CN116183751A - 岩黄连指纹图谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了中药岩黄连指纹图谱的检测方法，岩黄连指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1、中药岩黄连供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液注入液相色谱仪，记录标准品色谱图；步骤4，分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录样品色谱图。本发明所提供的中药岩黄连指纹图谱，能全面，客观地表征中药岩黄连的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及岩黄连指纹图谱的检测方法。
背景技术
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。通过中药指纹图谱的建立，能比较全面反映中药所含化学成分的种类与数量，尤其是现在对绝大多数中药的有效成分不明确的情况下，能更好的表明中药的内在质量，提高中药质量评价的技术水平和科技含量。
岩黄连，岩黄连为罂粟科植物石生黄堇Corydalis saxicola Bunting的干燥全草，具有清利湿热，止血止痛的功效，可用于治疗肝炎，口腔溃疡，牙龈肿痛，带下，腹泻，痢疾，痔疮出血，肿瘤等症。
现有技术中，关于岩黄连的质量研究报道很少，本发明在现有技术的基础上，本研究主要针对其主要成分的指纹图谱，可以更好的控制产品质量。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种岩黄连的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价岩黄连的质量，对控制岩黄连的质量和保证临床疗效具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明的第一个目的是提供一种岩黄连指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
步骤1、岩黄连供试品溶液的制备：
精密称取不同批次的岩黄连，加体积百分比为50％-100％的乙醇，超声，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；
作为超声处理的常规操作，在本发明的某个特殊的实施例中，步骤1的具体操作为：精密称取不同批次的岩黄连，置锥形瓶中，加50％-100％乙醇，称重，超声处理，冷却至室温，溶剂补足失重，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。
步骤2、混合标准品溶液的制备：
精密称定脱氢甲卡维汀、脱氢异阿朴卡维汀、脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱标准品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合标准品溶液；
步骤3、精密吸取步骤2的混合标准品溶液，注入高效液相色谱仪，记录混合标准品色谱图；
步骤4，分别精密吸取步骤1的各批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图；
步骤5，将步骤4中获得的供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次岩黄连供试品的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成岩黄连的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合标准品溶液色谱图的保留时间，标注岩黄连的对照指纹图谱中峰的化学成分，得到岩黄连的指纹图谱。
进一步的，步骤1中所述岩黄连经粉碎；所述乙醇体积百分比为50％-80％；所述超声时间不低于15min；所述岩黄连的质量M与乙醇的体积V的比例为M:V＝1g/(100-250)mL；优选的，所述岩黄连粉末过三号筛；优选的，超声时间为15-60min。
进一步的，步骤2混合标准品溶液的浓度为脱氢甲卡维汀100ug/ml、脱氢异阿朴卡维汀40ug/ml、脱氢卡维丁160ug/ml、盐酸巴马汀100ug/ml、盐酸小檗碱20ug/ml。
进一步的，步骤3、步骤4中，液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.01-0.05mol/L的磷酸二氢钾水溶液，B相为乙腈；
洗脱程序：采用体积分数30-95％A相，5-70％B相，梯度洗脱；
流速：0.8-1.2mL/min；
柱温：30-40℃；
进样体积：10-20μL；
检测波长：345±5nm。
进一步的，所述流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液(A)-乙腈(B)。
进一步的，所述洗脱程序为：
进一步的，所述流速为1ml/min，柱温为30℃，进样体积为10μL，检测波长为345nm。
本发明的第二个目的是提供采用前述的建立方法得到的岩黄连指纹图谱。
进一步的，所述岩黄连指纹图谱中共有峰17个，识别5个成分，其中脱氢甲卡维汀保留时间为33.925为10号峰；脱氢异阿朴卡维汀的保留时间为35.200min，为11号峰；脱氢卡维丁的保留时间为41.800min，为14号峰；盐酸巴马汀的保留时间为45.250min，为16号峰；盐酸小檗碱的保留时间为46.650min，为17号峰。
本发明的第三个目的是提供前述的岩黄连指纹图谱在中药岩黄连质量控制中的应用。
指纹图谱检测条件的优化：
1、在供试品制备方面优化方面
申请人采用水、甲醇、盐酸水、盐酸甲醇、不同比例的乙醇作为提取溶剂进行考察时，发现50％-100％乙醇为提取溶剂时，能够满足检测要求，尤其以50％-80％乙醇为提取溶剂时，岩黄连峰容量较多，响应值较高，故选择提取溶剂为50％-80％乙醇。
比较超声法、回流提取法提取方式，结果表明超声提取法峰面积较高。比较提取时间为15、30、45、60min，发现超声15min已提取完全。
2、在色谱条件进行优化方面
本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，对供试品溶液进行全波长扫描，结果在检测波长为345nm时，色谱信息较为丰富响应值普遍偏高，因此选择345nm为检测波长；
本发明对流动相甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-磷酸二氢钾水溶液进行考察，结果表明，以磷酸二氢钾水溶液-乙腈洗脱时，色谱峰分离度和峰形较好，故流动相确定为磷酸二氢钾水溶液-乙腈，且磷酸二氢钾水溶液浓度为0.01-0.05mol/L。
在优选出最佳的流动相组成后，由于岩黄连主要含有生物碱类成分，如黄连碱、小檗碱、甲基黄连碱、药根碱等。等度洗脱方式不能很好的实现各成分的良好分离，因此本发明继续筛选了梯度洗脱方式，筛选得到最佳的梯度洗脱方式为：
有益效果：
1、本发明根据岩黄连中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的岩黄连指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价中药岩黄连的质量，为保证临床中药岩黄连疗效具有重要意义。
2、用本发明所提供的方法所建立的岩黄连指纹图谱，能有效地表征中药岩黄连的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定中药岩黄连质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
3、本发明提供的岩黄连指纹图谱的检测方法，共有峰占全谱峰峰面积90％以上，识别峰峰面积占全谱峰峰面积60％以上，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为本发明的混合标准品的色谱图。
图2为本发明岩黄连样品的供试品对照指纹图谱。
图3为本发明16批岩黄连的指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例用到的仪器与试剂如下：
实验器材
1.1仪器
日本岛津公司双波长扫描高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统SIL-20A，紫外检测器SPD-20A和自动温控柱温箱CTD-20AC；RODI-220A1纯水机(锐思捷水纯化技术有限公司)；万分之一电子天平、百万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)(Mettler Toledo)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)：国家药典委员会。。
1.2药品与试剂
16个批次岩黄连样品(样品信息详见表1)，由南京农业大学收集，经南京农业大学郭巧生教授鉴定为为罂粟科植物石生黄堇Corydalis saxicola Bunting的干燥全草；标准品脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱购自中国食品药品检定研究所，脱氢甲卡维汀、脱氢异阿朴卡维汀为自制标准品。乙腈购自安徽天地高纯溶剂有限公司；磷酸二氢钾购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RODI-220A1超纯水。
表1岩黄连药材样品信息
实施例1一种岩黄连指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
步骤1、岩黄连供试品溶液的制备：
取上述16批次的岩黄连粉末(过三号筛)0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL 75％乙醇，称定重量，超声15min，取出，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
步骤2、混合标准品溶液的制备：
取脱氢甲卡维汀5mg，脱氢异阿朴卡维汀2mg，脱氢卡维丁8mg，盐酸巴马汀5mg，盐酸小檗碱1mg，精密称定，置于50ml容量瓶，甲醇溶解，超声，放冷，定容，制成浓度依次为100ug/ml、40ug/ml、160ug/ml、100ug/ml、20ug/ml的混合标准品溶液。
步骤3、精密吸取步骤2的混合标准品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图(图1)；
步骤4、精密吸取步骤1的16批岩黄连供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
液相色谱条件为：
色谱柱：Waters
CSHTM C18(250×4.6mm，5μm)；
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾(A)-乙腈(B)，
梯度洗脱；
流速：1ml/min；
检测波长：345nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL，
具体梯度见下表：
步骤5、将步骤4中获得的供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)；选择不同批次岩黄连供试品的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成岩黄连的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合标准品溶液色谱图的保留时间，标注岩黄连的对照指纹图谱中峰的化学成分，得到岩黄连的指纹图谱。结果岩黄连中有17个共有峰，岩黄连的对照指纹图谱见图2，16批指纹图谱见图3。根据标准品识别5个共有峰，其中脱氢甲卡维汀保留时间为33.925为10号峰；脱氢异阿朴卡维汀的保留时间为35.200min，为11号峰；脱氢卡维丁的保留时间为41.800min，为14号峰；盐酸巴马汀的保留时间为45.250min，为16号峰；盐酸小檗碱的保留时间为46.650min，为17号峰。
16批的岩黄连的相似度如下表：
实施例2指纹图谱检测方法的法学研究：
1、精密度研究
按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，平行进样6次，以14号峰(脱氢卡维丁)为S峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间，并计算RSD值，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”进行指纹图谱比对及数据分析，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.05％，相对峰面积的RSD均小于0.58％，相似度大于0.98，结果表明该设备的平行进样精密度良好。
2、稳定性研究
按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，采用0h、2h、4h、8h、10h、12h、24h不同时间进样分析，以14号峰(脱氢卡维丁)为S峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”进行指纹图谱比对及数据分析，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.06％，相对峰面积的RSD均小于0.81％，相似度大于0.99，表明岩黄连供试品溶液在24h之内的色谱峰几乎没有变化，稳定性非常好。
3、重复性研究
平行精密称取编号为S1样品六份，按照实施例1的方法制成6份同样的供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，平行进样6次，以14号峰(脱氢卡维丁)为S峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”进行指纹图谱比对及数据分析，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.05％，相对峰面积的RSD均小于2.78％，相似度大于0.99，结果表明样品色谱峰重现性好，该方法的重复性良好。
以上实验结果表明，本发明提供的岩黄连指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价中药岩黄连的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种岩黄连指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、岩黄连供试品溶液的制备：
精密称取不同批次的岩黄连，加体积百分比为50％-100％的乙醇，超声，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；
步骤2、混合标准品溶液的制备：
精密称定脱氢甲卡维汀、脱氢异阿朴卡维汀、脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱标准品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合标准品溶液；
步骤3、精密吸取步骤2的混合标准品溶液，注入高效液相色谱仪，记录混合标准品色谱图；
步骤4，分别精密吸取步骤1的各批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录供试品色谱图；
步骤5，将步骤4中获得的供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次岩黄连供试品的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成岩黄连的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合标准品溶液色谱图的保留时间，标注岩黄连的对照指纹图谱中峰的化学成分，得到岩黄连的指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的岩黄连指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1中所述岩黄连经粉碎；所述乙醇体积百分比为50％-80％；所述超声时间不低于15min；所述岩黄连的质量M与乙醇的体积V的比例为M:V＝1g/(100-250)mL；优选的，所述岩黄连粉末过三号筛；优选的，超声时间为15-60min。
3.根据权利要求1所述的岩黄连指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2混合标准品溶液的浓度为脱氢甲卡维汀100ug/ml、脱氢异阿朴卡维汀40ug/ml、脱氢卡维丁160ug/ml、盐酸巴马汀100ug/ml、盐酸小檗碱20ug/ml。
4.根据权利要求1所述的岩黄连指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3、步骤4中，液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.01-0.05mol/L的磷酸二氢钾水溶液，B相为乙腈；
洗脱程序：采用体积分数30-95％A相，5-70％B相，梯度洗脱；
流速：0.8-1.2mL/min；
柱温：30-40℃；
进样体积：10-20μL；
检测波长：345±5nm。
5.根据权利要求4所述的岩黄连指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液(A)-乙腈(B)。
6.根据权利要求4所述的岩黄连指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述洗脱程序为：
7.根据权利要求4所述的岩黄连指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述流速为1ml/min，柱温为30℃，进样体积为10μL，检测波长为345nm。
8.采用权利要求1所述的建立方法得到的岩黄连指纹图谱。
9.根据权利要求8所述的岩黄连指纹图谱，其特征在于，所述岩黄连指纹图谱中共有峰17个，识别5个成分，其中脱氢甲卡维汀保留时间为33.925为10号峰；脱氢异阿朴卡维汀的保留时间为35.200min，为11号峰；脱氢卡维丁的保留时间为41.800min，为14号峰；盐酸巴马汀的保留时间为45.250min，为16号峰；盐酸小檗碱的保留时间为46.650min，为17号峰。
10.权利要求8所述的岩黄连指纹图谱在中药岩黄连质量控制中的应用。
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