CN103852526B - 一种纤花线纹香茶菜的有效成分检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法,该检测方法包括采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量,其中,所述高效液相色谱法的条件包括:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱;流动相:流动相A为甲醇,流动相B为0.1%(体积)的磷酸水溶液,进行梯度洗脱;所述梯度洗脱程序如下,其中流动相的比例均为体积百分比:0~30min,流动相A为30%,流动相B为70%;30~70min,流动相A为30%→50%,流动相B为70%→50%。该检测方法通过高效液相色谱法成功地实现了对纤花线纹香茶菜中黄酮类和迷迭香酸有效成分含量的同时测定,能够用来表征纤花线纹香茶菜的药材质量。<!--1-->
Description
技术领域
本发明属于中药材检测领域,具体涉及一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法。
背景技术
纤花线纹香茶菜属唇形科香茶菜属植物(Isodonlophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)Haravar.graciliflora(Benth.)H.Hara),为中药溪黄草的来源之一,其具有清热利湿、退黄祛湿、凉血散瘀的功效,可以用于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎等病症,是我国南方地区治疗乙型肝炎的常用草药。目前,纤花线纹香茶菜虽然使用广泛,但是查阅大量资料发现,《中国药典》历版均未收载。《广东省中药材标准》2011版和《广西省中药材标准》收载的纤花线纹香茶菜质量鉴别主要是通过考察其性状和薄层色谱法鉴别,单一依靠性状和薄层鉴别难以确定纤花线纹香茶菜中有效成分的含量,辨别其质量优劣,但目前尚未发现有关纤花线纹香茶菜有效成分的文献报道。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的是提供一种纤花线纹香茶菜的有效成分检测方法,该检测方法是通过高效液相色谱法成功地实现了对纤花线纹香茶菜中黄酮类和迷迭香酸有效成分含量的同时测定,能够用来表征纤花线纹香茶菜的药材质量。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法,该检测方法包括采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量,其中,所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱;
流动相:流动相A为甲醇,流动相B为0.1%(体积)的磷酸水溶液,进行梯度洗脱;
所述梯度洗脱程序如下,其中流动相的比例均为体积百分比:
0~30min,流动相A为30%,流动相B为70%;
30~70min,流动相A为30%→50%,流动相B为70%→50%。
优选地,所述高效液相色谱法的条件还包括:
流动相流速:0.5~1.5ml/min;优选为1ml/min;
色谱柱柱温:15~40℃;优选为15~35℃;
紫外检测波长:200~400nm;优选为270nm。
优选地,在上述检测方法中,上述高效液相色谱法的供试品溶液按照以下步骤来制备:
取纤花线纹香茶菜1g,置于100ml锥形瓶,加入提取溶剂25ml,超声提取30min,冷却,定容,过滤,取续滤液过0.22μm的微孔滤膜即得;
优选地,所述提取溶剂选自70%(体积)甲醇水溶液、50%(体积)甲醇水溶液或无水甲醇。
优选地,在上述检测方法中,上述高效液相色谱法的对照品溶液按照以下步骤来制备:
取异夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70%(体积)甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70%(体积)甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取迷迭香酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70%(体积)甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
具体而言,上述纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法包括以下步骤:
1)制备供试品溶液:
取纤花线纹香茶菜1g,置于100ml锥形瓶,加入提取溶剂25ml,超声提取30min,冷却,定容,过滤,取续滤液过0.22μm的微孔滤膜即得;
优选地,所述提取溶剂选自70%(体积)甲醇水溶液、50%(体积)甲醇水溶液或无水甲醇。
2)制备对照品溶液:
取异夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70%(体积)甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70%(体积)甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取迷迭香酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70%(体积)甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
3)采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中黄酮类化合物和迷迭香酸的含量:
精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪进行测定,所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱;
流动相:流动相A为甲醇,流动相B为0.1%(体积)的磷酸水溶液,进行梯度洗脱;
所述梯度洗脱程序按如下,其中流动相的比例均为体积百分比:
0~30min,流动相A为30%,流动相B为70%;
30~70min,流动相A为30%→50%,流动相B为70%→50%。
流动相流速:0.5~1.5ml/min;优选为1ml/min;
色谱柱柱温:15~40℃;优选为15~35℃;
紫外检测波长:200~400nm;优选为270nm。
本发明经过大量实验研究,将黄酮类成分(即异夏佛塔苷和夏佛塔苷)和迷迭香酸确定为纤花线纹香茶菜中有效成分的检测指标,其中黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒和护肝等作用,迷迭香酸有很强的抗氧化、抗炎作用。本发明进而建立了一种有效检测纤花线纹香茶菜中黄酮类成分和迷迭香酸的含量高效液相色谱法,该方法简单、准确,可以根据有效成分含量的测定结果反映出纤花线纹香茶菜药材的功效。
与现有技术相比,本发明提供的纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法具有以下积极效果:
(1)本发明将其含量测定的指标选定为稳定可控的黄酮类成分和迷迭香酸,而黄酮类成分和迷迭香酸为纤花线纹香茶菜中有代表性的主要成分,其含量高、性质稳定,作为标示性成分控制纤花线纹香茶菜质量具有较好的专属性和质量相关性;
(2)相对于紫外分光光度法、薄层扫描法等而言,本发明的高效液相色谱法具有分辨率高、灵敏性高、重现性好、选择性好,结果误差小等优点;
(3)本发明的检测方法对样品的预处理快速,方便、易操作;
(4)本发明的检测方法实现了对纤花线纹香茶菜中黄酮类和迷迭香酸的定性、定量分析,填补了纤花线纹香茶菜的有效成分分析方面的研究空白;
(5)不同的色谱条件、不同的处理方法对于药材有效成分的检测结果会有很大影响,本发明经筛选优选获得的高效液相色谱法检测条件和步骤可以准确、简便地测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为异夏佛塔苷对照品HPLC色谱图;
图2为夏佛塔苷和迷迭香酸对照品HPLC色谱图;
图3为实施例3第(1)项所示梯度洗脱条件下的供试品HPLC色谱图;
图4为实施例3第(2)项所示梯度洗脱条件下的供试品HPLC色谱图;
图5为实施例3第(3)项所示梯度洗脱条件下的供试品HPLC色谱图;
图6为等度洗脱供试品HPLC色谱图;
图7为异夏佛塔苷对照品标准曲线;
图8为夏佛塔苷对照品标准曲线;
图9为迷迭香酸对照品标准曲线。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等,如无特殊说明,均为市售购买产品。
以下各实施例中所使用的对照品来源如下:
异夏佛塔苷、夏佛塔苷、迷迭香酸均购自成都曼斯特生物科技有限公司,纯度≥98%;
其它仪器及试剂:
采用Waters2695-2996高效液相色谱系统,包括:Empower工作站(Waters公司),DikmaC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,电子天平。
纤花线纹香茶菜全草来自广州白云山和记黄埔中药有限公司种植基地;
乙腈为色谱纯,甲醇为分析纯,磷酸为分析纯,水为蒸馏水。
实施例1
采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中的异夏佛塔苷、夏佛塔苷、迷迭香酸含量:
1)制备对照品溶液:
精密称取异夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入少量70%(体积)甲醇水溶液溶解,定容至刻度,摇匀,配置成浓度为0.15mg/ml的异夏佛塔苷对照品溶液,并于4℃冰箱存放备用。
同法制得夏佛塔苷和迷迭香酸对照品溶液。
2)制备供试品溶液:
取纤花线纹香茶菜药材1g,精密称定,置于100ml锥形瓶,精密加入70%(体积)甲醇水溶液25ml,称定重量,超声提取30min,冷却后,加70%(体积)甲醇水溶液补足重量,过滤,取续滤液过0.22μm的微孔滤膜,并于4℃冰箱存放备用。
3)测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪进行测定,见图1、图2、图5;
所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱;
流动相:流动相A为甲醇,流动相B为0.1%(体积)的磷酸水溶液,进行梯度洗脱;
梯度洗脱程序按如下,其中流动相比例均为体积百分比:
0~30min,流动相A为30%,流动相B为70%;
30~70min,流动相A为30%→50%,流动相B为70%→50%。
流动相流速:1ml/min;
流动相柱温:15~35℃
紫外测定波长:270nm。
实施例2
本发明纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法的方法学考察:
(1)线性关系
采用和实施例1相同的操作步骤和条件,分别精密量取异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸对照品溶液适量,进样分析,以进样量对色谱峰面积积分值进行线性回归处理,得异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的回归直线方程、相关系数及线性范围,见表1,结果表明三者在相应的范围内,具有良好的线性关系,见图7、图8、图9。
表1:线性考察实验结果
(2)精密度实验
采用和实施例1相同的操作步骤和条件,精密量取同一对照品溶液,于同一天内连续进样5次,每次10μL,分别测定异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的峰面积,得出日内精密度见表2,结果表明精密度好。
表2:精密度实验结果
(3)稳定性实验
采用和实施例1相同的操作步骤和条件,取同一供试品溶液,分别于配制后的0,2,4,8,16,24h进样分析,每次10μL,分别测定异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的峰面积积分值,见表3,表明供试品溶液在24小时内稳定。
表3:稳定性实验结果
(4)重复性试验
精密称取纤花线纹香茶菜药材粉末(过四号筛)约1g,共6份,采用和实施例1相同的操作步骤和条件,制备样品,分别测定异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的平均含量(mg/g)和RSD,见表4,结果表明,本法重现性良好。
表4:重复性实验结果
(5)加样回收率
分别取已知含量的样品6份,每份约0.5g,精密称定,分别准确加入一定量的异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸,采用和实施例1相同的操作步骤和条件,制备供试品溶液,按实施例1的测定方法,分别测定异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的平均回收率和RSD,见表5,结果表明,本法回收率良好。
表5:加样回收率实验结果
实施例3
梯度洗脱条件的选择和优化:
(1)梯度洗脱条件为:0~30min,流动相A为25%,流动相B为75%;
30~70min,流动相A为25%→40%,流动相B为75%→60%。见图3。
(2)梯度洗脱条件为:0~70min,流动相A为40%,流动相B为60%。见图4。
从图3和图4可以看出,上述梯度洗脱条件(1)和(2)都无法将目标峰较好分离开来
(3)梯度洗脱条件为:0~30min,流动相A为30%,流动相B为70%;
30~70min,流动相A为30%→50%,流动相B为70%→50%。见图5。
从图5可以看出,目标峰能较好的分开来,因此选择此洗脱条件。
实施例4
采用本发明的检测方法对药材样品含量进行测定。
取10批纤花线纹香茶菜药材,采用和实施例1相同的操作和条件,制备供试品溶液,按实施例1的测定方法,测得药材中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量,见表6。
表6:测定10批样品中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸含量的实验结果
总之,以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (8)
1.一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法,该检测方法包括采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量,其中,所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱;
流动相:流动相A为甲醇,流动相B为0.1体积%的磷酸水溶液,进行梯度洗脱;
所述梯度洗脱程序如下,其中流动相的比例均为体积百分比:
0~30min,流动相A为30%,流动相B为70%;
30~70min,流动相A为30%→50%,流动相B为70%→50%;
所述高效液相色谱法的条件还包括:
流动相流速:0.5~1.5ml/min;
色谱柱柱温:15~40℃;
紫外检测波长:200~400nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述流动相流速为1ml/min;所述色谱柱柱温为15~35℃;
所述紫外检测波长为270nm。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱法的供试品溶液按照以下步骤来制备:
取纤花线纹香茶菜1g,置于100ml锥形瓶,加入提取溶剂25ml,超声提取30min,冷却,定容,过滤,取续滤液过0.22μm的微孔滤膜即得。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述提取溶剂选自70体积%甲醇水溶液、50体积%甲醇水溶液或无水甲醇。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱法的对照品溶液按照以下步骤来制备:
取异夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70体积%甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70体积%甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取迷迭香酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70体积%甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,所述纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法包括以下步骤:
1)制备供试品溶液:
取纤花线纹香茶菜1g,置于100ml锥形瓶,加入提取溶剂25ml,超声提取30min,冷却,定容,过滤,取续滤液过0.22μm的微孔滤膜即得;
2)制备对照品溶液:
取异夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70体积%甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取夏佛塔苷对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70体积%甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
取迷迭香酸对照品10mg,置于100ml容量瓶中,加入70体积%甲醇水溶液溶解,定容,制成浓度为0.15mg/ml的溶液,作为对照品溶液;
3)采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中黄酮类化合物和迷迭香酸的含量:
精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪进行测定,所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱;
流动相:流动相A为甲醇,流动相B为0.1体积%的磷酸水溶液,进行梯度洗脱;
所述梯度洗脱程序按如下,其中流动相的比例均为体积百分比:
0~30min,流动相A为30%,流动相B为70%;
30~70min,流动相A为30%→50%,流动相B为70%→50%;
流动相流速:0.5~1.5ml/min;
色谱柱柱温:15~40℃;紫外检测波长:200~400nm。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述步骤1)中所述提取溶剂选自70体积%甲醇水溶液、50体积%甲醇水溶液或无水甲醇。
8.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述步骤3)中所述流动相流速为1ml/min;所述色谱柱柱温为15~35℃;所述紫外检测波长为270nm。
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