是葡萄酒中氧自由基清除能力的主要承担者。咖啡酸是主要的对羟基肉桂酸，同样是葡萄酒中氧自由基清除能力的主要承担者之一。葡萄酒中酚酸类物质的研究一直是国内外葡萄酒研究的一个热点。
目前，酚酸的分析测定方法主要有紫外法、薄层色谱法，高效液相色谱法（HPLC），毛细管电泳法，气相色谱法以及液质、气质联用等。紫外法由于样品中伴随着其他酚类物质的存在，酚酸和其他酚类物质等在相同波长下均有较强的吸收，因此测定值一般偏高；而纸层析法、薄层层析法在分离效果、速度、定量准确度等方面存在缺陷；气相色谱法用于酚酸类物质的分离，测定速度快，灵敏度高，但该方法需衍生化处理，前处理比较繁琐，且不适于大分子质量物质；高效毛细管电泳法则存在着重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等缺点。高效液相色谱法仍是目前应用最为广泛的一种检测方法，但利用HPLC检测葡萄酒中酚酸仍存在检测时间长，流动相消耗量大等缺点。陈建业等在《中国食品学报》2006年第6期的“葡萄酒中11种酚酸的反相高效液相色谱测定方法研究”公开了葡萄酒中酚酸的检测，但只检测到葡萄酒中11种酚酸物质，检测时间长达53分钟，并且有部分物质分离效果较差。目前基于HPLC的酚酸测定方法并不能快速高效的对葡萄酒中酚酸进行定性和定量分析。
发明内容
本发明为解决现有的酚酸测定方法存在成本高，检测时间长等问题，提供了一种利用超高效液相色谱仪对葡萄酒中酚酸进行定性、定量分析的方法。
本发明的技术方案：一种快速高效测定葡萄酒中酚酸的方法，利用超高效液相色谱UPLC和二极管阵列检测器同时对葡萄酒中13种酚酸进行定性和定量分析：
所述检测13种酚酸，分别为：没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、鞣花酸、水杨酸；
（1）标准溶液配置：
分别精确称取所述13种酚酸各10.0-15.0mg，用甲醇溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，封口，作为标准贮备液，在-20℃保存备用；使用前，根据实验需要将此标准贮备液用甲醇稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液；
（2）葡萄酒样品经过0.45μm滤膜过滤，用于进行检测分析；
（3）超高效液相色谱分离检测条件：
检测仪器：Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，包括四元溶剂管理器（QSM），样品管理器（SM-FTN），色谱柱温箱，光电二极管阵列检测器（PDA）；
色谱柱：美国Bridge Ethylene Hybrid (BEH) C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm，Waters)，或同类UPLC C18色谱柱；
流动相A：乙酸:水为2:98，v/v，即2%乙酸水；
流动相B：甲醇；
流速：0.3 mL/min；
洗脱程序：0-3.2 min，A为92％-80％，B为8％-20％；3.2-8 min，A为80％-56％，B为20％-44％；8-8.2 min，A为56％-92％，B为44％-8％；8.2-10 min，A为92％，B为8％；
检测波长：龙胆酸为320 nm，其余均为280 nm；
柱温50℃，进样量为1 μL，以峰面积外标法定量；
紫外检测器的选择：选用二极管阵列检测器；
（4）定性：
对13种酚酸混合标准品进行色谱检测，得到13种酚酸标准品色谱图（如图1所示）；对葡萄酒样品进行色谱检测，得到葡萄酒样品中13种酚酸的UPLC色谱图（如图2所示）。结果表明，13种酚酸标准品和葡萄酒样品在上述色谱条件下，能够充分分离；通过增高法进行定性分折；
用增高法进行定性，图1所示的13种酚酸标准品出峰顺序依次为：没食子酸（1，1.157 min），原儿茶酸（2，1.884 min），龙胆酸（3，2.826 min），对羟基苯甲酸（4，2.944 min），绿原酸（5，3.455 min)，咖啡酸（6，3.802 min），香草酸（7，4.028 min），丁香酸（8，4.729 min），香豆酸（9，5.443 min），阿魏酸（10，6.387 min），芥子酸（11，6.679 min），鞣花酸（12，7.292 min），水杨酸（13，7.558 min)。
（5）定量
制作标准曲线：准确配制0.2-211.2 mg/L的五个不同浓度的13种酚酸的混合标样，标准品浓度的选择依据为最终检测葡萄酒样品中13种酚酸含量在制作标准曲线的线性范围内。按照上述液谱条件进样，进样量为1μL；以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到13条标准曲线；结果见表1。从表1中可知，13种酚酸标准品的溶液含量和检测响应值呈现出良好的线性关系，并且最低检测限都较低，表明此方法灵敏度较高。
定量：每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。
表1 13种酚酸的保留时间、回归方程和检出限
（6）稳定性检验
在上述色谱条件下，分别将葡萄酒样品连续进样5次，对其保留时间和13种酚酸的峰面积进行统计分析。结果表明（见表2）其保留时间相对标准偏差（RSD）都极小，均低于1%；样品峰面积相对标准偏差均小于1%。结果表明，色谱工作稳定，重现性良好。
表2 色谱稳定性检验
| 化合物 | 保留时间 (min) | RSD (%) | 峰面积 | RSD (%) |
| 没食子酸 | 1.155 | 0.42 | 1965185.67 | 0.29 |
| 原儿茶酸 | 1.877 | 0.27 | 1143565.33 | 0.08 |
| 龙胆酸 | 2.846 | 0.64 | 639432.67 | 0.75 |
| 对羟基苯甲酸 | 2.963 | 0.57 | 1158047.67 | 0.06 |
| 绿原酸 | 3.458 | 0.57 | 1331544.67 | 0.69 |
| 咖啡酸 | 3.833 | 0.35 | 1293854.33 | 0.09 |
| 香草酸 | 4.003 | 0.45 | 2259237.67 | 0.51 |
| 丁香酸 | 4.757 | 0.26 | 2362584.67 | 0.04 |
| 香豆酸 | 5.472 | 0.33 | 2025789.33 | 0.07 |
| 阿魏酸 | 6.411 | 0.23 | 2388479.33 | 0.39 |
| 芥子酸 | 6.718 | 0.23 | 837972.00 | 0.41 |
| 鞣花酸 | 7.325 | 0.19 | 659433.33 | 0.44 |
| 水杨酸 | 7.536 | 0.22 | 622246.00 | 0.20 |
本发明的有益效果：本发明建立的方法能够高效、快速检测葡萄酒中13种酚酸物质，并能对这些物质进行定性定量。葡萄酒无需进行任何前处理，避免因前处理导致的损失，可以真实反映葡萄酒中酚酸的含量水平。此外，本方法可以在10 min内对葡萄酒中13种酚酸进行检测分析，检出酚酸种类多，分离效果良好；同时与HPLC相比，洗脱时间缩短6倍，分析过程快速，方便易操作，大大提高了检测效率及节省更多的流动相成本。
附图说明
图1 13种酚酸标准品色谱图（a为280 nm；b为320 nm）
图2 葡萄酒样品色谱图（a为280 nm；b为320 nm）。
具体实施方式
实施例1
取某红葡萄酒样品经0.45 μm滤膜过滤后进行UPLC检测分析。色谱条件：美国Bridge Ethylene Hybrid (BEH) C18色谱柱 (100mm × 2.1 mm，1.7 μm，Waters)，或同类UPLC C18色谱柱。紫外检测波长除龙胆酸为320 nm，其余均为280 nm，柱温50℃，进样量为1 μL。流动相：A为2%乙酸水；B为甲醇；流速为0.3 mL/min。洗脱程序：0-3.2 min，A为92％-80％，B为8％-20％；3.2-8 min，A为80％-56％，B为20％-44％；8-8.2 min，A为56％-92％，B为44％-8％；8.2-10 min，A为92％，B为8％。样品检测重复三次，以峰面积外标法定量。
结果表明，该方法能够成功对红葡萄酒中13种酚酸进行定性定量分析，并且具有良好的重现性。表3为某红葡萄酒样品中酚酸的检测结果。
表3 某红葡萄酒样品酚酸含量（mg/L）
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 | |
| 没食子酸 | 11.09 | 11.13 | 11.03 | 11.08 |
| 原儿茶酸 | 0.52 | 0.51 | 0.54 | 0.52 |
| 龙胆酸 | 7.13 | 7.06 | 7.21 | 7.13 |
| 对羟基苯甲酸 | 9.7 | 9.73 | 9.79 | 9.74 |
| 绿原酸 | 5.46 | 5.36 | 5.41 | 5.41 |
| 咖啡酸 | 7.24 | 7.29 | 7.12 | 7.22 |
| 香草酸 | 1.06 | 1.01 | 1.09 | 1.05 |
| 丁香酸 | 3.67 | 3.74 | 3.71 | 3.71 |
| p-香豆酸 | 6.74 | 6.65 | 6.61 | 6.67 |
| 阿魏酸 | 0.52 | 0.51 | 0.48 | 0.50 |
| 芥子酸 | 0.65 | 0.66 | 0.64 | 0.65 |
| 鞣花酸 | 1.46 | 1.41 | 1.39 | 1.42 |
| 水杨酸 | 2.36 | 2.45 | 2.31 | 2.37 |
实施例2
取某白葡萄酒样品经0.45 μm滤膜过滤后进行UPLC检测分析。色谱条件：美国Bridge Ethylene Hybrid (BEH) C18色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，1.7 μm，Waters)，或同类UPLC C18色谱柱。紫外检测波长除龙胆酸为320 nm，其余均为280 nm，柱温50℃，进样量为1μL。流动相：A为2%乙酸水；B为甲醇；流速为0.3 mL/min。洗脱程序：0-3.2 min，A为92％-80％，B为8％-20％；3.2-8 min，A为80％-56％，B为20％-44％；8-8.2 min，A为56％-92％，B为44％-8％；8.2-10 min，A为92％，B为8％。样品检测重复三次，以峰面积外标法定量。
结果表明，该方法能够成功对白葡萄酒中13种酚酸进行定性定量分析，并且具有良好的重现性。表4为某白葡萄酒样品中酚酸的检测结果。
表4 某白葡萄酒样品酚酸含量（mg/L）
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 | |
| 没食子酸 | 4.31 | 4.26 | 4.33 | 4.30 |
| 原儿茶酸 | 2.52 | 2.53 | 2.57 | 2.54 |
| 龙胆酸 | 4.21 | 4.25 | 4.28 | 4.25 |
| 对羟基苯甲酸 | 6.03 | 6.05 | 6.11 | 6.06 |
| 绿原酸 | 1.80 | 1.74 | 1.84 | 1.79 |
| 咖啡酸 | 6.51 | 6.47 | 6.53 | 6.50 |
| 香草酸 | nd | nd | nd | - |
| 丁香酸 | nd | nd | nd | - |
| p-香豆酸 | 2.36 | 2.32 | 2.37 | 2.35 |
| 阿魏酸 | 0.49 | 0.51 | 0.53 | 0.51 |
| 芥子酸 | nd | nd | nd | - |
| 鞣花酸 | 1.24 | 1.21 | 1.27 | 1.24 |
| 水杨酸 | 2.01 | 2.00 | 2.06 | 2.02 |
nd：未检测到。
Claims (1)
1.一种快速高效测定葡萄酒中酚酸的方法，其特征在于利用超高效液相色谱UPLC和二极管阵列检测器同时对葡萄酒中13种酚酸进行定性和定量分析：
所述检测13种酚酸，分别为：没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、鞣花酸、水杨酸；
（1）标准溶液配置：
分别精确称取所述13种酚酸各10.0-15.0mg，用甲醇溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，封口，作为标准贮备液，在-20℃保存备用；使用前，根据实验需要将此标准贮备液用甲醇稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液；
（2）葡萄酒样品经过0.45μm滤膜过滤，用于进行检测分析；
（3）超高效液相色谱分离检测条件：
色谱柱：美国Bridge Ethylene Hybrid (BEH) C18色谱柱或同类UPLC C18色谱柱
流动相A：乙酸:水为2:98，v/v，即2%乙酸水；
流动相B：甲醇；
流速：0.3 mL/min；
洗脱程序：0-3.2 min，A为92％-80％，B为8％-20％；3.2-8 min，A为80％-56％，B为20％-44％；8-8.2 min，A为56％-92％，B为44％-8％；8.2-10 min，A为92％，B为8％；
检测波长：龙胆酸为320 nm，其余均为280 nm；
柱温50℃，进样量为1 μL，以峰面积外标法定量；
紫外检测器的选择：选用二极管阵列检测器；
（4）定性：
对13种酚酸混合标准品进行色谱检测，得到13种酚酸标准品色谱图；对葡萄酒样品进行色谱检测，得到葡萄酒样品中13种酚酸的UPLC色谱图；通过增高法进行定性分折；
（5）定量
制作标准曲线：准确配制0.2-211.2 mg/L的五个不同浓度的13种酚酸的混合标样，按照上述液谱条件进样，进样量为1μL；以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到13条标准曲线；
定量：每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121010 |