CN104407087A - 一种同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种超高效液相色谱法同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法，包括以下步骤：将经预处理的待测样品进行超高效液相色谱仪检测即可；检测使用梯度洗脱，流动相为乙腈-0.2％磷酸；梯度洗脱的条件：0～2min，6％乙腈；2～3min，6％～16％乙腈；3～8min，16％～20％乙腈；检测波长：0～2min，271nm，2～8min时253nm；流速：0.25ml/min；柱温：35℃；进样体积1μL；检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：BEH C18色谱柱。本发明能精确检测桃金娘根中的没食子酸和鞣花酸，方便快捷，试剂消耗少，灵敏度高,可用于桃金娘根药材的质量控制及定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及中药材化学成分检测领域，具体为一种利用超高效液相色谱法同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法。
背景技术
桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)是一种优良的野生植物资源，自然资源丰富，医药、保健利用价值高，主要分布在东南亚国家，尤盛产于中国和日本的南部等地区；桃金娘根(Radix Rhodomyrti)为桃金娘的干燥根，桃金娘根中化学成分主要为鞣质类、三萜类、黄酮类等，其中以没食子酸和鞣花酸为代表的鞣质类化合物是桃金娘根的主要有效成分，也是评价桃金娘根质量的主要指标。
目前，没食子酸和鞣花酸的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法等。分光光度法检测繁琐，灵敏度低，重现性差；高效液相色谱法耗时长，试剂消耗大；高效液相色谱串联质谱法虽然具有高分辨率、高灵敏度、高重现性等优点，但是仪器价格昂贵、维护繁琐，普及率不高。
发明内容
超高效液相色谱(UPLC)是一种基于小颗粒填料技术，具有超高速度、分离度和灵敏度以及低耗的新一代液相分离技术，本发明要解决的技术问题是，基于UPLC建立一种简便、快速、试剂消耗少、灵敏度高、能够同时测定桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的含量的方法。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种超高效液相色谱同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法，包括以下步骤：
(1)桃金娘根药材鉴定；
(2)标准溶液的配置：分别精密称取没食子酸对照品和鞣花酸对照品置于100mL棕色容量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含没食子酸10.00～150.0μg/mL和鞣花酸10.00～150.0μg/mL的混合对照品溶液；临用时，分别用二甲基亚砜依次稀释上述标准溶液，配制成不同浓度的标准工作液；
(3)样品前处理：将桃金娘根打粉，过筛，得到待检测的桃金娘根药材样品粉末，置干燥器中储存；准确称取0.1～1.0g桃金娘根粉末置于100ml具塞锥形瓶中，精密加入10～150mL甲醇，称定重量，按照50～1500W、25～100kHz和25～60℃的条件进行超声提取10～90min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，二甲基亚砜溶解并定容至25ml容量瓶中，过0.19～0.45μm滤膜后供含量测试用；
(4)超高效液相色谱检测，色谱条件如下：
色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.2％磷酸；梯度洗脱条件：第0～2min使用6％乙腈；第2～3min使用6％～16％乙腈；第3～8min使用16％～20％乙腈；检测波长：第0～2min检测波长为215～300nm；第2～8min检测波长为220～385nm；流速：0.1～0.5ml/min；柱温：20～45℃；进样体积0.3～10μL。
进一步地，本发明还包括以下用于验证所述的方法的精密度、稳定性和回收率的步骤：
(5)方法线性范围、精密度和检出限计算：在上述色谱条件下，分别精密吸取不同浓度的没食子酸和鞣花酸的混合对照品溶液注入液相色谱仪，以色谱峰峰面积(y)为纵坐标，以浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线；对没食子酸和鞣花酸混合对照品溶液进行3～17次平行测定，计算没食子酸和鞣花酸峰面积和迁移时间的RSD，验证方法精密度；根据IUPAC规定，计算本法检出限。
(6)稳定性试验：精密称取样品粉末，按步骤(3)样品前处理方法处理制备供试品，分别在制备后0、1、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积；计算没食子酸和鞣花酸峰面积的相对标准偏差，验证样品在24h内是否稳定。
(7)回收率试验：精密称取桃金娘根粉末样品9份，按步骤(3)样品前处理制备供试品方法制备供试品，分别向每一份供试品添加步骤(2)制备的含没食子酸和鞣花酸混合标准溶液，每个混合标准溶液浓度制备三份平行样品，并进样分析，计算回收率和相对标准偏差。
本发明利用超高效液相色谱法同时检测桃金娘根没食子酸和鞣花酸的方法，与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
(1)本发明超高效液相色谱法同时检测桃金娘根没食子酸和鞣花酸，样品前处理采用超声提取，整个检测时间8min，流动相试剂消耗仅需2mL，具有简便、快速、试剂消耗少、灵敏度高、重现性好等优点。
(2)根据IUPAC规定，本发明检出限(3σ,n＝11)没食子酸为0.45ng/mL，鞣花酸为0.23ng/mL。
(3)本发明可用于桃金娘根药材的质量控制及定量分析，同时对含没食子酸和鞣花酸的其它药材分析具有重要参考价值。
附图说明
图1为本发明中没食子酸和鞣花酸对照品的紫外光谱图，其中A代表没食子酸，B代表鞣花酸。
图2没食子酸和鞣花酸混合对照品色谱图，其中1代表没食子酸，2代表鞣花酸。
图3为桃金娘根样品色谱图，其中1代表没食子酸，2代表鞣花酸。
图4为本发明中没食子酸和鞣花酸混合对照品中没食子酸和鞣花酸的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方法和附图对本发明的技术方案做进一步说明。
以下所述3个实施例所采用的桃金娘根药材分别为玉林1号、2号和3号，产地广西玉林，经广西植物研究所温放副研究员鉴定为桃金娘根Radix Rhodomyrti。
实施例1
(1)标准溶液的配置：分别精密称取没食子酸对照品和鞣花酸对照品适量置100mL棕色容量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含没食子酸68.60μg/mL、鞣花酸50.37μg/mL的混合对照品溶液。
(2)样品前处理：玉林1号桃金娘根药材打粉，过60目筛，准确称取0.2g细粉，至于100ml具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇超声(350W，53kHz，30℃)提取40min，过滤，蒸干，二甲基亚砜溶解并定容至25ml容量瓶中，过0.2μm滤膜后供含量测试用。
(3)色谱条件：色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.2％磷酸；梯度洗脱条件：0～2min，6％乙腈；2～3min，6％～16％乙腈；3～8min，16％～20％乙腈；检测波长：0～2min，271nm，2～8min时253nm；流速：0.25ml/min；柱温：35℃；进样体积1μL。
(4)方法线性范围、精密度和检出限：在步骤(3)色谱条件下，分别精密吸取不同浓度的没食子酸和鞣花酸的混合对照品溶液注入液相色谱仪，以色谱峰峰面积(y)为纵坐标，以浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。当没食子酸浓度在0.686～68.60μg/mL，鞣花酸浓度在0.504～50.37μg/mL范围时，没食子酸回归方程为y＝12368x+3568.2，r＝0.9999；鞣花酸回归方程为y＝38157x+8631.1，r＝0.9999。
表1 没食子酸和鞣花酸的线性方程和相关系数
对没食子酸和鞣花酸混合对照品溶液进行11次平行测定，没食子酸和鞣花酸峰面积的RSD分别为1.1％和1.9％，迁移时间RSD为0.9％和1.3％。根据IUPAC规定，本法检出限(3σ,n＝11)没食子酸为0.45ng/mL，鞣花酸为0.23ng/mL。
(5)稳定性试验：精密称取玉林1号桃金娘根样品粉末，按步骤(2)样品前处理方法处理制备供试品，分别在制备后0、1、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积。计算没食子酸和鞣花酸峰面积的相对标准偏差，分别为2.1％、1.8％，结果小于3％，说明样品在24h内稳定。
(6)回收率试验：精密称取玉林1号桃金娘根粉末样品9份，按步骤(2)样品前处理制备供试品方法制备供试品，分别向每一份添加步骤(1)制备的一定浓度没食子酸和鞣花酸混合标准溶液，每个浓度制备三份平行样品，并进样分析，计算回收率和相对标准偏差。结果见表2。
表2 玉林1号桃金娘根没食子酸和鞣花酸测定的回收率(n＝3)
(7)样品分析检测：超高效液相色谱检测得玉林1号桃金娘根中没食子酸和鞣花酸含量结果见表5。
表5 桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的测定(n＝3)
实施例2
(1)标准溶液的配置同实施例1。
(2)样品前处理：玉林2号桃金娘根药材打粉，过60目筛，准确称取0.2g细粉，至于100ml具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇超声(350W，53kHz，30℃)提取40min，过滤，蒸干，二甲基亚砜溶解并定容至25ml容量瓶中，过0.2μm滤膜后供含量测试用。
(3)色谱条件同实施例1。
(4)方法线性范围、精密度和检出限同实施例1。
(5)稳定性试验：精密称取玉林2号桃金娘根样品粉末，按步骤(2)样品前处理方法处理制备供试品，分别在制备后0、1、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积。计算没食子酸和鞣花酸峰面积的相对标准偏差，分别为1.4％、2.3％，结果小于3％，说明样品在24h内稳定。
(6)回收率试验：精密称取玉林2号桃金娘根粉末样品9份，按步骤(2)样品前处理制备供试品方法制备供试品，分别向每一份添加步骤(1)制备的一定浓度没食子酸和鞣花酸混合标准溶液，每个浓度制备三份平行样品，并进样分析，计算回收率和相对标准偏差。结果见表3。
表3 玉林2号桃金娘根没食子酸和鞣花酸测定的回收率(n＝3)
(7)样品分析检测：超高效液相色谱检测得没食子酸和鞣花酸含量见表5。
实施例3
(1)标准溶液的配置同实施例1。
(2)样品前处理：玉林3号桃金娘根药材打粉，过60目筛，准确称取0.2g细粉，至于100ml具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇超声(350W，53kHz，30℃)提取40min，过滤，蒸干，二甲基亚砜溶解并定容至25ml容量瓶中，过0.2μm滤膜后供含量测试用。
(3)色谱条件同实施例1。
(4)方法线性范围、精密度和检出限同实施例1。
(5)稳定性试验：精密称取玉林3号桃金娘根样品粉末，按步骤(2)样品前处理方法处理制备供试品，分别在制备后0、1、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积。计算没食子酸和鞣花酸峰面积的相对标准偏差，分别为2.2％、2.1％，结果小于3％，说明样品在24h内稳定。
(6)回收率试验：精密称取玉林3号桃金娘根粉末样品9份，按步骤(2)样品前处理制备供试品方法制备供试品，分别向每一份添加步骤(1)制备的一定浓度没食子酸和鞣花酸混合标准溶液，每个浓度制备三份平行样品，并进样分析，计算回收率和相对标准偏差。结果见表4。
表4 玉林3号桃金娘根没食子酸和鞣花酸测定的回收率(n＝3)
(7)样品分析检测：超高效液相色谱检测得没食子酸和鞣花酸含量见表5。
Claims (4)
1.一种超高效液相色谱同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)桃金娘根药材鉴定；
(2)标准溶液的配置：分别精密称取没食子酸对照品和鞣花酸对照品置于100mL棕色容量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含没食子酸10.00～150.0μg/mL和鞣花酸10.00～150.0μg/mL的混合对照品溶液；临用时，分别用二甲基亚砜依次稀释上述标准溶液，配制成不同浓度的标准工作液；
(3)样品前处理：将桃金娘根打粉，过筛，得到待检测的桃金娘根药材样品粉末，置干燥器中储存；准确称取0.1～1.0g桃金娘根粉末置于100ml具塞锥形瓶中，精密加入10～150mL甲醇，称定重量，按照50～1500W、25～100kHz和25～60℃的条件进行超声提取10～90min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，蒸干，二甲基亚砜溶解并定容至25ml容量瓶中，过0.19～0.45μm滤膜后供含量测试用；
(4)以步骤(2)所得的标准工作液为对照，将步骤(3)所得样品进行超高效液相色谱检测分析，色谱条件如下：
色谱柱：Waters BEH C18色谱柱；流动相：乙腈-0.2％磷酸；梯度洗脱条件：第0～2min使用6％乙腈；第2～3min使用6％～16％乙腈；第3～8min使用16％～20％乙腈；检测波长：第0～2min，检测波长为215～300nm；第2～8min，检测波长为220～385nm；流速：0.1～0.5ml/min；柱温：20～45℃；进样体积0.3～10μL。
2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法，其特征在于，还包括以下验证步骤：
方法线性范围、精密度和检出限计算：在步骤(4)所述的色谱条件下，分别精密吸取不同浓度的没食子酸和鞣花酸的混合对照品溶液注入液相色谱仪，以色谱峰峰面积(y)为纵坐标，以浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线；对没食子酸和鞣花酸混合对照品溶液进行3～17次平行测定，计算没食子酸和鞣花酸峰面积和迁移时间的RSD，验证方法精密度；根据IUPAC规定，计算检出限。
3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法，其特征在于，还包括以下验证步骤：
稳定性试验：精密称取样品粉末，按步骤(3)样品前处理方法处理制备供试品，分别在制备后0、1、2、4、8、12和24h进样，测定峰面积；计算没食子酸和鞣花酸峰面积的相对标准偏差，验证样品在24h内是否稳定。
4.根据权利要求1所述的超高效液相色谱同时检测桃金娘根中没食子酸和鞣花酸的方法，其特征在于，还包括以下验证步骤：
回收率试验：精密称取桃金娘根粉末样品9份，按步骤(3)样品前处理制备供试品方法制备供试品，分别向每一份供试品添加步骤(2)制备的含没食子酸和鞣花酸混合标准溶液，每个混合标准溶液浓度制备三份平行样品，并进样分析，计算回收率和相对标准偏差。
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Application publication date: 20150311 Assignee: Guangxi Boshu Agricultural Development Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI VETERINARY Research Institute Contract record no.: X2023980044852 Denomination of invention: A Method for Simultaneous Detection of Gallic Acid and Tannic Acid in Myrtle Root Granted publication date: 20160330 License type: Common License Record date: 20231031 |