CN101693076B - 金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法，其采用高效液相色谱法。本发明方法操作简便，结果准确，灵敏度高，重现性好，回收率好，干扰小，且阴性对照溶液对测定无干扰，可以作为控制金莲清热颗粒内在质量的有效方法。

Description

金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法

技术领域

本发明涉及金莲清热颗粒的质量控制方法，具体地说是涉及金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法。

背景技术

金莲清热颗粒是以金莲花、大青叶为主药，通过加水煎煮，过滤，浓缩，干燥，加入适量的糊精和甜味剂后制成的颗粒剂，其中金莲花作为金莲清热颗粒的君药之一，具有清热解毒、抗菌消炎的功效，其主要成分为牡荆苷、荭草苷等。准确测定金莲清热颗粒中牡荆苷的含量，是有效控制金莲清热颗粒内在质量的有效手段之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便，结果准确，灵敏度高，重现性好，回收率好，干扰好，且阴性对照溶液对测定无干扰，可以作为控制金莲清热颗粒内在质量的有效方法的金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法。

本发明的技术方案为：

一种金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体步骤为：

(1)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％乙酸胺溶液15∶85为流动相，检测波长为340nm，理论板数按牡荆苷峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：精密称取牡荆苷对照品适量，加甲醇配制成每1ml含20μg的溶液；

(3)供试品溶液的制备：取金莲清热颗粒样品，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和正丁醇提取，提取液蒸干，用甲醇溶解转移至5ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)牡荆苷的含量测定方法：分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10μl，注入色谱仪测定，计算，得牡荆苷的含量；

上述超声处理是指在功率250W，频率33KHz条件下处理为60～90分钟；

上述供试品的取样量为0.3～0.5克，精密加入甲醇50ml；

所述用水饱和正丁醇提取四次，依次采用30ml、30ml、30ml和20ml分别提取，然后合并提取液；

所述微孔滤膜孔径为0.45μm。

本发明方法操作简便，结果准确，灵敏度高，重现性好，回收率好，干扰小，且阴性对照溶液对测定无干扰，可以作为控制金莲清热颗粒内在质量的有效方法。

本发明的方法同样可以作为金莲花中牡荆苷含量的测定方法。

附图说明

图1为甲醇HPLC图谱；

图2为金莲清热颗粒供试品HPLC图谱；

图3为金莲花对照药材HPLC图谱；

图4为缺金莲花阴性对照品HPLC图谱；

图5为牡荆苷对照品HPLC图谱；

图6为牡荆苷的标准曲线图；

图7不同色谱柱的试验结果，图中A-1、Appllo C₁₈(4.6×250mm)柱-对照品，A-2、Appllo C₁₈(4.6×250mm)柱-供试品，B-1、依利特SinoChromODS-BP柱-对照品，B-2、依利特SinoChrom ODS-BP柱-供试品C-1、Phenomenex C₁₈(4.6×200mm)柱-对照品C-2、Phenomenex C₁₈(4.6×200mm)柱-供试品。

具体实施方式

下面为本发明试验及测定过程

1、试验材料

1.1仪器：TU-1800紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；

P100/UV100高效液相色谱仪，美国热电集团TSP(THERMO SEPARATIONPRODUCTS)公司。色谱系统由SpectraSERIES P100色谱泵、SpectraSERIESUV100紫外检测器、7725i进样阀组成；

N2000双通道色谱数据采集器及N2000型色谱数据工作站，浙江大学智能信息工程研究所、浙江大学智达信息工程有限公司；

色谱柱：Apollo C₁₈，4.6×250mmmm，5μm，柱号607080600.1，美国奥泰(ALLTECH)公司；

KQ5200 B型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；

METTLER TOLEDO AG135电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2试剂：乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3对照品：牡荆苷Vitexin(供含量测定用)：由中国药品生物制品检定所提供。批号：111687-200501。

1.4供试品：金莲清热颗粒样品为宁夏启元国药有限公司生产，批号为：060418、060323、070911、070912、070926、080425、080426、080428、080603、081101。

2.供试品溶液、对照品溶液、金莲花药材溶液及阴性对照溶液的制备

2.1供试品溶液的制备方法取供试品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHz)60分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和正丁醇提取4次(30ml、30ml、30ml、20ml)，合并提取液，蒸干，用甲醇溶解转移至5ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2对照品溶液的制备：取牡荆苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液。

2.3金莲花药材溶液：取金莲花粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，同供试品溶液制备方法制成金莲花药材溶液。试验中实际称取批号为H071115的金莲花药材0.2078g。

2.4阴性对照溶液的制备：缺金莲花阴性对照为宁夏启元国药有限公司按金莲清热颗粒处方、工艺去掉金莲花制备，依供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

3.含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI D)测定。

4.方法学验证

4.1准确度采用加样回收，精密称取已知含量同一批号(批号：080603，含量：0.6114mg/g)的供试品6份，每份取样量为供试品溶液制备取样量(0.5g)的50％(即0.25g)，依照与当前取样含量约1∶1的比例，分别精密加入0.65ml的回收率试验用牡荆苷对照品储备液(浓度为0.212mg/ml)，按本发明方法制备供试品溶液并依法测定，计算牡荆苷的回收率，结果平均回收率为102.13％，RSD为1.62％。结果见表1

表1金莲清热颗粒准确度试验结果

结果表明：本方法具有良好的准确度。

4.2精密度

4.2.1重复性取同一批金莲清热颗粒供试品(批号080603)6份，按含量测定方法测定。结果相对标准偏差为1.07％，重复性良好。结果见表2

表2重复性考察结果

试验结果表明，该方法重复性良好

4.2.2中间精密度取同一批供试品(批号080603)6份，分别由三人，在不同的时间，用同一高效液相色谱仪，按含量测定方法测定。结果中间精密度良好(见表3)。

表3中间精密度试验结果

试验结果表明，中间精密度良好。

4.3专属性分别精密吸取甲醇、供试品溶液(批号080603)、金莲花药材溶液、缺金莲花阴性对照品溶液及浓度为0.0212mg/ml的对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下，记录色谱图，结果阴性对照溶液在与牡荆苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，阴性对照溶液对试验无干扰。见图1甲醇HPLC图谱、图2金莲清热颗粒供试品HPLC图谱、图3金莲花对照药材HPLC图谱、图4缺金莲花阴性对照品HPLC图谱、图5牡荆苷对照品HPLC图谱，图中保留时间为21.0min-25.0min间，吸收峰为牡荆苷峰。

4.4线性关系的考察：分别精密量取牡荆苷对照品溶液(浓度为0.2120mg/ml)0.2ml、0.6ml、1.0ml、1.8ml、2.6ml、3.4ml于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度依次为0.00424mg/ml、0.01270mg/ml、0.02120mg/ml、0.03816mg/ml、0.05512mg/ml、0.07208mg/ml的对照品溶液。依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，结果见表4。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线(见图6)，计算回归方程。回归方程为Y＝2739821.56X-8031.64，γ＝0.9998。

表4牡荆苷进样量与峰面积A的关系

结果表明：牡荆苷在0.0424～0.7208μg范围内有良好的线性关系。

4.5范围

测定范围：最低限度标准为每1g含金莲花以牡荆苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计，不得少于0.32mg，故按限度的70％和300％(即0.22～0.96mg/g)考察高低限度浓度范围的准确度。

范围准确度：取同一批已知含量(批号080603，含量0.6064mg/g)的供试品12份，按范围限度的50％取样，其中：低限取6份，每份取样量约为含牡荆苷为含量限度低限的70％(0.22mg/g)的供试品量50％(即0.18g)；高限取6份，每份取样量约为含牡荆苷为含量限度低限的300％(0.96mg/g)的供试品量50％(即0.79g)。依照与当前取样含量约1∶1的比例，分别精密加入牡荆苷对照品溶液(浓度为0.2120mg/ml)，低限0.53ml，高限2.26ml，按含量测定方法测定，计算回收率，结果低限平均回收率为98.56％，RSD＝0.99％；高限平均回收率为98.88％，RSD＝1.13％。结果见表5。

范围高低限供试品取样量计算：

表5范围准确度试验结果

根据线性、精密度和准确度的试验结果，本方法适合检测牡荆苷含量在0.2185mg/g～0.961mg/g的供试品(或牡荆苷浓度在10.925～48.05μg/ml的供试品溶液)。

4.6耐用性

4.6.1样品溶液稳定性试验：按上述含量测定项下方法，取本品(批号080603)制成供试品溶液，每间隔一定时间进样10μl，依法测定，相对标准偏差为1.69％，结果见表6。

表6稳定性试验测定结果。

结果表明：供试品溶液在48小时内测定基本稳定。

4.6.2不同色谱柱的比较：精密称取批号为080603的金莲清热颗粒样品2份，依上述色谱条件及本发明含量测定方法，分别用A、Appllo C₁₈(4.6×250mm，5μm，柱号：607080600.1，美国奥泰ALLTECH公司)、B、依利特SinoChrom ODS-BP(4.6×250mm，5μm，柱号：E1819610，大连依利特分析仪器有限公司)、C、Phenomenex C₁₈(4.6×200mm，5μm，柱号：SN339622-22，美国菲罗门Phenomenex公司)三种品牌的色谱柱测定，在同一台液相色谱仪上，由同一人操作，进行含量测定，计算样品含量，结果见表7，图7。

表7不同色谱柱的测定结果

结果：不同品牌的色谱柱对测定无明显影响。

5.样品的含量测定：十批金莲清热颗粒样品中牡荆苷含量测定结果见表8

计算公式：

表8十批金莲清热颗粒牡荆苷含量

6.金莲花药材的含量测定方法及其方法学验证

6.2方法学验证：

6.2.1准确度试验：取已知含量的金莲花药材(批号：H071115，含量：1.6916mg/g)的细粉(过三号筛)6份，精密称取一定量，每份取样量约为供试品溶液制备取样量(0.4g)的50％(即0.2g)，依照与当前取样含量约1∶1的比例，分别精密加1.8ml的牡荆苷对照品储备液(浓度为0.1940mg/ml)，依法测定，计算加样回收率为100.81％，RSD＝1.47％。结果见表9。

表9金莲清热颗粒中原药材金莲花准确度试验结果

结果表明：本方法具有良好的准确度。

6.2.2金莲花药材中牡荆苷的含量测定：十批金莲花药材中牡荆苷含量测定结果见表10。

计算公式：

表10十批金莲花药材牡荆苷含量

6.2.3金莲花药材含量限度的制定：由表9可知，10批金莲花的平均含量为0.1452％，将此值下浮25％后为0.1089％，10批样品中含量最低为0.0971％，因此规定金莲花药材中牡荆苷的含量限度为“本品按干燥品计算，含牡荆苷(C₂₁H₂₀O₁₀)不得少于0.10％。”

7、金莲清热颗粒含量限度的制定根据五批金莲清热颗粒(批号为070926、070911、070912、070913、060323)成品及相应的金莲花药材的牡荆苷的含量测定结果，计算转移率。

计算公式：

C_样：样品中牡荆苷含量，单位为mg/g。

C_原：金莲花药材中牡荆苷百分含量。

0.6：为常量，系指每g金莲清热颗粒相当于含金莲花药材0.6g。

结果见表11

表11生产五批金莲清热颗粒所用原料金莲花中牡荆苷的转移率

根据本制剂的处方量折算，每1g金莲清热颗粒相当于含金莲花原生药0.6g。由表10可知，五批金莲清热颗粒生产过程中金莲花中牡荆苷的平均转移率为62.97％，即约为60％。据此，将0.10％(金莲花药材牡荆苷含量最低限)×0.6g(每1g金莲清热颗粒所含金莲花原生药的量)×60％(转移率低限)，每1g金莲清热颗粒应含牡荆苷0.36mg，根据生产中的实际情况，下浮10％作为含量限度的下限。因此确定金莲清热颗粒的含量限度为：每1g药品中含金莲花以牡荆苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计，应不少于0.32mg。

Claims (3)

1.一种金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体步骤为：

（1）色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4%乙酸胺溶液15:85为流动相，检测波长为340nm，理论板数按牡荆苷峰计算应不低于3000；

（2）对照品溶液的制备：精密称取牡荆苷对照品适量，加甲醇配制成每1ml含20μg的溶液；

（3）供试品溶液的制备：取金莲清热颗粒样品0.3～0.5克，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率33KHz条件下超声处理60～90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和正丁醇提取，提取液蒸干，用甲醇溶解转移至5ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

（4）牡荆苷的含量测定方法：分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10μl，注入色谱仪测定，计算，得牡荆苷的含量。

2.按照权利要求1所述的金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法，其特征是：所述用水饱和正丁醇提取四次，依次采用30ml、30ml、30ml和20ml分别提取，然后合并提取液。

3.按照权利要求1所述的金莲清热颗粒中牡荆苷的含量测定方法，其特征是：所述微孔滤膜孔径为0.45μm。

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