CN105044268B - 复方石淋通制剂的多指标成分同时测定方法及指纹图谱构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复方石淋通制剂的多指标成分同时测定方法：将复方石淋通制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1%的甲酸水溶液，采用梯度洗脱，检测波长为335nm。本发明还公开了复方石淋通制剂指纹图谱的构建方法：采用指纹的测定方法进行检测，再经计算机模拟，即可得复方石淋通指纹图谱。本发明的测定方法操作简便、专属性强、且具有优异的稳定性、精密度、重现性和加样回收率，可较全面的检测复方石淋通中有效成分，从而获得科学合理的复方石淋通指纹图谱，完整、准确的评价复方石淋通的有效性、安全性、稳定性和质量均一性。

Description

复方石淋通制剂的多指标成分同时测定方法及指纹图谱构建 方法

技术领域

本发明一种复方石淋通制剂的多指标成分同时测定方法，以及复方石淋通制剂指纹图谱的构建方法。

背景技术

复方石淋通中药方包括广金钱草、石韦、海金沙、滑石粉、忍冬藤五味药材。该方具有清热利湿，通淋排石功效，可用于膀胱湿热，石淋涩痛，尿路结石，泌尿系感染属肝胆膀胱湿热者。此外，还有文献报道其对泌尿系统感染常见的细菌具有不同程度的抑制作用；能明显防治乙二醇、氯化铵诱发的肾结石形成，有明显的利尿作用及抗炎作用；并有显著的镇痛作用。

现有技术中，根据复方石淋通中药方，已制得多种剂型复方石淋通制剂。通常的制备工艺一般为：分别将四味药材（除滑石粉外）进行水提醇沉，采用真空干燥，将干膏合并混匀，并加入处方量的滑石粉和适量的辅料，即制备成片剂、颗粒剂、胶囊剂等多种剂型。

例如，复方石淋通胶囊采用中药广金钱草1500g、石韦500g、海金沙500g、滑石粉25g、忍冬藤500g，分别将四味药材（除滑石粉外）进行水提醇沉，采用真空干燥，将干膏合并混匀，并加入处方量的滑石粉和适量的辅料，混匀，95%乙醇制颗粒，干燥，装入胶囊，即得。

复方石淋通包括广金钱草、石韦、海金沙和忍冬藤，所含成分复杂多样。据文献报道，广金钱草主要成分包括黄酮类、酚酸类、生物碱类、挥发性成分和多糖等，石韦主要成分包括三萜类、黄酮类、呫酮类、挥发油和甾体等，海金沙药用部位包括全草、成熟孢子、根及根茎，目前2010版药典只收载了海金沙干燥成熟孢子为药材。海金沙全草、根及根茎中的化学成分主要包括挥发油、黄酮类、酚酸类等，对于海金沙孢子中与其功能主治相关的有效成分还不是很清楚，忍冬藤主要成分包括酚酸类、皂苷类、黄酮类、挥发油类等。

但复方石淋通胶囊现有的质量标准为国家食品药品监督管理局标准（YBZ04472009），该标准“鉴别”项采用TLC法对广金钱草进行鉴别：取复方石淋通胶囊内容物，用有机溶剂超声提取，萃取，合并乙酸乙酯层，蒸干，残渣复溶，作为供试品溶液；同法制备成对照药材溶液；供试品溶液和对照药材溶液点板于聚酰胺薄膜上，采用适宜展开剂展开，显色剂显色，进行药材鉴别。“含量测定”项采用高效液相色谱法测定指标性成分绿原酸：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.5%磷酸（11：89）为流动相；检测波长为326nm。用有机溶剂超声处理胶囊内容物，制备成供试品溶液；取绿原酸对照品制备成对照品溶液；采用外标法计算绿原酸含量。该标准未对其他有效成分进行定量检测，存在一定局限性，不能全面反映中药产品的质量水平。

指纹图谱技术是新发展的中药质量控制方法。指纹图谱能较全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，可对药物品质进行整体描述和评价。多指标成分同时测定联合指纹图谱技术是进一步发展的质量控制方法，既注重宏观特征，又监控多个有效成分的含量，可实现微观和宏观的有机结合，符合中医药整体、宏观、复杂的特点，可从整体上评价和控制中药制剂的质量，是中药现代化关键技术之一。

对于复方石淋通制剂，亟需建立检测方法，构建多指标成分同时测定方法联合指纹图谱技术，以更全面准确的监控复方石淋通制剂的质量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的复方石淋通制剂的质量检测方法所检测的有效成分单一，不能全面反应复方石淋通制剂质量的缺陷，而提供一种复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，以及复方石淋通制剂指纹图谱的构建方法。

本发明通过文献调研，确定了指纹图谱中与药效相关的主要指标成分，即绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷，进一步经实验摸索，最终建立了一种专属性强、操作简便，且稳定性、精密度、重现性和加样回收率均良好的检测方法，从而建立了科学合理的复方石淋通制剂的多指标成分指纹图谱。

本发明的技术方案如下：

复方石淋通制剂多指标成分同时测定包括如下步骤：将复方石淋通制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1%的甲酸水溶液，含量测定洗脱梯度如表1所示，检测波长为335nm；

表1

所述的复方石淋通中药方为现有中药方，其包括广金钱草、石韦、海金沙、忍冬藤四味药材，各药材重量配比一般为3∶1∶1∶1，所述的复方石淋通制剂可为现有的根据复方石淋通中药方制备的各种剂型的复方石淋通制剂，例如片剂（如中国专利CN103263460A公开的复方石淋通片）、胶囊剂或颗粒剂等。上述复方石淋通制剂可由下述方法制得：分别将四味药材（除滑石粉外）进行水提醇沉，采用真空干燥，将干膏合并混匀，并加入处方量的滑石粉和适量的辅料，按现有方法制成各剂型。

所述的复方石淋通制剂的供试品溶液可按常规的色谱供试溶液的预处理方法制备而得：对于固体制剂的复方石淋通制剂，可将溶有复方石淋通制剂的溶液经超声处理，冷却，补足减失的重量，取续滤液，用微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液。

所述的微孔滤膜的孔径可按常规条件选择，一般为0.22-0.8µm，优选0.45µm。各种类的微孔滤膜均适用本发明，如聚醚砜微孔滤膜。其中，所述的溶有复方石淋通制剂的溶液中的溶剂可为50%甲醇、甲醇、70%甲醇、30%甲醇、水溶液，优选50%甲醇。所述的溶剂的用量以使复方石淋通制剂的浓度适宜色谱检测为准。所述的超声处理的条件较佳的为160-250W，频率40kHz，超声20-60min。

所述的高效液相色谱法检测的进样量根据色谱检测领域常规知识选择，一般为2-50µL，以5-20µL为佳。

所述的色谱柱可为现有的各种型号和规格的十八烷基硅烷键合硅胶柱，如4.6mm×250mm、4.6mm×150mm等径长规格均可适用，最优选4.6mm×250mm。

特别优选Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）、Unitary-C₁₈柱（4.6mm×250mm）、Summit-C₁₈柱（4.6mm×250mm）或Diamonsil-C₁₈柱（4.6mm×250mm），最优选Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）。

当采用本发明特别优选的Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）时，最优选含量测定如表2所示的洗脱梯度；

表2

柱温对分离效果影响不大，可采用常规的色谱柱可以允许使用的温度范围，一般为15-50℃，较佳的为20-40℃。

流速对分离效果影响不大，可按本领域常规方法选择，一般为0.5-1.5 mL/min，较佳的为0.8-1.2 mL/min。

本发明的高效液相色谱法理论塔板数按绿原酸计算不低于3000。

复方石淋通制剂指纹图谱构建方法由如下步骤组成：将复方石淋通制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1%的甲酸水溶液，指纹洗脱梯度如表3所示，检测波长为335nm，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（国家药典委2004A 1.0版）模拟生成复方石淋通制剂指纹图谱；

表3

其中，所检测的复方石淋通制剂的样品份数为建立指纹图谱的最低所需要的样品份数以上，一般以10~30为宜，本发明以10批样品为例进行说明。

其中，所述的采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件模拟生成制剂指纹图谱按常规进行操作。

当采用本发明特别优选的Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）时，最优选指纹如表4所示的洗脱梯度；

表4

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的优点在于：1、本发明在明确了复方石淋通主要有效成分的基础上，提供了一种复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，以及复方石淋通制剂指纹图谱构建方法；2、本发明的测定方法专属性强、操作简便、且具有优异的稳定性、精密度、重现性和加样回收率，可较全面的检测复方石淋通制剂中多种主要有效成分，从而构建科学合理的复方石淋通指纹图谱，完整、准确的评价复方石淋通制剂的有效性、安全性、稳定性和质量均一性。

附图说明 图1为实施例2采用四种不同色谱柱运用指纹色谱条件测定复方石淋通胶囊供试品溶液所得色谱图，图中A为采用Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm），B为采用Summit-C₁₈柱（4.6mm×250mm），C为采用Diamonsil-C₁₈柱（4.6mm×250mm），D为采用Unitary-C₁₈柱（4.6mm×250mm）；

图2为实施例3中复方石淋通胶囊供试品溶液和标准品的色谱图，图中A为标准品，B为复方石淋通胶囊供试品溶液，其中7为绿原酸，12为夏佛塔苷，13为异夏佛塔苷；

图3为实施例5-1中采用不同梯度的乙腈-0.1%的甲酸水溶液（本发明流动相条件）进行HPLC分析的色谱图，图中A、B和C 分别为表5-1、5-2和5-3所示的洗脱梯度进行洗脱的色谱图；

图4为实施例5-2中采用不同梯度的乙腈-醋酸铵缓冲液（对比流动相条件）进行HPLC分析的色谱图，图中A、B和C分别为表6-1、6-2和6-3所示的洗脱梯度进行洗脱的色谱图；

图5为实施例7中第3节标准品（绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷）的定量限检测色谱图，A中，1为绿原酸，2为夏佛塔苷，B中，3为异夏佛塔苷；

图6为10批复方石淋通胶囊成品的色谱图；

图7为实施例8中复方石淋通胶囊指纹图谱。

具体实施方式 下面结合附图对本发明作进一步说明。

参考实施例 检测指标成分的确定

通过文献调研，复方石淋通包括广金钱草、石韦、海金沙和忍冬藤，所含成分复杂多样；广金钱草主要成分包括黄酮类、酚酸类、生物碱类、挥发性成分和多糖等，石韦主要成分包括三萜类、黄酮类、呫酮类、挥发油和甾体等，海金沙药用部位包括全草、成熟孢子、根及根茎，目前2010版药典只收载了海金沙干燥成熟孢子为药材，海金沙全草、根及根茎中的化学成分主要包括挥发油、黄酮类、酚酸类等，对于海金沙孢子中与其功能主治相关的有效成分还不是很清楚，忍冬藤主要成分包括酚酸类、皂苷类、黄酮类、挥发油类等；黄酮苷类化合物均具有预防实验性大鼠草酸钙结石形成的效果，尿石产生过程中发生多种氧化，导致自由基增多，自由基增多导致肾结石的形成，总黄酮能够有效清除羟自由基、超氧阴离子自由基，提示总黄酮可作为有效的自由基清除剂，这可能为其防止尿石症作用的机理之一，总黄酮及酚酸对动物急性炎症渗出与慢性炎症反应均具有非常显著的抑制作用；基于上述药理作用，本发明建立黄酮类、酚酸类成分的指纹图谱，对指纹特征峰进行归属，绿原酸来源于石韦和忍冬藤，属酚酸类化合物，夏佛塔苷和异夏佛塔苷来源于广金钱草，属黄酮类化合物；在指纹图谱评价基础上增加有效成分绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷的含量测定，能更准确的评价制剂的有效性和稳定性。

实施例1 检测波长的确定

1、材料和方法：

复方石淋通胶囊的供试品溶液：取复方石淋通胶囊内容物约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理0.5h（功率250W，频率40kHz），放冷，用50%甲醇补足失重，用微孔滤膜（0.45µm，聚醚砜，SCAA-101水相针式滤器）滤过，取续滤液，即为供试品溶液；

高效液相色谱法检测：精密吸取供试品的溶液10μL，注入高效液相色谱仪进行测定，色谱条件：色谱柱为Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm），柱温为30℃，流速为1mL·min^-1，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1%的甲酸水溶液，洗脱梯度如表4所示，检测波长为190～400 nm，记录70min内的色谱峰及其保留时间和峰面积。

2、实验结果

通过采用二极管阵列检测器对供试品溶液在190～400 nm的紫外区进行在线检测，发现所得的色谱峰中主要是广金钱草的黄酮类成分以及石韦、忍冬藤中的酚酸类成分。黄酮类成分在272nm、335nm，酚酸类成分在254nm、335nm 波长下有最大吸收，权衡各色谱峰在不同波长下出峰数目和分离情况，335nm 波长下各峰分离好，整体峰形优于其他波长，故选定335nm为检测波长。

实施例2 色谱柱的优化

1、材料和方法

复方石淋通制剂的供试品溶液同实施例1；

高效液相色谱法检测：色谱柱为Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）、Summit-C₁₈柱（4.6mm×250mm）、Unitary-C18柱（4.6mm×250mm）、Diamonsil-C18柱（4.6mm×250mm），检测波长为335nm，其他条件同实施例1。

2、实验结果

采用Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）所得色谱图如图1中A所示，采用Summit-C₁₈柱（4.6mm×250mm）所得色谱图如图1中B所示，Unitary-C18柱（4.6mm×250mm）所得色谱图如图1中C所示，Diamonsil-C18柱（4.6mm×250mm）所得色谱图如图1中D所示，进行对比，采用Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）柱进行色谱分离，洗脱出的色谱峰更加平稳（见图1），所以优选Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）。

实施例3 特征峰及参照峰的指认

1、材料和方法

复方石淋通制剂的供试品溶液同实施例1；

标准品的配制：取绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解配制制成每毫升含绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷386.6μg、349.2μg、182.4μg，即得绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷储备液；

高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取标准品与供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪进行测定，色谱柱为Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm），检测波长为335nm，其他条件同实施例1。

2、实验结果

复方石淋通胶囊的标准品和供试品溶液的色谱图分别如图2中A和图2中B所示，其中，7为绿原酸（保留时间：28.051min），12为夏佛塔苷（保留时间：51.562 min），13为异夏佛塔苷（保留时间：57.012 min）。

实施例4 检测时间

1、材料和方法

复方石淋通制剂的供试品溶液同实施例1；

高效液相含量测定色谱法检测方法：检测时间为30min，色谱条件为含量测定色谱条件（表3）其他条件同实施例3；

高效液相指纹测定色谱法检测方法：检测时间为70min，色谱条件为含量测定色谱条件（表4）其他条件同实施例3。

2、实验结果

含量测定方法记录60min色谱峰，30min后指认的特征峰出峰完全，但还有其他色谱峰出现，提示在含量测定的色谱条件下需要增加洗脱梯度，因此，选择30min 的检测时间较合适。指纹测定方法记录80min 色谱峰，70min 后没有峰，提示70min内复方石淋通各成分出峰完全。因此，选择70min的检测时间较合适。

实施例5 洗脱条件

5-1、不同梯度的本发明乙腈-0.1%的甲酸水溶液流动相条件

色谱柱为Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm）柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1%的甲酸水溶液，洗脱梯度如表5-1、5-2和5-3所示，柱温为30℃，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为335nm，色谱图如图3中A、B和C 所示；

表5-1

表5-2

表5-3

由上述实验可见，在本发明的洗脱条件下，流动相的比例在一定范围内变化时，对分离度的影响较小，各组分的相对出峰顺序较为一致，该条件具有一定的耐用性，所以确定乙腈和0.1%的甲酸系统更具方便性和实用性。

5-2、对比流动相条件

色谱柱为Boston-C₁₈柱（4.6mm×250mm），柱温为30℃，流速为1mL·min^-1，检测波长335nm。

对比流动相及洗脱梯度：以乙腈（流动相A）-醋酸铵缓冲液（流动相B）为流动相，醋酸铵缓冲液配制：醋酸铵3.4g+3ml冰醋酸+1000ml水。以表6-1、6-2和6-3所示的洗脱梯度进行洗脱，色谱图分别如图4中A、B和C所示；

表6-1

表6-2

表6-3

如图4中A、B和C所示，采用上述乙腈-醋酸铵缓冲液为流动相，色谱峰保留时间变化较大。以夏佛塔苷为例，当梯度洗脱条件变化时，其色谱峰保留时间变化较大，部分色谱峰会重叠。因此，采用该流动相建立的方法缺乏一定的耐用性，而且使用缓冲盐洗脱后，对仪器和色谱柱的养护要求较高。

实施例6 各种复方石淋通制剂的前处理方法

（1）复方石淋通片剂的前处理

取10片复方石淋通片剂，研钵研碎，称取0.5g置于100mL容量瓶，加25mL50%甲醇超声30min溶解，冷却后补加50%甲醇至刻度，摇匀，用0.22µm聚醚砜微孔滤膜过滤，续滤液即得供试品溶液。

（2）复方石淋通胶囊的前处理

取10粒复方石淋通胶囊内容物，研钵研碎，称取0.5g置于100mL容量瓶，加25mL50%甲醇超声30min溶解，冷却后补加50%甲醇至刻度，摇匀，用0.22µm聚醚砜微孔滤膜过滤，续滤液即得供试品溶液。

（3）复方石淋通颗粒的前处理

取10包复方石淋通颗粒，研钵研碎，称取0.5g置于100mL容量瓶，加25mL50%甲醇超声30min溶解，冷却后补加50%甲醇至刻度，摇匀，用0.22µm聚醚砜微孔滤膜过滤，续滤液即得供试品溶液。

实施例7 本发明复方石淋通制剂的检测方法的方法学考察

下述实验的高效液相色谱法条件同表3。

1、系统适应性试验

材料和方法同实施例3，该测定方法理论塔板数按绿原酸计算不低于3000。

2、标准曲线及线性范围

取绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解配制制成每毫升含绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷386.6μg、349.2μg 、182.4μg，即得绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷储备液。将各溶液分别按表7-1、7-2、7-3中浓度稀释，HPLC检测，进样量10μl，数据见表7-1、7-2、7-3，绘制标准曲线，见表8；

表7-1

表7-2

表7-3

表8

3、定量限（LOQ）和检测限（LOD）

标准品（绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷）进样浓度分别如表9所示时，信噪比S/N＝10或3，分别为上述各指标成分的定量限和检测限。各指标成分的定量限色谱图如图5中A和B所示；

表9

4、精密度考察

分别取高、中、低（绿原酸69.59、46.39、27.84μg/ml；夏佛塔苷62.86、41.90、25.14μg/ml；异夏佛塔苷32.83、21.89、13.13μg/ml）三种浓度的对照品溶液，同一天内每一浓度连续进样6次，测得绿原酸峰面积的RSD分别为0.20%、0.38%、0.61%；夏佛塔苷峰面积的RSD分别为0.30%、0.80%、0.73%；异夏佛塔苷峰面积的RSD分别为0.39%、0.53%、0.44%。结果表明日内精密度良好。分别连续3天测样，测得绿原酸峰面积的RSD分别为0.36%、1.13%、3.18%；夏佛塔苷峰面积的RSD分别为1.48%、1.46%、4.49%；异夏佛塔苷峰面积的RSD分别为1.53%、1.25%、4.11% ，结果表明日内精密度良好。结果如表10和表11所示；

表10 日内精密度测定结果（n=6）

表11 日间精密度测定结果（n=3）

5、样品稳定性取复方石淋通胶囊内容物（批号：35140311），精密称定1份，实施例1的方法制备供试品溶液，进行HPLC检测，分别在1、3、5、7、10、12、24h 进样。绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷峰面积的RSD分别为0.38%、0.56%、1.94%，结果表明供试品溶液在24h 内稳定，结果见表12；

表12 稳定性测定结果

6、重复性实验

取复方石淋通胶囊内容物（批号：35140311），精密称定6份，按实施例1的方法制备供试品溶液，进行HPLC检测，测定绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷的峰面积，计算其单位质量峰面积的RSD。绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷单位质量峰面积的RSD分别为0.74%、0.87%、2.96% ，结果表明方法重复性良好，结果见表13；

表13重复性测定结果

7、加样回收实验

精密称取绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量，加50%甲醇溶解，制成绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷浓度分别为521.6μg/ml、410.8μg/ml、202.2μg/ml的溶液。称取9份已知含量的复方石淋通胶囊内容物（批号：35131207）0.25g，精密称定，置锥形瓶中，再分别精密加入50%、100%、150% 3水平绿原酸、夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品溶液，按供试品方法制备样品，进行HPLC检测，计算加样回收率。绿原酸平均回收率为97.44%，RSD为1.42%；夏佛塔苷平均回收率为100.49%，RSD为2.56%；异夏佛塔苷101.93%，RSD为1.98% ，结果见表14-1、14-2、14-3；

加样回收率%=（测得量-供试品溶液所含指标成分的量）/ 实际加入量×100%

表14-1 绿原酸加样回收实验结果

表14-2 夏佛塔苷加样回收实验结果

表14-3 异夏佛塔苷加样回收实验结果

实施例8 石淋通制剂指纹图谱的构建

取复方石淋通胶囊成品10批，按实施例3的方法制备供试品溶液，并进行HPLC检测，色谱图如图6所示。图7为复方石淋通指纹图谱。

特征指纹峰的选择：根据10批复方石淋通成品的测定结果，以绿原酸标准品为参照峰，分别从13个特征指纹峰中鉴定了3个特征指纹峰，即绿原酸（7号）、夏佛塔苷（12号）、异夏佛塔苷苷（13号）。

指纹图谱检测标准的建立：采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件的操作规范（2004A 1.0版），采用均值法，将10批复方石淋通胶囊成品的实验数据导入，经选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动匹配，然后设定标准模板，进行色谱峰差异性评价和整体相似度评价。依据10批样品结果，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，生成复方石淋通指纹图谱（图7）。各样品色谱图与该指纹图谱相比较的相似度结果见表15。该指纹图谱中各特征峰的保留时间是以绿原酸为参照峰，其余各峰与之相比而得的相对保留时间，见表16；

根据以上试验结果，并结合中药指纹图谱研究技术要求，拟定符合下述标准的复方石淋通制剂为符合质量标准的制剂：供试品溶液色谱图中各色谱峰应与复方石淋通胶囊指纹图谱各特征峰一致，相似度不低于0.90。

表16 复方石淋通多指标指纹图谱中各特征峰的相对保留时间表（min）

Claims (9)

1.复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，多指标成分为以绿原酸为对照的酚酸类成分和夏佛塔苷、异夏佛塔苷为对照的黄酮类成分，其特征在于，由如下步骤组成：将复方石淋通制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1%的甲酸水溶液，多指标含量测定的洗脱梯度如下表所示

检测波长为335nm。

2.如权利要求1所述的复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于：所述的复方石淋通制剂的供试品溶液按下述方法制得：

将溶有复方石淋通制剂的溶液经超声处理，冷却，补足减失的重量，取续滤液，用微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液。

3.如权利要求1所述的复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的进样量为2~50µL。

4.如权利要求1所述的复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的柱温为15~50℃；所述的高效液相色谱法检测的流速为0.5~1.5 mL/min。

5.如权利要求3所述的复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的进样量为5~20µL。

6.如权利要求4所述的复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的柱温为20~40℃；所述的高效液相色谱法检测的流速为0.8~1.2mL/min。

7.如权利要求1所述的复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于：所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱为Boston-C₁₈柱。

8.如权利要求1所述的复方石淋通制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于：所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱的径长规格为4.6mm×250mm。

9.一种复方石淋通制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，由如下步骤组成：将复方石淋通制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1%的甲酸水溶液，指纹洗脱梯度如下表所示，

，

检测波长为335nm，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件模拟生成复方石淋通制剂指纹图谱。